L'imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant

L'objectif général de cette procédure est d'observer directement les neurones en migration radiaire dans une culture de tranches organotypiques préparée à partir d'un cerveau embryonnaire électroporé, au moyen de la microscopie confocale en temps réel. Cette méthode peut aider à étudier des aspects clés du développement du néocortex. Elle permet d'analyser les mécanismes moléculaires impliqués dans la polarisation neuronale et la migration radiaire des neurones vers leur position finale dans le cerveau.

Le principal avantage de cette technique réside dans l'analyse des propriétés dynamiques des neurones en migration, notamment les profils de vitesse, la vitesse moyenne de migration ainsi que les changements de direction de la migration. Commencez par placer une souris gestante correctement anesthésiée en position dorsale sur une plaque chauffante. Vérifiez l'absence du réflexe plantaire.

Ensuite, recouvrez soigneusement les yeux avec de la vaseline afin d'éviter qu'ils ne s'assèchent. Puis, écartez délicatement les membres et fixez-les sur la plaque chauffante à l'aide de ruban chirurgical. Stérilisez l'abdomen en le passant avec de l'éthanol à 70 %, suivi d'une solution d'iode, puis placez une compresse stérile, dans laquelle une incision a été pratiquée pour l'ouverture abdominale, sur l'abdomen.

Humidifiez la gaze avec une solution de chlorure de sodium bactériostatique. Après avoir réévalué l'installation de l'anesthésie chirurgicale par la perte du réflexe plantaire, utilisez une pince micro-Adson crantée et des ciseaux fins angulés pour inciser la peau sur environ 1,5 centimètre le long de la ligne médiane de l'abdomen. Ensuite, incisez le muscle sous-jacent le long de la ligne alba.

Saisir la corne utérine entre les embryons à l’aide d’une pince à anneau et la placer délicatement sur la gaze humide sans perturber les placentas ni les vaisseaux d’approvisionnement. Ensuite, positionner soigneusement un embryon de manière à obtenir une vue claire du ventricule latéral, qui apparaît comme une ombre en forme de croissant parallèle au sinus sagittal. Le site d’injection se situe au milieu d’une ligne reliant l’œil pigmenté et la confluence des sinus, où le sinus sagittal se divise en deux sinus transverses.

Une fois identifié, introduire l'aiguille de microinjection à travers la paroi utérine et dans le ventricule latéral. Ensuite, utiliser un microinjecteur commandé par une pédale pour injecter un à deux microlitres de solution d'ADN en cinq à dix impulsions. L'injection réussie peut être suivie grâce à la solution colorée d'ADN, qui doit remplir le système ventriculaire.

Ensuite, placer des électrodes de type pinces de manière à ce que la borne positive soit du même côté que le ventricule injecté et que la borne négative soit située à l'opposé du ventricule injecté, sous l'oreille de la tête de l'embryon. Humidifier le site d'électroporation avec quelques gouttes de solution de chlorure de sodium bactériostatique et appliquer cinq impulsions de courant électrique d'une durée de 50 millisecondes espacées d'intervalles de 950 millisecondes. La présence de bulles à l'électrode négative indique le passage du courant électrique.

Un courant de 60 à 90 milliampères est généralement suffisant pour une électroporation réussie. Des courants inférieurs ne transfecteront pas efficacement les neurones, tandis que des courants plus élevés peuvent entraîner la mort de l'embryon. Après avoir répété la procédure pour chaque embryon du premier cornet utérin, replacez-le délicatement dans la cavité abdominale.

Après avoir suturé la couche musculaire et la peau, désinfecter soigneusement avec une solution d'iode et retirer délicatement le vaseline des yeux à l'aide de tampons en cellulose. Placer la souris sous une lampe à infrarouge jusqu'à ce qu'elle se réveille. Après avoir euthanasié la femelle gravide selon une méthode approuvée, retirer l'utérus contenant les embryons et le placer dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du HBSS complet glacé.

