Name: Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Découvrez les techniques d'immunofluorescence et d'immunoprécipitation pour étudier les interactions protéine-protéine dans la régulation de l'autophagie chez les mammifères. Ces méthodes permettent d'identifier de nouveaux composants des voies de signalisation cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la recherche scientifique et technologique Conseil de Turquie (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l’Université Sabanci. SEB et NMK sont pris en charge par une bourse TUBITAK BIDEB 2211 pour des études de doctorat.

1. immunofluorescence <ol><li>maintenir HEK293T rein embryonnaire humain cellules dans un milieu DMEM hyperglycémie et cellules de neuroblastes N2A souris en DMEM basse moyenne de glucose, dans un 5 % CO 2-humidifié incubateur à 37 ° C. Compléter les milieux de culture avec du sérum 10 % inactivés par la chaleur de foetus bovins (FBS), antibiotiques (50 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine) et L-glutamine (2 mM).</li>
	<li>Détacher les cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine. Tout d’abord, retirez le support de la culture cellulaire puis laver les cellules avec 10 mL stérile phosphate salin (PBS) et incuber 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. désactiver la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu de DMEM.</li>
	<li>Laver la plaque bien en pipettant également. Enlever 10 µL de solution de cellule et mélangez-le avec 10 µL de bleu trypan. Compter le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Les deux HEK293T et N2A est des lignées de cellules adhérentes, cependant, les cellules HEK293T se détachent de la plaque facilement. Par conséquent, si vous travaillez avec une lignée de cellules HEK293T, manteau la coverslides avec stérile filtrée 0,01 % poly-L-lysine avant d’ensemencer les cellules.
	<ol><li>Lieu coverslides stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm. Ajouter la quantité appropriée de la solution de la poly-L-lysine sur chaque coverslide. Incuber le coverslides avec la solution de la poly-L-lysine pour 10 min.</li>
		<li>Supprimer la solution de la poly-L-lysine. 
		Remarque : La Poly-L-lysine est réutilisable ; Il est facultatif de recueillir et de la réutiliser pour d’autres expériences. La poly-L-lysine étant toxique, attendez jusqu'à ce que toute la solution sur la coverslides s’évapore complètement et ensuite récupérer la poly-L-lysine.</li>
		<li>Laver les coverslides avec du PBS stérile.</li>
	</ol></li> <li>Ajouter 1 mL DMEM dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Placer un coverslide dans chaque puits.</li>
	<li>Graine 20 000 cellules/puits, goutte à goutte et en agitant la plaque en même temps pour une répartition homogène des cellules sur la coverslides. Garder les cellules dans le CO 2 incubateur à 37 ° C et ajouter le médicament afin que le temps d’incubation totale ne dépasse pas 48 h, c'est-à-dire pendant 3 h traitement de Torin, ajouter le médicament au 45 h post semis.
	Études sur les interactions <ol><li>pour racks 1-LC3, Torin 1, la rapamycine et la famine ont été utilisés comme inducteurs de l’autophagie. Les cellules sont incubées avec Torin 1 pendant 3 h (concentration finale 250 nM) ; avec la rapamycine pendant 16 h (concentration finale 200 nM) ; et avec Earle &#39; s Balanced Salt Solution (EBSS) pendant 2 h afin d’affamer les cellules. 
		Remarque : L’Incubation en DMEM avec 10 % de BF a été utilisé comme la condition de contrôle.</li>
	</ol></li> <li>Après 48 h de temps d’incubation totale, retirez le support sur les coverslides et les laver avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Pour fixer les cellules, incuber les cellules avec 1 mL glace froide stérile filtrée 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x (pH 7,4), pendant 20 min à température ambiante sans aucune agitation. 
	PFA étant sensible à la lumière, garder (important) la plaque dans l’obscurité pendant la période d’incubation ; peut aider à couvrir la plaque avec du papier aluminium. Par ailleurs, l’IFP est toxique, donc, travailler sous une hotte de laboratoire tout en fixant les cellules. 
	Remarque : Gardez à l’esprit que la fixation étape dans des expériences d’immunofluorescence doit être optimisé, que des anticorps spécifiques peuvent fonctionner mieux, à l’aide de fixation différents agents ou conditions de.</li>
	<li>Après 20 min d’incubation de la PFA, enlevez d’abord la solution PFA sur le coverslides et laver ensuite chaque échantillon 3 fois avec du PBS filtré stérile 1 mL. À cette étape, (importante) laver les puits un manière à ne pas laisser sécher. Éviter le séchage puisqu’elle va interférer avec des réactions subséquentes des cellules, changer la morphologie cellulaire et augmenter les signaux non spécifique.</li>
	<li>Une fois le lavage terminé, conserver les échantillons dans 1 mL de PBS sur la glace.</li>
	<li>Préparer la solution de blocage : PBS avec 0,1 % Bovine Serum Albumin (BSA) et 0,1 % de saponine.</li>
	<li>Couvrir une plaque 6 puits avec film de paraffine. Assurez-vous que le fond de la boîte est lisse après la pelliculeuse de paraffine. L’étiquette de la plaque 6 puits.</li>
	<li>à l’aide de pinces à épiler, transfert le coverslides sur les plaques de 12 puits aux plaques 6 puits recouverts de film de paraffine.</li>
	<li>Jeter le PBS sur coverslides et ajouter 100 µL de solution sur chaque coverslide pour perméabilisation de blocage. Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Préparer l’anticorps primaire en bloquant la solution. Avant les expériences, optimiser les dilutions d’anticorps pour définir les meilleures concentrations de travail pour souiller. 
	NOTE : par exemple, LC3 anticorps sert à une dilution au 1/100 en bloquant la solution.</li>
