L'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant Dans Utero Electroporation

Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.

L’objectif général de cette procédure est d’observer directement les neurones en migration radiale dans une culture de tranches organotypiques préparée à partir d’un cerveau embryonnaire électroporé par microscopie confocale time-lapse. Cette méthode peut aider à étudier des aspects clés du développement du néocortex. Il permet d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la polarisation des neurones et la migration radiale des neurones vers leur position finale dans le cerveau.

Le principal avantage de cette technique est que les propriétés dynamiques des neurones en migration peuvent être analysées, y compris les profils de vitesse, la vitesse moyenne de migration ainsi que les changements de direction migratoire. Commencez par placer une souris enceinte correctement anesthésiée en position couchée sur une plaque chauffante. Vérifiez l’absence de réflexe de pédale.

Et ensuite, couvrez soigneusement les yeux de vaseline pour éviter qu’ils ne sèchent. Ensuite, étalez doucement les membres et fixez-les à la plaque chauffante avec du ruban chirurgical. Stérilisez l’abdomen par écouvillonnage avec de l’éthanol à 70 % suivi d’une solution iodée, puis placez de la gaze stérile, dans laquelle une incision a été faite pour l’incision abdominale, sur l’abdomen.

Humidifiez la gaze avec une solution de chlorure de sodium bactériostatique. Après avoir réévalué le développement de l’anesthésie chirurgicale, par perte du réflexe de pédale, utilisez des micro-pinces Adson dentelées et des ciseaux fins inclinés pour couper la peau d’environ 1,5 centimètre le long de la ligne médiane de l’abdomen. Ensuite, coupez le muscle sous-jacent le long de la linea alba.

Saisissez la corne utérine entre les embryons à l’aide d’une pince à anneau et placez-la doucement sur la gaze humidifiée sans perturber les placentas ou les vaisseaux d’alimentation. Ensuite, positionnez soigneusement un embryon pour donner une vue dégagée du ventricule latéral qui se présente comme une ombre en forme de croissant parallèle au sinus sagittal. Le site d’injection se trouve au milieu d’une ligne entre l’œil pigmenté et la confluence des sinus où le sinus sagittal se ramifie en deux sinus de transfert.

Une fois identifiée, poussez l’aiguille de micro-injection à travers la paroi utérine et dans le ventricule latéral. Ensuite, utilisez un micro-injecteur actionné par une pédale pour injecter un à deux microlitres de solution d’ADN avec cinq à 10 impulsions. Le succès de l’injection peut être surveillé par la solution d’ADN coloré qui devrait remplir le système ventriculaire.

Ensuite, placez des électrodes de type pince à épiler de manière à ce que la borne positive soit du même côté que le ventricule injecté et que la borne négative soit du côté opposé du ventricule injecté sous l’oreille de la tête de l’embryon. Humidifiez le site d’électroporation avec quelques gouttes de solution de chlorure de sodium bactériostatique et appliquez cinq impulsions de courant électrique d’une durée de 50 millisecondes avec des intervalles de 950 millisecondes. Les bulles à l’électrode négative indiquent le courant électrique.

60 à 90 milliampères sont généralement suffisants pour une électroporation réussie. Les courants plus faibles ne transfectent pas efficacement les neurones, tandis que les courants plus élevés peuvent entraîner la mort embryonnaire. Après avoir répété la procédure pour chaque embryon de la première corne utérine, replacez-la doucement dans la cavité abdominale.

Après avoir suturé la couche musculaire et la peau, désinfectez soigneusement avec une solution iodée et retirez délicatement la vaseline des yeux à l’aide d’écouvillons de cellulose. Placez la souris sous une lampe infrarouge jusqu’à ce qu’elle se réveille. Après avoir euthanasié la femelle enceinte à l’aide d’une méthode approuvée, retirez l’utérus contenant les embryons et placez-le dans une boîte de Pétri de 10 centimètres avec un HBSS complet glacé.

À partir de ce moment, gardez toutes les solutions, les embryons et les cerveaux sur de la glace. Lorsque vous travaillez sous un stéréomicroscope, utilisez une pince à pointe fine et une paire de ciseaux à ressort Vannas Tübingen pour séparer chaque embryon de l’utérus. Transférez les embryons dans une autre boîte de Pétri contenant du HBSS complet glacé.

Faites une incision au niveau du tronc cérébral et coupez le long de la ligne médiane sagittale. Retirez la peau et le cartilage qui recouvrent le cerveau. Ensuite, coupez le tronc cérébral juste derrière les hémisphères et retirez le cerveau du crâne.

Transférez le cerveau avec une micro-cuillère spatule dans une assiette à 12 puits contenant du HBSS complet glacé. Récupérez tous les cerveaux de la litière dans la plaque à 12 puits. Ensuite, utilisez un stéréomicroscope à fluorescence pour examiner les cerveaux de la plaque à 12 puits pour déterminer la luminosité de la fluorescence ainsi que la taille de la région électroporée.

Sélectionnez deux à quatre cerveaux avec des signaux fluorescents brillants et le cortex somatosensoriel présumé pour un traitement ultérieur. Ensuite, versez une solution d’agarose fondue à 3 % à faible point de fusion dans un moule d’enrobage jetable détachable. Utilisez une micro-cuillère pour retirer le cerveau de la plaque à 12 puits et égouttez soigneusement l’excès de HBSS complet autour du cerveau à l’aide de papier de soie fin.

Placez doucement le cerveau dans la solution d’agarose. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 20, poussez-le au fond du moule et ajustez soigneusement sa position. Pour les coupes coronales, orientez le cerveau avec les bulbes olfactifs pointant vers le haut.