À partir de ce moment, maintenir toutes les solutions, les embryons et les cerveaux sur de la glace. Sous un microscope stéréoscopique, utiliser une pince fine et une paire de ciseaux à ressort Vannas de Tübingen pour séparer chaque embryon de l'utérus. Transférer les embryons dans une autre boîte de Pétri contenant du HBSS complet glacé.

Effectuez une incision au niveau du tronc cérébral et coupez le long de la ligne médiane sagittale. Retirez la peau et le cartilage recouvrant le cerveau. Ensuite, sectionnez le tronc cérébral juste derrière les hémisphères et retirez le cerveau du crâne.

Transférez le cerveau à l’aide d’une spatule micro-spatule dans une plaque de 12 puits contenant du HBSS complet glacé. Récupérez tous les cerveaux de la portée dans la plaque de 12 puits. Ensuite, utilisez un stéréomicroscope à fluorescence pour examiner les cerveaux dans la plaque de 12 puits en fonction de l’intensité de la fluorescence ainsi que de la taille de la région électroporée.

Sélectionnez deux à quatre cerveaux présentant des signaux fluorescents intenses et le cortex somatosensoriel présumé pour un traitement ultérieur. Ensuite, versez une solution fondue d'agarose à point de fusion bas à 3 % dans un moule d'inclusion jetable démontable. Utilisez une spatule micro-spatule pour retirer le cerveau de la plaque de 12 puits et éliminez soigneusement l'excès de HBSS complet autour du cerveau à l'aide d'un papier essuie-tout fin.

Placer délicatement le cerveau dans la solution d'agarose. Ensuite, utiliser une aiguille de 20 gauge pour le pousser au fond du moule et ajuster soigneusement sa position. Pour les sections coronales, orienter le cerveau de manière à ce que les bulbes olfactifs soient dirigés vers le haut.

Gardez le moule sur de la glace jusqu'à ce que la solution d'agarose soit solidifiée, puis procédez au découpage du cerveau. Utilisez une lame de rasoir propre pour découper l'excès d'agarose autour du cerveau, en laissant environ un millimètre d'agarose sur tous les côtés, sauf au niveau des bulbes olfactifs, où deux à trois millimètres d'agarose doivent être conservés. Après avoir appliqué une petite quantité de colle cyanoacrylate sur un spécimen, fixez le bloc d'agarose découpé avec les bulbes olfactifs orientés vers le bas.

Transférez la platine porte-échantillon dans la chambre de coupe d’un microtome à lame vibrante contenant du HBSS complet glacé et positionnez le cerveau avec sa face dorsale tournée vers la lame. Réalisez des tranches cérébrales de 250 micromètres d'épaisseur contenant la région électroporée, en utilisant une amplitude faible à modérée et une vitesse de coupe très lente. Habituellement, quatre à six tranches présentant un signal fluorescent intense sont obtenues à partir de chaque cerveau ayant subi une électroporation réussie.

Saisir le rebord d'agarose d'une section avec des pinces à pointes fines et tirer la tranche sur une spatule micro-spatule incurvée. De cette manière, transférer soigneusement les tranches de cerveau dans une plaque de six puits contenant du HBSS complet glacé. Humidifier les inserts de membrane revêtus de laminine avec 100 microlitres de HBSS complet.

Ensuite, transférez soigneusement les tranches sur les membranes à l’aide de la spatule microcuillère courbée et de la pince. Poussez délicatement la tranche de la spatule vers la membrane, puis positionnez-la à l’aide de la pince. Poursuivez en transférant les tranches restantes.

Jusqu'à cinq tranches peuvent être placées sur un insert de membrane. Retirez l'HBSS complet en excès à l'aide d'une pipette. Ensuite, à l'aide de pinces, placez soigneusement les inserts de membrane avec les tranches dans une plaque de six puits contenant 1,8 millilitre de milieu de culture pour tranches.