	<li>Après l’incubation de 30 min, jeter la solution de blocage et laver une fois les échantillons doucement avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de solution d’anticorps primaire à chaque coverslide. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h, sur un agitateur. 
	NOTE : Les temps d’Incubation avec l’anticorps primaire doit être optimisé. Selon l’anticorps, une incubation durant la nuit à 4 ° C peut être préférable. Il est préférable de les incuber dans un shaker, verser doucement (100 rotations par minute) de distribuer également l’anticorps sur la coverslides.</li>
	<li>Après incubation avec l’anticorps primaire, laver les échantillons individuellement, 3 fois avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Prepare anticorps secondaire au 1/500 en bloquant la solution (optimisations des dilutions de l’anticorps secondaire peuvent être nécessaires). Ici, le anti-lapin IgG Alexa Fluor 568 a été utilisé comme un anticorps de anti-lapin secondaire.
	<ol><li>Incuber les échantillons avec les 100 µL de solution d’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur. Puisque les anticorps secondaires marqué fluorophore sont sensibles à la lumière, (important) conserver la solution dans l’obscurité. Placer les échantillons dans l’obscurité pendant et après l’incubation de l’anticorps secondaire.</li>
	</ol></li> <li>Après l’incubation de l’anticorps secondaire, laver la plaque 3 fois avec du PBS. 
	NOTE : Baed sur l’expérience, certains anticorps ont des signaux de fond élevé qui ne peuvent pas être éliminées par le PBS se lave. Si vous traitez avec un tel anticorps, après l’étape 1.21, conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C pendant 6 h peut aider.
	<ol><li>Le cas échéant, détachant les cellules avec un colorant de liaison à l’ADN, comme Hoechst, pour marquer les noyaux.</li>
	</ol></li> <li>Pour souiller plus d’une protéine, appliquez la même procédure à partir de l’étape 1.16 pour la deuxième protéine.
	<ol><li>S’assurer qu’il n’y a aucune réactivité des espèces entre les anticorps lorsque vous effectuez une coloration avec plus d’un anticorps (p. ex., utilisation des anticorps de souris et lapin). 
		Remarque : Ici, racks 1 est taché comme la deuxième protéine à l’aide d’anti-racks 1 anticorps primaires et anticorps secondaires de anti-souris IgG Alexa Fluor 488 en utilisant les mêmes concentrations mentionnées ci-dessus.</li>
	</ol></li> <li>Préparez la solution de montage : 50 % glycérol dans du PBS 1 x. Filtrer sur un filtre 22 µm.</li>
	<li>Essuyer les lames avec de l’éthanol à l’aide d’un chiffon non pelucheux et ajouter 10 µL de solution de montage à chaque diapositive. À l’aide d’une pince, placer le coverslides sur chaque dropso que le côté avec les cellules est en contact direct avec le milieu de montage. Jeter la solution de montage excès délicatement à l’aide de chiffons pelucheux.</li>
	<li>Joint le coverslides avec un vernis à ongles transparent. Tout d’abord, stabiliser le coverslides en ajoutant des gouttes de vernis à ongles sur les 4 bords et puis les sceller complètement.</li>
	<li>Analyse des échantillons sous un microscope à fluorescent ou confocal dès que possible, étant donné que le signal fluorescent peut blanchir après quelques heures.</li>
</ol> < classe p = « jove_title "&gt; 2. Immunoprécipitation <ol><li>détacher et comptage des cellules comme décrit aux points 1.2 et 1.3.</li>
	<li>Si vous travaillez avec des cellules HEK293T, graines 4 millions de cellules pour chaque condition en Pétri de 15 cm. Si vous travaillez avec des cellules N2A, graines 5 millions de cellules en Pétri de 15 cm. Incuber les cellules dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C jusqu'à la fin de l’expérience.</li>
	<li>Traiter les cellules avec les drogues ou les conditions pour une durée définie pour que le temps d’incubation totale des cellules ne dépasse pas 48 h. 
	Remarque : Pour les essais d’immunoprécipitation dans cette étude, les cellules ont été traitées pendant 3 h avec 1 Torin (250 nM), 16 h avec la rapamycine (200 nM) et 2 h avec EBSS. DMEM avec 10 % de BF a été ajouté aux cellules comme contrôle.</li>
	<li>Après 48 h de temps d’incubation totale, retirez le support et récolter les cellules. Puisque les cellules HEK293T se détachement facilement de la plaque, laver la plaque de glace PBS froid peut être suffisante pour la récolte. Cependant, les cellules N2A résistent mieux au détachement ; utiliser des grattoirs à cellules afin de récolter les cellules.
	<ol><li>Recueillir toutes les cellules dans des tubes de microcentrifuge.</li>
	</ol></li> <li>Échantillons de centrifugeuse à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. jeter le surnageant et laver le culot avec 1 mL de PBS en la re-suspendant par pipetage.</li>
	<li>Répéter l’étape de la centrifugeuse, mais à la vitesse maximale de centrifuger à 4 ° C pendant 15 min. éliminer le surnageant.</li>
	<li>Tampon de dosage Immuno-précipitation de Radio préparer (RIPA) avant de commencer l’expérience. 
	Remarque : Il existe 3 types de tampon RIPA ; choisir en fonction de l’intensité de l’interaction des protéines étudiées (voir formules ci-dessous).
	<ol><li>S’il y a une interaction protéine-protéine solide, choisissez le tampon RIPA régulière.</li>
		<li>Si l’interaction est faible, choisir RIPA doux ou doux RIPA. 
		Remarque : Les recettes de ces tampons sont dans les étapes suivantes. Tous les tampons qui sont utilisées pour l’immunoprécipitation épreuves devraient être complétés par des inhibiteurs de protéase.
		<ol><li>Préparer régulièrement tampon RIPA en utilisant 1 % NP-40, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium 0,5 % et 0,1 % sodium dodécyl sulfate dans 50 mM Tris pH 8.</li>
			<li>Préparer doux RIPA tampon à l’aide de désoxycholate de sodium NP-40, NaCl 150 mM et 0,25 % de 1 % en 50 mM Tris pH 7.5.</li>
