Protocole pour HER2 pêcher avec un fixateur de tissu Non-cross-linking, formol à combiner les avantages de Cryo-préservation et Fixation au formol

La médecine personnalisée nécessite différents types d’analyses, de l’histologie classique à l’analyse moléculaire, et diverses techniques in-situ sont effectuées sur une tumeur pour sélectionner la meilleure thérapie. Les techniques d’investigation permettent diverses technologies d’analyse à partir d’un seul échantillon. Nous démontrons ici, en utilisant un fixateur non réticulant dans la simple étape de post-fixation du formol, que vous pouvez utiliser des protocoles développés et validés à l’origine pour du matériel formel et fixé inclus dans la paraffine, peut être utilisé à partir de l’échantillon cellulaire produisant une bonne morphologie, une bonne qualité d’ARN et de bons résultats pour une hybridation in situ plus complète.

Les conditions d’hybridation typiques ne sont pas appropriées pour que les tissus fixés sans formol produisent des résultats FISH. Nous avons révélé que ce n’est pas la pénétration mais le temps de correction chimique qui est critique pour obtenir des résultats FISH comparables à partir de tissus fixés à la pectine. Seule la section utilisée pour FISH est formelle et post-fixée.

Le tissu fixé sans formol restant permet une analyse moléculaire supérieure par rapport au tissu FFP, comme le démontre le RTPCR. La procédure que nous avons démontrée par Daniela Pabst, la technicienne de mon laboratoire. Pour commencer, coupez les échantillons de tissu du cancer du sein avec un scalpel stérile en deux moitiés de quatre millimètres d’épaisseur chacune pour assurer une quantité adéquate de tissu.

Utilisez une taille maximale de 4x15x15 millimètres pour la fixation par une solution de formol tamponnée standard ou par une autre fixation tissulaire non réticulante et sans formol. Placez la moitié de l’échantillon de tumeur dans une cassette de tissu standard et immergez-la dans le SBFS. Placez l’autre moitié de l’échantillon de tumeur dans la solution de fixation alternative pendant 24 heures avec un rapport volume par volume de quatre parties de fixateur et d’une partie de tissu.

Ensuite, transférez les échantillons fixés alternativement dans la solution stabilisante pendant deux à 72 heures en ouvrant le récipient, en tournant la cassette de tissu de 180 degrés et en l’immergeant. Ensuite, placez les cassettes de tissu avec les échantillons fixés au SBFS dans un récipient rempli d’éthanol à 70 % pendant 30 minutes à température ambiante pour éliminer les résidus de SBFS. Après le traitement et l’intégration des tissus comme décrit dans le protocole textuel, utilisez un microtome pour couper des sections de trois microns de blocs FFPE et NCFPE.

Placez une partie de chaque type de section dans un bain d’eau froide. Prenez la section flottante avec un pinceau fin sur une lame de microscope fine et transférez-la dans un bain d’eau chaude. Saisissez à nouveau les sections étirées avec le pinceau sur la lame de microscope sans aucun pli.

Préparez-vous également à l’isolement de l’ARN pour effectuer une PCR de transcription inverse sur le même échantillon en plaçant une partie de chaque type de section dans un flacon de réaction. Pour la déparaffinisation des coupes de tissus, nous hydrateons les sections par étapes à température ambiante dans les bocaux de coloration avec 250 millilitres de réactifs différents. Placez d’abord les sections dans 100 % de xylène deux fois pendant 15 minutes, puis transférez les sections dans de l’éthanol à 96 % deux fois pendant 15 minutes.

Ensuite, déplacez les sections à travers des pourcentages d’éthanol de plus en plus faibles, en incubant chaque solution pendant deux minutes. Enfin, transférez les sections à distiller deux fois pendant 10 minutes. Effectuez la post-fixation des lames NCFPE en les plaçant dans un nouveau bocal de coloration rempli de SBFS pendant 24 heures à température ambiante.

Laissez le bocal dans la hotte pendant l’étape de post-fixation de 24 heures. Étonnamment, tous les temps de post-fixation de plus de 18 heures ont donné des résultats similaires à ceux obtenus avec un matériau de paraffine formel et fixe. Retirez l’excès de SPFS des lames en les lavant dans une solution saline tamponnée au phosphate pendant 10 minutes trois fois.

Poursuivez avec le deuxième lavage à l’eau distillée pendant 10 minutes deux fois. Ensuite, placez le pot de coloration contenant 250 millilitres de solution de prétraitement thermique citrique dans un bain-marie à 98 degrés Celsius. Placez le FFPE hydraté dans des lames NCFPE post-fixées dans le bocal et incubez pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez les lames à l’eau distillée pendant trois minutes à température ambiante dans un nouveau pot de coloration. Pour la protéolyse, placez les lames dans une hybridation à température contrôlée à 37 degrés Celsius. Appliquez immédiatement la solution de pepsine prête à l’emploi goutte à goutte sur les sections de tissus jusqu’à ce qu’elles soient complètement recouvertes.