Sélectionnez une coupe cérébrale à imager en observant les tranches au microscope inversé. Choisissez une tranche présentant des neurones individuels brillants dans la zone ventriculaire subépendymaire supérieure, migrantes de manière radiaire vers la surface pileuse de la tranche. La présence de fins prolongements fluorescents des cellules gliales radiaires traversant toute la plaque conjuguée indique un squelette glial radial intact, utilisé par les neurones conjugués en migration.

Transférez l'insert de membrane avec une tranche sélectionnée dans une boîte de verre de 50 millimètres de diamètre contenant deux millilitres de milieu de culture de tranches. Placez la boîte dans la chambre climatique du microscope confocal. Réglez la résolution sur 512 par 512 pixels.

Augmentez la vitesse de balayage de 400 hertz à 700 hertz pour augmenter la fréquence d’images d’environ 1,4 à environ 2,5 images par seconde. Utilisez une moyenne d’au plus deux fois. Définissez un Z-stack traversant la région électroporée avec une taille de pas de 1,5 microns.

Démarrez la série en laps de temps en acquérant un Z-stack toutes les 30 minutes. Les paramètres décrits permettent une résolution et une luminosité d'image suffisantes tout en maintenant faible le dommage phototoxique pendant l'acquisition. Ce film montre des neurones corticaux de E16,5 en migration depuis les zones ventriculaire et sous-ventriculaire vers la plaque corticale.

Dans le modèle transgénique conditionnel Bcl11a floxé après électroporation du plasmide témoin IRES-GFP au 14,5e jour embryonnaire. Le film est composé de 108 images à raison de cinq images par seconde. L'échelle représente 100 microns.

L'électroporation d'un vecteur plasmidique ADN contenant Cre-IRES-GFP a affecté la migration des neurones corticaux dans les cerveaux conditionnels floxés pour Bcl11a. Comme on le voit ici, très peu de neurones traversent la zone intermédiaire pour atteindre la plaque corticale. Ce film montre la polarisation des neurones corticaux provenant d'un témoin marqué par la GFP à gauche, comparée à celle des neurones provenant d'un mutant Bcl11a à droite.

Ces tracés animés représentatifs du contrôle dans les neurones mutants de Bcl11a ont été obtenus à partir de séries temporelles de cultures de tranches E16,5 avec une résolution d'un intervalle d'une heure. Encore une fois, les données provenant du cerveau témoin sont affichées à gauche et celles du cerveau électroporé avec Cre-IRES-GFP sont affichées à droite. Comme on peut le voir sur cet ensemble de tracés représentatifs provenant de cultures de tranches témoins et mutantes pour Bcl11a, les neurones mutants de Bcl11a traversent fréquemment des phases répétées de réduction de la vitesse de migration et changent aléatoirement d'orientation, comme indiqué par les flèches rouges.

Les profils de vitesse peuvent être calculés à partir des trajectoires de neurones en migration. Comme on le voit ici, une proportion plus élevée de neurones mutants Bcl11a présente des vitesses de migration plus lentes par rapport aux témoins. L'angle de déviation peut être calculé à partir des données de trajectoire.

Comme on le voit sur cet histogramme, les neurones mutants de Bcl11a, représentés par les barres noires, présentent des angles de déviation plus importants par rapport aux témoins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de deux heures pour l'électroporation in utero et en moins de deux heures supplémentaires pour la préparation de la culture de tranches cérébrales organotypiques. Ce protocole peut facilement être adapté afin d'effectuer une analyse fonctionnelle de gènes d'intérêt dans les neurones corticaux en migration radiaire, par surexpression ou inhibition d'expression, ainsi que pour des expériences vasculaires.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment observer directement les neurones en migration radiaire dans une culture de tranches organotypiques préparée à partir de cerveaux embryonnaires électroporés, au moyen de la microscopie confocale en enregistrement temporel.