			<li>Préparer le tampon RIPA plus doux en utilisant 1 % Triton X 100, 137 mM NaCl, 1 % de glycérol et orthovanadate de sodium 1 mM à 50 mM Tris pH 7.4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Après avoir choisi le tampon approprié de RIPA, compléter la mémoire tampon avec les inhibiteurs de la protéase (RIPA +). Puis, lyser les cellules avec 3 x le volume du culot cellulaire dans RIPA +.</li>
	<li>Vortex la suspension pendant 15 s. garder sur glace pour 5 min. Répétez vortex et glaçage 5 fois et puis centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un tube propre microcentrifuge et la centrifugeuse pour retirer les débris cellulaires vestige. Transférer le surnageant dans un tube propre.</li>
	<li>Diluer la protéine lysats 01:50 et prépare une plaque à 96 puits avec blank et normes. Diluer les échantillons.
	<ol><li>Échantillons de Mix avec Bradford solution 01:20. Incuber pendant 15 min dans le noir.</li>
		<li>Mesurer la densité optique à une longueur d’onde de 595 nm. Calculer la concentration de la protéine à l’aide de valeurs d’absorbance pour chaque échantillon.</li>
	</ol></li> <li>Le jour avant la récolte des cellules, couple perles A Plus de protéine avec des anticorps spécifiques à la protéine d’intérêt.
	<ol><li>Couper le bord d’une pointe 200 µL à l’aide de ciseaux et utiliser 25 µL dans la boue de perle pour chaque condition.</li>
		<li>Laver les billes une fois avec 1 mL de PBS, une fois avec 1 mL de tampon de RIPA et une avec 1 mL RIPA +. Effectuer les étapes de lavage à 3 300 x g, 4 ° C pendant 1 min.</li>
		<li>Après le dernier lavage, ajouter 300 µL de RIPA + sur les perles et ajoutez 1,5 µg l’anticorps spécifique à la protéine d’être tiré vers le bas.</li>
		<li>Incuber les tubes pendant la nuit à 4 ° C sur un rotateur (20 rotations/minute). 
		Remarque : Ici, ATG5 a été immunoprécipitée en utilisant des anticorps spécifiques anti-ATG5.</li>
	</ol></li> <li>Après l’incubation d’une nuit ou plus de perles avec l’anticorps, laver les billes une fois avec du PBS, une fois avec RIPA et une avec RIPA + tel que décrit à l’étape 2.12.2.</li>
	<li>Ajouter 2 mg de protéine lysat sur les perles pour chaque condition et compléter le volume total à 300 µL avec RIPA + tampon/tube. Incuber les tubes pendant la nuit sur un rotateur à 4 ° C.</li>
	<li>Après l’incubation, laver les perles comme décrits précédemment (étape 2.12.2).
	<ol><li>Après le dernier lavage, utiliser un plus petit embout de la pipette pour retirer tout le liquide surnageant sans toucher les billes de.</li>
		<li>Ajouter 10 µL de 3 x colorant de chargement : 6 % SDS, 30 % de glycérol, 16 % de β-mercaptoéthanol et bleu de bromophénol 0,1 % à 1M Tris-HCl pH 6.8.</li>
	</ol></li> <li>Préparer les contrôles d’entrée à l’aide de protéines au moins 100 µg lysat pour chaque condition. Égaliser le volume des échantillons à l’aide de l’eau et ajouter le volume approprié de 3 x chargement colorant.</li>
	<li>Échantillons de bouillir à 95 ° C pendant 10 min. 
	Remarque : Généralement en bouillant les échantillons, les bouchons des tubes peuvent ouvrir spontanément et échantillons sont perdus. Éviter cela en maintenant les chapeaux fermés avec un bloqueur spécifique cap.</li>
	<li>Spin les échantillons et les charge sur gel SDS-PAGE pour séparer les protéines selon leurs tailles à l’aide de protocoles standard. 
	Remarque : Dans cette étude sur racks 1 et ATG5, échantillons ont été exécutés par l’intermédiaire de 12 % des gels de polyacrylamide à 80 V pendant 30 min, puis à 120 V pour environ 90 min. Toutefois, pour les protéines plus petites telles que LC3, à l’aide de gels de polyacrylamide de 15 % est plus approprié.</li>
	<li>Après que le gel en cours d’exécution est terminé, transférer les protéines à la nitrocellulose ou membranes PVDF à l’aide de deux méthodes de transfert humide ou semi-humide. Ensuite, bloquer les membranes par incubation dans le lait écrémé de 5 % dans du PBS avec 0,05 % Tween 20 (PBST) à température ambiante pour les membranes de lavage 1 h. 3 fois avec PBST pendant 5 min.</li>
	<li>Incuber les membranes avec des anticorps primaires à des concentrations de travail pendant 1 h à température ambiante. Pour les dilutions de l’anticorps primaire, utilisez BSA contenant des solutions de rouges (5 % BSA Cohn V Fraction, 0,02 % d’azide de sodium dans du PBST, pH 7,5 ; Ajouter rouge de phénol ajouté comme un marqueur de pH) pour permettre la réutilisation des anticorps. 
	NOTE : par exemple, diluer ATG5 anticorps x 2 000 dans la solution rouge.
	<ol><li>à la fin de la période d’incubation, laver les membranes 3 fois avec PBST.</li>
	</ol></li> <li>Incuber les membranes avec HRP-conjugués Anticorps secondaires qui ont été préparés dans une solution de lait écrémé 5 % (ici, le anti-lapin IgG à 1:10.000 a été utilisé). Puis laver les membranes 3 x avec PBST pendant 5 min.</li>
	<li>Faire la solution ECL : 25 mM luminol, l’acide coumarique 9 mM, 3 x 10 -4 % H 2 O 2 à 70 millimètres Tris-HCl pH 8,8. Utilisez des fraîches H 2 O 2 pour chaque expérience. 
	Remarque : La réaction démarre après H 2 O 2 addition et il se poursuit pendant environ 20 min.
	<ol><li>Incuber les membranes et x-ray des films pendant 20 min en Dec. Développer et fixez-les dans une pièce sombre.</li>
	</ol></li> <li>Pour vérifier le co-immunoprécipitation des protéines avec close ou chevauchement des poids moléculaires, il peut être nécessaire dépouiller les anticorps hors les membranes en incubant les membranes à 60 ° C pendant 30 min dans le tampon de décapage : (pH 25 mM Tris-HCl 2 et 1 % SDS).</li>
	<li>Répéter les étapes 2.20 à 2.23 pour vérifier les co-immunoprécipitation utilisant des anticorps différents. Par exemple, suite à détection ATG5 et décapage des membranes, racks 1 protéine a été testé sur les membranes mêmes en utilisant un anticorps primaire anti-racks 1 (1:1, 000) et des anticorps secondaires (01:10, 000). Β-actine est utilisée comme contrôle chargement ; et signal IgG a été utilisé sous le contrôle de chargement pour les échantillons d’immunoprécipitée.</li>
</ol>

