Identification et caractérisation des facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le RIP de roman-Tag ; RIP-tva modèle murin

L’objectif global de cette procédure est d’identifier et de caractériser les facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le nouveau RIP-Tag ; Modèle de souris RIP-tva. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases cancéreuses, telles que l’identification des moteurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Le principal avantage de ce modèle murin de cancer est d’identifier les facteurs métastatiques par transfert de gènes somatiques dans les légions de précurseurs des cellules bêta pancréatiques.

Commencez par récolter une boîte de 15 centimètres de virus produisant des cellules DF1 par souris à infecter. Tout d’abord, récupérez le milieu des paraboles confluentes de 15 centimètres. Ensuite, retirez les débris cellulaires par centrifugation à basse vitesse dans une centrifugeuse pré-refroidie pendant 10 minutes à 1650 fois G et quatre degrés Celsius.

Ensuite, transférez le surnageant viral dans des tubes d’ultracentrifugation polyallomères. Faites tourner une ultracentrifugeuse pendant 1,5 heure à 9540 fois G et quatre degrés Celsius. Retirez autant de surnageant que possible des tubes d’ultracentrifugation.

Ajoutez ensuite du PBS dans le tube de l’ultracentrifugeuse pour obtenir la suspension virale finale de 100 microlitres par parabole de 15 centimètres. Couvrez les tubes d’un film de laboratoire et remettez en suspension la pastille virale invisible en tourbillonnant pendant deux minutes à vitesse moyenne. Ensuite, secouez les tubes d’ultracentrifugation à quatre degrés Celsius pendant une heure ou toute la nuit.

Après l’incubation, transférez la suspension virale dans un tube de microcentrifugation et procédez au titre du virus. Commencez la procédure de titrage en vous assurant que les cellules DF1 placées dans 12 plaques de culture tissulaire ont atteint une confluence de 30 %. Une plaque de douze puits est nécessaire pour chaque détermination du titre viral.

Commencer une dilution en série décuplée des surnageants viraux en mélangeant d’abord cinq microlitres de surnageant viral avec 495 microlitres de milieu de croissance dans un tube de microcentrifugation pour faire une dilution de dix à la seconde. Vortex brièvement pendant quelques secondes. Transférez ensuite 40 microlitres de la dizaine à la deuxième dilution à 360 microlitres de milieu de croissance dans un tube de microcentrifugation pour la dizaine à la troisième dilution.

Vortex brièvement pendant quelques secondes. Continuez ce processus pour diluer à dix au quatrième et dix au cinquième. Ensuite, aliquote 2,25 millilitres de milieu de croissance dans chacun des cinq tubes de polystyrène de six millilitres.

Et étiquetez-les respectivement dix à la sixième, dix à la septième, dix à la huitième, dix à la neuvième et dix à la dixième. Mélangez 0,25 millilitre de la dixième à la cinquième dilution avec 2,25 millilitres de milieu de croissance dans le tube en polystyrène de six millilitres pour la dixième à la sixième dilution. Vortex brièvement pendant quelques secondes.

Répétez la procédure pour dix à la septième, dix à la huitième, dix à la neuvième et dix à la dixième dilution. Ensuite, retirez le milieu de culture d’origine des cellules DF1 sur les plaques à 12 puits. Et ajoutez un millilitre de virus dilué dans chaque puits en double.

Laissez les cellules se développer à 37 degrés Celsius et 5 CO2 pendant au moins sept jours. Commencez la procédure d’infection en anesthésiant d’abord une souris RIP-Tag RIP-tva âgée de sept semaines. Appliquez un lubrifiant pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée.

Rasez les poils de la cavité thoracique de la souris RIP-Tag RIP-tva, positionnez la souris sur le dos avec la poitrine vers le haut sur un papier absorbant de laboratoire sur un réchaud de protection contre les câlins. Effectuez un pincement des orteils pour vérifier que l’animal ne répond pas et pour confirmer l’effet de l’anesthésie complète. Étendez les membres avant et fixez-les avec du ruban adhésif.

Marquez la poitrine de la souris pour l’injection. Marquez l’emplacement à mi-chemin entre l’encoche sternale et le sommet de l’apophyse xiphoïde, et légèrement à gauche anatomiquement du sternum. Ensuite, frottez la paroi thoracique antérieure avec un gommage à la povidone iodée ou un gommage à la chlorhexidine, suivi d’une éponge de gaze imbibée d’alcool isopropylique à 70 % ou d’éthanol à 70 %.

Aspirez 50 microlitres d’air dans une seringue à insuline stérile de calibre 28,5 pour créer un espace entre le piston et le ménisque d’une seringue de 500 microlitres. Prélevez 100 microlitres de virus. L’espace aérien sans aucun liquide sur le mur est crucial pour voir le pouls cardiaque.

Gardez l’aiguille à la verticale, tenez la peau de la souris tendue d’une main et insérez l’aiguille à l’endroit marqué. Lorsqu’une impulsion de sang rouge vif apparaît dans la seringue, arrêtez d’avancer l’aiguille et fixez la profondeur de l’aiguille dans la souris d’une main. Utilisez l’autre main pour pousser doucement et lentement le piston pour délivrer la suspension virale sur une période d’environ 60 secondes.

Administrez 10 à 20 microlitres chaque fois qu’une impulsion de sang rouge vif apparaît dans la seringue. L’entrée continue de sang oxygéné rouge dans l’embout transparent de l’aiguille indique le bon positionnement de l’aiguille dans le ventricule gauche. Après la dernière poussée du butin pour délivrer une suspension virale et avant de voir le prochain pouls rouge de sang, rétractez rapidement l’aiguille hors de la cavité thoracique.

Appliquez une légère pression sur le site d’injection pendant au moins une minute pour réduire le saignement. Ensuite, déplacez délicatement la souris sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante jusqu’à ce qu’elle soit pleinement consciente. À l’âge de sept semaines, les souris RIP-Tag ont été infectées par le rétrovirus RCASBP-Bcl-xL indiqué et euthanasiées à l’âge de 16 semaines.

Cette photographie montre une coloration représentative de la synaptophysine de tumeurs neuroendocrines pancréatiques métastatiques dans les ganglions lymphatiques pancréatiques. Ici, les souris RIP-Tag RIP-tva ont été infectées par le RCASBP-RHAM B indiqué. Cette photographie montre la coloration représentative de la synaptophysine des tumeurs neuroendocrines pancréatiques métastatiques dans les ganglions lymphatiques pancréatiques. Ici, la coloration de la synaptophysine est observée dans le foie après l’injection du virus RCASBP-RHAMM B.

Il est important de se rappeler que le titre de plus de dix à huit unités infectieuses par millilitre est requis pour l’infection in vivo des cellules TVA proliférantes chez la souris RIP-Tag RIP-tva et le recteur rétroviral RCASBP peut délivrer de l’ADNC jusqu’à 2,5 kilobases. Après le développement de ce modèle de souris, il a ouvert la voie à un changement de paradigme et a découvert que BCL-xL favorise en fait les métastases cancéreuses indépendamment de sa fonction anti-apoptotique.