Ensuite, incubez pendant neuf minutes à 37 degrés Celsius dans le système d’hybridation. Ensuite, placez les lames dans un bocal contenant un tampon de lavage SSC et incubez pendant cinq minutes. Placez les lames dans de l’eau distillée pendant une minute à température ambiante.

Effectuez la déshydratation des sections dans une série d’alcools gradués, chacun pendant une minute. Après la série de déshydratation, faites sécher les sections à l’air. Pour l’hybridation, pipetez 10 microlitres de la sonde combinée HER2 et sun 17 sur les sections de tissu séché, recouvrez chaque échantillon d’une lamelle de recouvrement et scellez-le avec du ciment de caoutchouc.

Code dénaturer la sonde et l’ADN de l’échantillon dans le système d’hybridation à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes. Le système d’hybridation diminue automatiquement à 37 degrés Celsius et l’hybridation se poursuit pendant la nuit. Le lendemain, retirez soigneusement le ciment en caoutchouc et les lamelles ainsi que les lames de recouvrement à l’aide d’une pince pour la post-hybridation et la protection.

Incuber les tailles dans un bocal de coloration contenant 37 degrés Celsius préchauffé 1X tampon A pendant cinq minutes. Ensuite, lavez les lames à l’aide d’un tampon de lavage 1X préchauffé deux fois pendant cinq minutes à 27 degrés Celsius. Ensuite, déshydratez les lames à 70 %90 % et 100 % d’éthanol à une minute pour chaque concentration.

Faites sécher les échantillons à l’air libre et protégez-les de la lumière. Pour la coloration, appliquez 30 microlitres de solution DAPI sur la zone hybridée, en évitant les bulles. Couvrez les sections avec une lamelle avant d’incuber les sections pendant 15 minutes, à l’abri de la lumière.

Retirez avec précaution l’excès de solution DAPI en appuyant doucement sur la lame entre les papiers filtres. Conservez les lames à une température de deux à huit degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à deux semaines jusqu’à ce qu’elles soient évaluées par microscopie confocale. Acquérez les images avec des filtres pour les canaux verts et oranges.

Procéder à l’interprétation des données et à l’évaluation de la qualité de l’ARN comme décrit dans le protocole textuel. On voit ici la comparaison directe du résultat obtenu à partir de l’échantillon formel et de l’échantillon fixe non réticulé qui a été post-fixé. Les signaux sont d’intensité similaire, et l’arrière-plan est également similaire.

Dans les cellules interphasiques normales, il y a un nombre égal de signaux rouges et verts correspondant au locus HER2 et au locus de référence sen 17, ce qui montre qu’il n’y a pas d’amplification au niveau du gène HER2. Le résultat d’un autre cas où le gène HER2 est amplifié, et il existe un signal beaucoup plus fort et plus large pour le locus HER2 que pour le gène de référence. Ce phénomène est apparent dans les tissus fixes formels et fixes, ainsi que dans les tissus fixes non réticulés.

Ce graphique montre l’efficacité de l’amplification pour les différentes longueurs d’amplicon de l’ARNm GAPDH. Pour le formol, environ 23 cycles sont nécessaires, et pour le matériel fixe non réticulant, ce nombre est réduit à 20 cycles. La différence devient plus évidente à des amplicons plus longs, ce qui indique que la fragmentation et la modification chimique sont nettement réduites par l’utilisation de fixateurs non réticulants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont on peut utiliser une clé approuvée par la FDA pour le matériel FFPN sur du matériau fixé sans réticulation en ajoutant une simple étape de post-fixation dans la procédure pré-analytique. Le principal avantage de cette technique est que seule la section utilisée pour l’hybridation in situ pleine sens est destinée à la post-fixation avec du formol, tandis que le bloc restant est fixé dans le fixateur non réticulé, et peut donc être utilisé pour un large spectre d’analyse moléculaire. Ce protocole est particulièrement utile dans le contexte de la médecine personnalisée moderne, lorsque plusieurs analyses doivent être effectuées à partir de tumeurs relativement petites et que le traitement d’échantillons de tissus pour différents protocoles n’est pas réalisable.

De plus, l’utilisation d’un fixateur sans réticulation présente l’avantage de préserver les propriétés tissulaires comme la cryoconservation. Cela permet d’éviter la congélation de l’azote liquide, et de maintenir une chaîne de refroidissement dans un contexte chimique. Ces différences dans la qualité de l’ARN ne sont pas évidentes, de sorte que lors de l’utilisation de tests classiques de contrôle de la qualité de l’ARN tels que les numéros d’intégrité de l’ARN, ces tests ne sont pas entièrement formateurs en termes de qualité de l’ARN isolé du matériel fixé et inclus dans la paraffine.