<ol><li>Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+pathological+significance+of+the+molecular+cross-talk+between+autophagy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis.</a> Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).</li>
<li>Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIR376A+is+a+regulator+of+starvation-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy.</a> PLoS One. 8, e82556(2013).</li>
<li>Itah, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+cavitation+kills+prostate+cells+and+ablates+benign+prostatic+hyperplasia+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue.</a> Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).</li>
<li>Gozuacik, D., Kimchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+cell+death+and+tumor+suppressor+mechanism%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism).</a> Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).</li>
<li>Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+IBMPFD-related+P97%2FVCP+mutation+with+differential+binding+pattern+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).</li>
<li>Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-related+gene%2C+TdAtg8%2C+in+wild+emmer+wheat+plays+a+role+in+drought+and+osmotic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response.</a> Planta. 236, 1081-1092 (2012).</li>
<li>Longatti, A., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+trafficking+and+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Vesicular trafficking and autophagosome formation.</a> Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).</li>
<li>Erbil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RACK1+Is+an+Interaction+Partner+of+ATG5+and+a+Novel+Regulator+of+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy.</a> J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).</li>
<li>Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+use+of+nanoparticles+as+nucleic+acid+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers.</a> J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).</li>
<li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Techniques d’immunoprécipitation et immunofluorescence sont essentiels pour l’étude des interactions protéine-protéine. Bien que ces deux techniques sont couramment utilisés et bien établie, plusieurs critères devraient être considérés pour définir la qualité des expériences tout en utilisant ces techniques.
Tout d’abord, primaires des anticorps qui sont utilisées pour ces épreuves doivent être spécifiques aux protéines d’intérêt. Pour ce faire, utilisez shARN passes rabattues ou cellules knoc...

