Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

L’objectif global de cette méthode est de déterminer le potentiel inhibiteur de HDAC des composés et d’identifier la sélectivité envers HDAC6 ou HDAC1 dans les cellules à l’aide d’un seul test de spectrométrie de masse par chromatographie liquide à ultra haute performance. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments, telles que déterminer si un inhibiteur de HDAC est sélectif pour HDAC6 par rapport aux HDAC de classe I dans les cellules vivantes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle nécessite une seule étape d’incubation avec des cellules, des inhibiteurs et des substrats sélectifs afin de déterminer l’activité contre deux isoformes HDAC simultanément.

L’implication de cette technique s’étend à la découverte précoce d’inhibiteurs sélectifs de HDAC, car elle détecte si la sélectivité de HDAC6 est maintenue dans les cellules vivantes, évitant ainsi les tests d’acétylation des protéines endogènes. Bien que cette méthode évalue la sélectivité des inhibiteurs de HDAC dans les cellules HeLa, elle peut également être appliquée à d’autres lignées cellulaires telles que les cellules primaires et d’autres cellules tumorales, y compris les échantillons cliniques. Culture de cellules HeLa à 80 % de confluence dans un flacon de culture cellulaire T75 dans un milieu essentiel minimal complété par 10 % de sérum bovin fœtal, de la pénicilline G et de la streptomycine.

Lavez les cellules deux fois avec cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Ensuite, aspirez le tampon et ajoutez un millilitre de réactif de dissociation cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour détacher les cellules.

Après cinq minutes, ajoutez neuf millilitres de milieu de culture MEM aux cellules et remettez complètement la suspension cellulaire. Transférez les cellules dans un nouveau tube de 15 millilitres, puis comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez la densité de la suspension des cellules à 60 000 cellules par millilitre en MEM.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de suspension cellulaire dans les puits de contrôle et d’essai d’une plaque stérile, à fond plat, traitée par culture tissulaire à 96 puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture MEM dans les puits vierges de la plaque à 96 puits. Incuber la plaque à 96 puits à 37 degrés Celsius pendant 24 heures.

Aspirer le milieu des puits de la plaque à 96 puits. Lors de l’aspiration du milieu, évitez de détacher et de retirer les cellules du puits. Cela peut être réalisé en utilisant un faible taux d’aspiration et en plaçant soigneusement les pointes d’aspiration dans le coin inférieur de la surface du puits.

Ensuite, ajoutez 25 microlitres des deux composés testés en MEM dans les puits d’essai, y compris la trichostatine A, le MS275 et la tubastatine A. Ajoutez 25 microlitres de MEM aux puits de contrôle et de blanc. Ensuite, ajoutez 25 microlitres du mélange de substrat dans les puits de contrôle et d’essai. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de MEM dans les puits vierges.

Incuber la plaque à 96 puits à 37 degrés Celsius pendant huit heures dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Pour effectuer la lyse cellulaire, ajoutez d’abord 10 microlitres de tampon six fois RIPA complété par un inhibiteur de protéase dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Arrêtez la réaction en ajoutant 160 microlitres d’acétonitrile froid dans chaque puits et mélangez en pipetant de haut en bas.

Placez l’assiette dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant 10 minutes. Sortez la plaque du congélateur et transférez 220 microlitres du contenu de chaque puits dans une plaque non stérile à fond conique à 96 puits. Centrifugez la plaque à 5 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Après la centrifugation, transvaser 200 microlitres de surnageant dans une plaque à 96 puits compatible avec le système UHPLC. Ensuite, scellez la plaque avec une feuille de thermoscellage pelable à l’aide d’une scelleuse de plaques. Préparez le système de spectrométrie de masse par chromatographie liquide à ultra haute performance en le remplissant avec le système de phase mobile.

Placez la plaque à 96 puits dans un gestionnaire d’échantillons contenant un porte-plaque. Exécutez les échantillons en fonction des conditions UHPLC ESI MS/MS trouvées dans le texte. Pour effectuer l’analyse des données, intégrez la surface du pic de chaque substrat et de son produit désacétylé avec le logiciel d’intégration UHPLC approprié.

Pour chaque substrat, calculez le rapport de surface de pic entre désacétylé et acétylé dans chaque chromatogramme. Incluez les échantillons de test et de contrôle. Enfin, calculez le pourcentage d’inhibition HDAC de chaque échantillon de test selon l’équation du protocole de texte.

Le chromatogramme UHPLC-MS d’un échantillon est présenté ici. Les pics correspondant aux substrats ajoutés aux cellules sont détectés en fonction de leurs transitions de masse comme décrit dans le tableau un du protocole écrit. Le MOCPAC est désacétylé par HDAC1 pour fournir le pic de MOCPAC désacétylé.

De même, le BATCP est désacétylé par HDAC6 pour fournir le pic de BATCP désacétylé. Enfin, le MAL fournit le pic de MAL désacétylé qui reflète la désacétylation de plusieurs HDAC endogènes de manière non spécifique. Sur la photo, la figure avec le chromatogramme obtenu avec différentes concentrations de l’inhibiteur de l’HDAC Trichostatine A.Une évaluation dose-réponse des inhibiteurs standard de l’HDAC a été effectuée.

Les valeurs intégrées obtenues à partir de MOCPAC et dMOCPAC ont été utilisées pour calculer l’activité des inhibiteurs standard contre HDAC1. À la suite des calculs de l’IC 50, MS275, un inhibiteur sélectif de l’HDAC de classe I, a montré des valeurs IC 50 plus faibles pour l’HDAC1 que la tubostatine A, un inhibiteur connu de l’HDAC6. D’autre part, les valeurs isolées de BATCP et dBATCP ont été utilisées pour calculer l’activité des étalons par rapport à HDAC6.

Cette fois, la tubastatine A a fourni une valeur IC 50 inférieure à celle du MS275, confirmant leur profil de sélectivité isoforme. La trichostatine A est un inhibiteur puissant et non sélectif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 72 heures si elle est correctement exécutée incluant le temps de traitement cellulaire et l’analyse de la plaque de 96 puits.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les temps d’incubation indiqués ici sont pour les cellules HeLa. Si une autre lignée cellulaire est utilisée, celle-ci doit être optimisée. À la suite de cette procédure, l’activité inhibitrice sélective de l’HDAC d’autres isoformes a pu être mesurée tant qu’il existe des substrats spécifiques.

N’oubliez pas que travailler avec des solvants organiques et d’autres produits chimiques peut être extrêmement dangereux et que des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire doivent toujours être portés lors de cette procédure.