Gardez le moule sur de la glace jusqu’à ce que la solution d’agarose soit solidifiée, puis procédez à la section du cerveau. Utilisez une lame de rasoir propre pour couper l’excès d’agarose autour du cerveau, laissant environ un millimètre d’agarose sur tous les côtés, à l’exception des bulbes olfactifs où deux à trois millimètres d’agarose doivent être laissés. Après avoir appliqué une petite quantité de colle cyanoacrylate sur un échantillon, fixez le bloc d’agarose taillé avec les bulbes olfactifs pointant vers le bas.

Transférez l’étage de l’échantillon dans la chambre de tranchage d’un microtome à lame vibrante contenant du HBSS complet glacé et positionnez le cerveau avec sa face dorsale vers la lame. Coupez des tranches de cerveau de 250 microns d’épaisseur contenant la région électroporée avec une amplitude faible à modérée et une vitesse de sectionnement très lente. Habituellement, quatre à six coupes avec un signal fluorescent brillant sont obtenues à partir de chaque cerveau électroporé avec succès.

Saisissez le bord de l’agarose d’une section à l’aide d’une pince à pointe fine et tirez la tranche sur une spatule micro-cuillère pliée. De cette manière, transférez soigneusement les tranches de cerveau dans une plaque à six puits contenant du HBSS complet glacé. Inserts de membrane enduits de laminine humide avec 100 microlitres de HBSS complet.

Ensuite, transférez soigneusement les tranches sur les membranes à l’aide de la micro-cuillère pliée, de la spatule et de la pince. Poussez doucement la tranche de la spatule sur la membrane, puis positionnez-la à l’aide d’une pince. Continuez à transférer les tranches restantes.

Jusqu’à cinq tranches peuvent être placées sur un insert à membrane. Retirez l’excès de HBSS complet à l’aide d’une pipette. Ensuite, à l’aide d’une pince, placez soigneusement les inserts de membrane avec les tranches dans une plaque à six puits contenant 1,8 millilitre de milieu de culture tranché.

Sélectionnez une tranche de cerveau pour l’imagerie en observant les tranches à l’aide d’un microscope inversé. Choisissez une tranche avec des neurones uniques brillants dans la SVZ supérieure migrant radialement vers la surface du poil de la tranche. La présence de fins processus fluorescents de cellules gliales radiales qui couvrent toute la plaque conjuguée indique un échafaudage glial radial intact qui est utilisé par les neurones conjugués en migration.

Transférez l’insert à membrane avec une tranche sélectionnée dans une boîte à fond de verre de 50 millimètres de diamètre contenant deux millilitres de milieu de culture en tranches. Placez la parabole dans la chambre climatique du microscope confocal. Réglez la résolution sur 512 x 512 pixels.

Augmentez la vitesse de balayage de 400 hertz à 700 hertz pour augmenter la fréquence d’images d’environ 1,4 à environ 2,5 images par seconde. N’utilisez pas plus de deux fois la moyenne. Définissez un empilement Z à travers la région électroporée avec une taille de pas de 1,5 micron.

Commencez la série time-lapse en prenant une pile Z toutes les 30 minutes. Les paramètres décrits permettent une résolution et une luminosité suffisantes de l’image tout en limitant les dommages causés à la photo lors de l’acquisition. Cette vidéo montre les neurones corticaux E16.5 migrant des zones sous-ventrales ventriculaires vers la plaque corticale.

Dans le Bcl11a floxé conditionnel transgénique après électroporation du plasmide de contrôle IRES-GFP au jour embryonnaire 14,5. Le film est composé de 108 images à raison de cinq images par seconde. La barre d’échelle représente 100 microns.

L’électroporation d’un vecteur plasmidique d’ADN contenant Cre-IRES-GFP a affecté la migration des neurones corticaux dans les cerveaux conditionnels Bcl11a. Comme on le voit ici, très peu de neurones dépassent la zone intermédiaire pour atteindre la plaque corticale. Cette vidéo montre la polarisation des neurones corticaux d’un contrôle marqué par GFP à gauche par rapport aux neurones d’un mutant Bcl11a à droite.

Ces traces animées de contrôle représentatif dans les neurones mutants Bcl11a ont été obtenues à partir de séries en accéléré de cultures de coupes E16.5 avec une résolution d’une heure d’intervalle. Encore une fois, les données du cerveau témoin sont montrées à gauche et les données du cerveau électroporé Cre-IRES-GFP sont montrées à droite. Comme le montre cette collection de traces représentatives de cultures de contrôle et de coupes de mutant Bcl11a, les neurones mutants Bcl11a subissent fréquemment des phases répétitives de vitesse de migration réduite et de changement d’orientation aléatoire, comme indiqué par les pointes de flèches rouges.

Les profils de vitesse peuvent être calculés à partir de traces de neurones en migration. Comme on le voit ici, une plus grande proportion de neurones mutants Bcl11a ont des vitesses de migration plus lentes que les témoins. L’angle de déviation peut être calculé à partir des données de trace.

Comme le montre cet histogramme, les neurones mutants Bcl11a représentés par les barres noires présentent des angles de déviation plus importants par rapport aux témoins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures chacune pour l’électroporation in utero et la préparation de culture de tranches de cerveau organotypiques. Cette procédure peut facilement être adaptée pour effectuer une analyse fractionnée de gènes d’intérêt dans la migration radiale des neurones corticaux par gain et perte de fonction ainsi que des expériences vasculaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’observer directement les neurones en migration radiale dans une culture de tranches organotypiques préparée à partir de cerveaux embryonnaires électroporés par microscopie confocale time-lapse.