Macroautophagy (autophagie, ci-après) est un mécanisme de stress cellulaire qui se caractérise par la séquestration du cytoplasme en vrac, les protéines et les organelles dans les vésicules de membrane double appelés autophagiques vésicules. Par fusion de la couche externe de la membrane double, vésicules autophagiques et leurs cargaisons sont envoyées vers les lysosomes et dégradent y1. Autophagie se produit à faible taux de base dans tous les types de cellules et dans tous les organismes exerçant des fonctions homéostatiques tels que la dégradation des protéines et organelle (p. ex., mitochondries) chiffre d’affaires. Dans des conditions menant à des stress cellulaire, comme la famine, autophagie est rapidement augmentée et permet à la cellule de maintenir des niveaux d’énergie et le métabolisme de base1,2,3.
Environ 30 autophagie gènes ont été clonés à partir de la levure et de leurs produits protéiques ont été montrés à jouer un rôle dans les différentes étapes du processus autophagique, y compris la nucléation de la vésicule, l’expansion, la fusion des vésicules de l’endosome tardif/lysosome et la dégradation de la cargaison 4 , 5. orthologues de la majorité de ces gènes ont été identifiés et études dans divers organismes ont confirmé la préservation de leurs fonctions cellulaires6. Études dans la dernière décennie a montré que plusieurs autophagie liés complexes protéiques et interactions protéine-protéine existent et qu’elles régissent les voies autophagie de manière complexe et contrôlée. Intersections, sauvegardes, vos commentaires et feedforward mécanismes existent, et ils permettent à la cellule de coordonner l’autophagie avec d’autres événements connexes (tels que la sécrétion vésiculaire, biogenèse lysosome, endosomale tri et transport7, etc.) Dans un écran impartiale levure-double hybride utilisant la protéine de l’autophagie ATG5 comme un appât, (ATG5 est une protéine de l’autophagie clés impliquées dans le système de conjugaison E2-like qui médie LC3 lipidation en famine induite par autophagie), nous avons identifié le récepteur activé C-Kinase 1 (racks 1 ; GNB2L1) comme un interacteur forte et une composante d’autophagie roman8. Ce qui est important, l’écran a montré que l’interaction ATG5-racks 1 était indispensable pour l’induction d’autophagie par inducteurs autophagie classique (c'est-à-dire, la famine et le mTOR inhibition).
Méthodes axées sur l’immunofluorescence sont utilisées pour surveiller les interactions protéine-protéine. Ces techniques sont principalement axés sur les anticorps et aident à visualiser les interactions et de confirmer la localisation cellulaire. Dans cette technique, fluorescentes tag conjugués anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt sont généralement utilisés pour la coloration spécifique. Chaque protéine peut-être être étiqueté avec des anticorps couplés à des fluorochromes différents. À l’aide d’anticorps spécifiques de la protéine, une superposition du signal lorsque des images sont fusionnés indique la co-localisation des protéines sous microscopie confocale. Cette technique est applicable à des cellules ou tissus même. Techniques d’immunofluorescence fournissent des indices sur la dynamique de l’interaction et aident à identifier la taille et la distribution des complexes de protéines, tout en poursuivant l’évolution générale de la morphologie cellulaire sous différentes conditions9. L’immunoprécipitation est une autre technique souvent utilisée axée sur les anticorps qui permet l’analyse des interactions entre données protéines10. En utilisant cette technique, les protéines d’intérêt sont isolés des cellules ou tissus extraits à l’aide d’anticorps spécifiques, ce qui entraîne la précipitation des protéines qui sont dans un complexe ou en contact avec une protéine d’intérêt. Co-Immunoprécipitation, où la protéine et son co interacteur sont détectés, révèle non seulement l’interaction entre deux protéines, mais permet de mesurer sa force d’interaction sous différentes circonstances11.
Ce protocole décrit dans les techniques de clés de détail qui ont servi à confirmer et à caractériser les interactions ATG5-racks 1 et racks 1-LC3. L’accent est mis sur les techniques d’immunofluorescence et immunoprécipitation, avec l’accent des étapes critiques et des pièges pour la recherche de l’autophagie, mais aussi suggestions de dépannage.

