Analyse de haut-débit du comportement locomoteur dans le dosage de l’île de drosophile

L'objectif général du test de l'îlot est d'évaluer le comportement locomoteur de base de Drosophila melanogaster à l'aide d'un traitement automatique des données et d'une quantification objective. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les régulateurs clés du comportement locomoteur, tels que les gènes impliqués dans les troubles du mouvement. Elle peut également servir à tester des médicaments susceptibles de corriger ces anomalies.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une quantification à haut débit du comportement locomoteur de Drosophila, ce qui la rend adaptée aux criblages à grande échelle. Nous avons décidé de développer cette méthodologie afin de pouvoir analyser un grand nombre de modèles de maladies. Nous avions besoin d'une analyse automatisée des données d'images pour rendre cela réalisable.

La démonstration visuelle de cette méthode est très utile. Plusieurs étapes du traitement bêta sont cruciales et pourraient s'avérer difficiles pour les nouveaux utilisateurs, en particulier ceux qui ne sont pas familiers avec les logiciels utilisés. Préparez d'abord un minimum de trois flacons par condition expérimentale en tant que réplicats biologiques.

Chaque fichier doit contenir environ 15 mouches du même sexe et d'âge similaire. Il est important que les mouches aient des ailes intactes. Créez les dossiers pour stocker les expériences.

Générez ces éléments dans une structure de répertoires définie par les conditions et les réplicats. Par exemple, si l'expérience comporte deux génotypes avec cinq réplicats chacun, créez un dossier principal portant la date de l'expérience, puis, à l'intérieur de ce dossier, créez un sous-dossier pour chaque génotype. Ensuite, dans les dossiers des génotypes, créez des sous-dossiers pour chaque réplicat.

Ensuite, préparez l'appareil d'essai. Ajoutez de l'eau froide contenant une petite quantité de savon dans le bac et placez la plateforme au centre du bac, si elle n'est pas déjà fixée. Recouvrez le bac et la plate游戏副本 avec une boîte transparente.

Pour éclairer la plateforme, placez une lampe froide, telle que des LED ordinaires de 12 volts, au-dessus de celle-ci. Placez également une webcam connectée à un ordinateur directement au-dessus de la plateforme. Sur l'ordinateur, ouvrez le logiciel d'enregistrement d'images.

Dans le système de menu, sélectionnez la webcam appropriée comme dispositif de capture. Placez une mouche morte sur l'îlot pour ajuster les paramètres vidéo. Réglez la luminosité, le contraste et la couleur dans le logiciel afin que la mouche morte apparaisse en noir sur un fond blanc.

Ensuite, ajustez la configuration du film en laps de temps pour enregistrer les films au format AVI. Puis, accédez au répertoire où les données doivent être enregistrées et définissez le nom du film. Enregistrez ces modifications.

Pour la compression des données d'image, choisissez le code Intel IYUV. Réglez la vitesse d'enregistrement sur une image toutes les 0,1 secondes et ajustez la fréquence de lecture correspondante à 10 images par seconde. Enfin, accédez aux paramètres avancés et sélectionnez Créer une image bmp pour chaque image capturée.

Ensuite, accédez au même répertoire que celui que vous avez choisi pour héberger les fichiers AVI et cliquez sur OK. Avant de commencer, assurez-vous que l'îlot est vide et propre. Démarrez ensuite l'enregistrement dans l'interface d'image en lapse de temps du logiciel d'enregistrement d'images.

Prenez un flacon contenant des mouches et tapez-y deux ou trois fois pour faire tomber toutes les mouches au fond. Ensuite, retirez rapidement le bouchon du flacon et tapez énergiquement pour faire tomber les mouches sur la plateforme. Elles doivent toutes atteindre la plateforme à peu près au même moment.

Laisser les mouches jusqu'à 30 secondes pour quitter la plateforme, puis arrêter l'enregistrement. Si nécessaire, retirer manuellement les mouches restantes de la plateforme. Avant de passer à l'expérience suivante, s'assurer de redéfinir le répertoire où le prochain ensemble de données sera stocké.