<table><tbody><tr><td>Trypsine EDTA Solution A</td><td>Biological Industries&nbsp ;</td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE Healthcare</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (glycémie élevée)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (faible teneur en glucose)</td><td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>coverslides</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>slides</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Biological Industries&nbsp ;</td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; A4503</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Anticorps</td><td>Sigma</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Lapin IgG Alexa Fluor 568</td><td>&nbsp ; Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 Anticorps</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&nbsp ; sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris IgG Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp ; Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate</td><td>de sodium Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (SDS)</td><td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate sodique</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 Anticorps</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoéthanol&nbsp ;</td><td>Applichem</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Applichem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé</td><td>Applichem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-lapin, HRP conjuguée</td><td>Jackson Immuno.&nbsp ;</td><td></td><td></td>1110305144</tr><tr><td>Luminol</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Acide coumérique</td><td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>anti souris IgG, HRP conjugué</td><td>Jackson Immuno.</td><td>Anticorps anti-actine 115035003</td><td></td></tr><tr><td>&bêta ;-</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de lapin normal</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; R0395</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A-Agarose Perles</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine solution</td><td>Biological Industries&nbsp ;</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp ;</td><td>Industries biologiques&nbsp ;</td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Solution</td><td>Sigma</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>Membrane en nitocellulose</td><td>GE Healthcare</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>Films à rayons X Fujifilm</td><td></td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

Étude des interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Interactions protéines-protéines sont importantes pour les cascades de signalisation cellulaire compréhension et identification des composants de voie nouvelle et dynamique des protéines. La majorité des activités cellulaires nécessite des interactions physiques entre les protéines. Pour analyser et cartographier ces interactions, les différentes techniques expérimentales ainsi que des outils bioinformatiques ont été développés. Autophagie est un téléphone cellulaire, mécanisme qui permet aux cellules faire face aux différents stress, y compris l’hypoxie, produits chimiques et la privation nutritive de recyclage. Afin de mieux comprendre les événements de signalisation liés à autophagie et de découvrir de nouveaux facteurs régulateurs complexes protéiques dans autophagie, nous avons réalisé des écrans d’interaction protéine-protéine. Validation de ces résultats de dépistage nécessite l’utilisation de l’immunofluorescence et techniques de l’immunoprécipitation. Dans ce système, les interactions protéine-protéine autophagie spécifique que nous avons découvert ont été testées en Neuro2A (N2A) et des lignées de cellules HEK293T. Détails des procédures techniques utilisées sont expliquées dans le présent document expérience visualisées.

Dans la Figure 1 un exemple d’une co-localisation résultat obtenu à l’aide de ce protocole est montré. Une figure de notre récent livre, figure8. Ici, protéine endogène de racks 1 a été coloré en vert, tandis que LC3 endogène a été teinté en rouge. Les points jaunes qui sont observées dans les images fusionnées indiquent les sites de chevauchement entre les signaux rouges et verts. Les points jaunes représentent ainsi la co-localisation partielle de ces deux protéines...

Présentées ici sont deux techniques de recherche d’interaction protéine-protéine de base d’anticorps : immunofluorescence et immunoprécipitation. Ces techniques ne conviennent pas pour l’étude des interactions physiques entre les protéines pour la découverte de nouvelles composantes des voies de signalisation cellulaires et pour comprendre la dynamique de protéine.

Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Je m'appelle Devrim Gozuacik. Nous travaillons à l'Université Sabanci à Istanbul, en Turquie, sur la régulation de l'autophagie chez les mammifères. Nous nous concentrons sur différentes protéines, voies et ARN régulant l'autophagie.Il existe plusieurs techniques pour étudier l'autophagie. Nous utilisons des techniques de biologie moléculaire, de biochimie et de biologie cellulaire afin d'analyser les différentes voies que nous découvrons. Nous avons recours à l'immunoprécipitation, aux techniques d'immunofluorescence, à la microscopie confocale et à diverses autres méthodes pour analyser les voies de l'autophagie.Les détails des différentes techniques, des pièges potentiels et de la résolution des problèmes seront expliqués par ma doctorante, Secil Erbil. L'objectif général des procédures d'immunofluorescence et d'immunoprécipitation est de surveiller les interactions protéine-protéine endogènes au sein d'une cellule. Cette méthode peut vous aider à répondre aux questions clés concernant les interactions protéine-protéine et leur localisation cellulaire.Le principal avantage de ces techniques est la possibilité de quantifier l'intensité de l'interaction pendant des traitements et des conditions souhaités, par rapport à un témoin. Pour commencer, détacher les cellules à l'aide de la trypsine. Ensuite, compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et calculer la concentration cellulaire.Prenez des lamelles emballées et stérilisées à l'autoclave, et placez-les dans une boîte de Pétri de 10 centimètres de diamètre. Si vous travaillez avec une lignée cellulaire facilement détachable, comme les HEK293T dans cette expérience, recouvrez les lamelles d'une solution de poly-L-lysine à 0,01 %, stérilisée par filtration. Après 10 minutes d'incubation, retirez la solution.Attendre que tout le poly-L-lysine se soit évaporé et que les lamelles soient complètement sèches. Ensuite, les laver avec du PBS stérile. Ajouter un millilitre de milieu dans chaque puits d'une plaque de 12 puits, puis placer les lamelles dans chaque puits.Ensemencez 20 000 cellules par puits. Il est important d'agiter la plaque pendant et après l'inoculation afin d'obtenir une répartition homogène des cellules sur les lamelles. Traitez vos cellules avec le médicament souhaité et son contrôle de manière à ce que le temps d'incubation total des cellules ne dépasse pas 48 heures.Au bout de 48 heures, retirez le milieu des lamelles et lavez les cellules une fois avec du PBS. Ensuite, sous une hotte, retirez le PBS et fixez les cellules en les incubant avec du PFA à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante. Étant donné que le PFA est sensible à la lumière, couvrez la plaque avec du papier d'aluminium pendant l'incubation.Ensuite, retirez le PFA et lavez les échantillons trois fois avec du PBS. À cette étape, il est important de laver les échantillons un par un afin de ne pas les dessécher. Ensuite, étiquetez une plaque à six puits selon vos conditions de traitement et recouvrez chaque puits de Parafilm.À cette étape, veillez à obtenir un fond lisse après la couverture avec du Parafilm. Placez ensuite les lamelles dans une plaque à six puits et déposez 100 microlitres de mélange BSA-saponine sur chaque lamelle. Incubez pendant 30 minutes sur de la glace pour le blocage. Éliminez ensuite la solution de blocage et lavez les échantillons une fois avec du PBS.Préparez un à 100 d'anticorps primaire dans le mélange BSA-saponine, et déposez 100 microlitres de cette solution sur chaque lamelle. Incubez une heure à température ambiante. Pendant l'incubation, il est préférable d'agiter la plaque afin d'obtenir une répartition uniforme de l'anticorps sur les lamelles.Ensuite, retirez l'anticorps primaire et lavez les échantillons trois fois avec du PBS. Préparez un anticorps secondaire Alexa Fluor à une dilution de 1/500 dans le mélange BSA-saponine, puis ajoutez 100 microlitres de cette solution sur chaque lamelle. Étant donné qu'Alexa Fluor est sensible à la lumière, il est important de maintenir les échantillons à l'abri de la lumière à partir de cette étape.Par conséquent, couvrez la plaque à six puits avec du papier d’aluminium et incubez-la une heure à température ambiante sur un agitateur. Ensuite, retirez l'anticorps secondaire et lavez les échantillons trois fois avec du PBS. Étiquetez les lames avec les noms de vos traitements et nettoyez-les avec de l'éthanol à l’aide de compresses Kimwipes.Ensuite, déposez 10 microlitres de solution de montage au centre de chaque lame. À l’aide d’une pince, placez chaque lame couvre-objet sur les lames. Puis, retirez délicatement l’excès de solution de montage à l’aide d’un essuie-tout.Commencez par stabiliser chaque lame de couverture avec quatre gouttes de vernis à ongles. Ensuite, scellez complètement la lame de couverture. Analysez l'échantillon à l'aide d'un microscope confocal.Ici, vous voyez un exemple de résultat de colocalisation obtenu en utilisant ce protocole, extrait de notre récente publication. Dans cette vidéo, la protéine RACK1 endogène a été marquée en vert, tandis que LC3 endogène a été marquée en rouge. Les points jaunes qui apparaissent sur les images de fusion correspondent aux endroits où les signaux vert et rouge se superposent.En d'autres termes, les points jaunes représentent la colocalisation de ces deux protéines. L'immunoprécipitation est une autre méthode couramment utilisée pour étudier les interactions entre protéines. Pour commencer, ensemencez quatre millions de cellules HEK293T dans des boîtes de Pétri de 15 centimètres pour chaque condition.Traitez les cellules avec les médicaments souhaités de manière à ce que le temps total d'incubation des cellules ne dépasse pas 48 heures. Après 48 heures d'incubation, récoltez les cellules avec du PBS glacé. Les cellules HEK293T se détachent facilement de la plaque.Par conséquent, laver la plaque avec du PBS à l’aide d’une pipette suffit à détacher et à récolter toutes les cellules. Récupérez vos cellules dans des tubes Eppendorf et centrifugez-les 15 minutes à vitesse maximale à quatre degrés. Ensuite, éliminez le surnageant et lavez le culot cellulaire avec un millilitre de PBS en le resuspendant à l’aide d’une pipette.Ensuite, centrifuger à nouveau et éliminer le surnageant. Resuspendre ensuite le culot cellulaire dans du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Vortexer la suspension pendant 15 secondes et maintenir le tube Eppendorf sur de la glace pendant cinq minutes.Répétez le vortexage cinq fois, une fois toutes les cinq minutes. Ensuite, centrifugez l'échantillon à la vitesse maximale pendant 15 minutes à quatre degrés. Puis prélevez le surnageant et centrifugez à nouveau pour éliminer complètement les débris cellulaires.Effectuez une dilution des lysats protéiques d’un facteur 1 à 50, et préparez une plaque de 96 puits contenant le témoin, les étalons et les échantillons dilués. Mélangez-les avec la solution de Bradford dans un rapport de 1 à 20, laissez incuber 15 minutes à l’abri de la lumière, puis mesurez la densité optique à 595 millimètres, et calculez la concentration en protéines à l’aide des valeurs d’absorbance pour chaque échantillon. Préparez ensuite les billes pour la couplage de l’anticorps.Coupez le bord d'une pointe de 200 microlitres à l'aide de ciseaux, puis prélevez 25 microlitres de la suspension de billes pour chaque condition. Lavez les billes une fois avec du PBS, une fois avec du tampon RIPA, puis une fois avec du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Après le dernier lavage, resuspendez les billes dans 300 microlitres de tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases et ajoutez 1,5 microgramme d'anticorps spécifique à la protéine que vous souhaitez immunoprécipiter.Incuber le mélange d'anticorps et de billes toute la nuit à quatre degrés sur un agitateur rotatif. Après l'incubation, laver les billes avec du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases et charger deux milligrammes d'extraits cellulaires totaux provenant de chaque condition. Compléter le volume total à 300 microlitres avec du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases, puis incuber toute la nuit sur un agitateur rotatif à quatre degrés.Ensuite, laver les billes trois fois avec du tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Après le dernier lavage, à l’aide d’une pipette plus petite, essayer de prélever tout le surnageant sans toucher les billes. Puis ajouter 10 microlitres de colorant de charge 3X.Pour contrôler l'expression endogène de protéines qui seront analysées dans une expérience de co-immunoprécipitation, préparez les échantillons d'entrée en utilisant au moins 100 microgrammes de lysat protéique. Ajoutez le volume approprié de colorant de charge 3X à chaque échantillon. Pour dénaturer les échantillons d'immunoprécipitation et les témoins d'entrée, faites-les bouillir à 95 degrés pendant 10 minutes.Ensuite, centrifuger brièvement et charger les échantillons sur un gel SDS afin de séparer les protéines selon leur taille par immunotransfert (western blot). Faire migrer les échantillons protéiques sur gel SDS, puis transférer les protéines sur des membranes de nitrocellulose. Une fois le transfert humide terminé, bloquer la membrane de nitrocellulose en l'incubant avec une solution de lait écrémé à 5 % pendant une heure à température ambiante sur un agitateur.Ensuite, lavez la membrane trois fois dans la solution PBS-Torin pendant cinq minutes sur un agitateur à température ambiante. Incubez la membrane dans l'anticorps primaire, spécifique à la protéine que vous souhaitez détecter, pendant une heure à température ambiante. Vous pouvez préférer préparer les anticorps primaires dans la solution rouge afin de les réutiliser sans altérer leur qualité.Après l'incubation avec l'anticorps primaire, répéter trois fois les étapes de lavage au PBS-Torin. Ensuite, préparer la solution d'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (HRP) dans du lait écrémé à 5 % et incuber avec la membrane pendant une heure à température ambiante sur un agitateur. Après l'incubation, répéter à nouveau les étapes de lavage.Ensuite, préparez une solution ECL maison et placez la membrane dans une cassette. Puis poursuivez le développement des étapes de fixation, telles que décrites dans le texte accompagné d'un schéma complet. Après la fixation et le séchage du film, marquez selon les bords de la membrane et la désignation des protéines afin de pouvoir prédire la bande spécifique.Répétez toutes ces étapes d'incubation avec les anticorps suivies des procédures en chambre noire pour toutes les protéines dont vous souhaitez vérifier l'interaction. Ensuite, analysez les résultats. Ici, vous voyez un résultat d'immunoprécipitation endogène extrait de notre article récent.Dans cette vidéo, la protéine endogène ATG5 a été précipitée, et les niveaux de co-précipitation immunologique de RACK1 endogène ont été vérifiés dans différentes conditions. Lors de la réalisation de ces procédures, il est important de prévoir autant de répétitions biologiques que possible, accompagnées de contrôles positifs et négatifs, afin de recueillir les niveaux quantifiés d'interaction après différents traitements. L'ensemble des données fournies par toutes les répétitions biologiques constitue le profil d'interaction dans différentes conditions.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser la dynamique des interactions protéine-protéine.

study-of-protein-protein-interactions-in-autophagy-research

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

L'autophagie est un processus omniprésents qui permet aux cellules de se dégradent et recyclent des protéines et des organites. Nous appliquons la microscopie par fluorescence de pointe pour visualiser et quantifier les petits, mais les changements essentiels, physiques associés à l'induction de l'autophagie, y compris la formation et la distribution de autophagosomes et des lysosomes, et leur fusion dans autolysosomes.

Analyse quantitative de l&#39;autophagie en utilisant avancée Fluorescence Microscopy 3D

Microscopie time-lapse de marqueurs de l'autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l'autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l'autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d'une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

Nous avons établi un procédé pour la purification des protéines d'interaction co-régulation utilisant le système LC-MS / MS.

Une protéine Méthode de préparation pour le haut-débit Identification des protéines interagissant avec un cofacteur nucléaire utilisant LC-MS / MS Analysis

l'activation Autophagie est bénéfique dans la prévention d'un certain nombre de maladies. L' une des approches physiologiques pour induire autophagy in vivo est un exercice physique. Ici, nous montrons comment activer l'autophagie par l'exercice aérobie et de mesurer les niveaux de l'autophagie chez les souris.

Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris

Ici, la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d'autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.

Évaluation du flux autophagique en mesurant LC3, p62 et LAMP1 Co-localisation à l&#39;aide de la cytométrie de flux d&#39;imagerie multispectrale

Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.

Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

La biodétection à effet de champ (FEB) est une technique sans étiquette permettant de détecter les interactions biomoléculaires. Il mesure le courant électrique à travers le biocapteur de graphène auquel les cibles de liaison sont immobilisées. La technologie FEB a été utilisée pour évaluer les interactions biomoléculaires entre Hsp90 et Cdc37 et une forte interaction entre les deux protéines a été détectée.

Exploration de l’interaction biomoléculaire entre le chaperon moléculaire Hsp90 et sa protéine cliente Kinase Cdc37 à l’aide de la technologie de biodétection à effet de champ

Le présent protocole décrit l’induction de l’autophagie dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster via l’épuisement des nutriments et analyse les changements dans l’autophagie à l’aide de souches de mouches transgéniques.

Analyse de l’autophagie induite par la famine dans le corps adipeux larvaire de Drosophila melanogaster

Ce protocole décrit diverses méthodes qui peuvent aider à l’étude de la biologie de l’ATG9A, y compris l’immunofluorescence suivie d’une analyse d’imagerie, les considérations de surexpression transitoire et l’étude de l’état de glycosylation de l’ATG9A à l’aide du transfert Western.

Imagerie ATG9A, une protéine membranaire à plusieurs étendues

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’utilisation d’un test rapporteur à base de luciférase dans un format de criblage semi-automatisé à haut débit.

Criblage de médicaments cellulaires pour les inhibiteurs de la cystéine 4B peptidase liée à l’autophagie

Ici, nous présentons la méthodologie permettant d’évaluer de manière concise les niveaux de marqueurs d’autophagosomes LC3-II dans les vésicules extracellulaires (VE) par immunoblottage. L’analyse des niveaux de LC3-II dans les VE, la formation d’autolysosomes et la formation d’omégasomes suggère le nouveau rôle de STX6 dans la libération de VE LC3-II positifs lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

Découvrez les techniques d'immunofluorescence et d'immunoprécipitation pour étudier les interactions protéine-protéine dans la régulation de l'autophagie chez les mammifères. Ces méthodes permettent d'identifier de nouveaux composants des voies de signalisation cellulaire.

Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Explorer plus de vidéos