La première tâche consiste à produire des empilements et des projections des séries d'images collectées. Dans Fiji, ouvrez le Drosophila Island Assay. Dans la nouvelle fenêtre, saisissez l'identifiant de la première série temporelle d'images.

Ensuite, sélectionnez uniquement le sous-macro « create stack and projection ». Cliquez sur OK, puis indiquez à l'ordinateur le dossier contenant tous les sous-dossiers avec les expériences individuelles de l'Island Assay. Après le traitement des données, deux nouveaux fichiers apparaîtront dans chaque sous-dossier expérimental individuel.

La prochaine étape consiste à définir l'emplacement exact de la plateforme sur les images. Ouvrez l'interface graphique et sélectionnez la case à cocher définir la plateforme. Ensuite, choisissez le répertoire où sont stockés les sous-dossiers expérimentaux.

L'image de projection et deux fenêtres s'ouvriront. Sur la première image, dessinez un polygone par-dessus la plateforme insulaire à l'aide de l'outil de sélection polygonale. N'incluez pas la ligne de bordure située à la périphérie de la plateforme dans cette sélection.

Ajouter la sélection à la fenêtre du gestionnaire de ROI en cliquant sur ajouter dans la fenêtre du gestionnaire de ROI. Après avoir ajouté la sélection au gestionnaire de ROI, celle-ci apparaîtra comme un ensemble de valeurs. Ensuite, cliquer sur OK dans la fenêtre définir la plateforme.

Le logiciel passera à l'image de projection suivante stockée dans le dossier. Continuez à appliquer la même région d'intérêt (ROI) pour la plateforme à l'image de projection suivante en sélectionnant la ROI enregistrée dans le gestionnaire de ROI et en confirmant cette ROI dans la fenêtre de définition de la plateforme. Avant de passer à l'image de projection suivante, assurez-vous que la plateforme ne s'est pas déplacée pendant l'expérience.

Si la position de la plateforme a changé, cliquez avec le bouton gauche au centre de la sélection et faites-la glisser jusqu'à la position requise. Si la zone de sélection ne correspond pas à la plateforme, cliquez avec le bouton gauche en dehors de la sélection et délimitez une nouvelle sélection pour la plateforme à l'aide de l'outil polygone. Ajoutez cette nouvelle sélection au gestionnaire de régions d'intérêt (ROI).

Ensuite, vérifiez la nouvelle sélection en cliquant sur « ok » dans la fenêtre de définition de la plateforme, puis poursuivez la procédure jusqu'à ce que toutes les images aient des plateformes correctement définies. La dernière étape avant le traitement des données consiste à définir la taille minimale d'une drosophile. Celle-ci est expliquée dans le protocole textuel.

Pour quantifier les mouches s'échappant de la plateforme, commencez par définir la taille minimale de la mouche. Ensuite, indiquez le nombre maximal de mouches dans un fichier au sein de la série expérimentale. Lancez la fonction d'analyse, puis, à l'invite, sélectionnez le répertoire principal pour l'expérience.

Après avoir exécuté la macro, observez qu'un nouveau fichier de résultats et une nouvelle pile d'images sont apparus dans chaque dossier. Ouvrez ces fichiers pour vous assurer que la procédure a fonctionné correctement. Lancez le logiciel R ou RStudio et ouvrez le script d'analyse de l'essai Island pour traiter toutes les expériences simultanément.

Le script doit être modifié correctement pour que l'analyse réussisse. À la ligne 16 du script, insérez le chemin d'accès au répertoire principal contenant les expériences à analyser. Insérez le chemin d'accès au dossier où les fichiers résultats de l'analyse doivent être stockés à la ligne 19.

Ce dernier doit être un emplacement différent du répertoire contenant les données d'image à analyser. Exécutez maintenant le script à partir de la barre d'outils et passez à l'analyse des résultats. Le script d'analyse de l'îlot exporte un graphique linéaire pour chaque condition expérimentale.

Le graphique montre le pourcentage de mouches restant sur la plateforme en fonction du temps pour chaque répétition de cette condition. Le graphique linéaire exporté, réponse d'échappement : toutes les conditions, résume la moyenne et l'erreur type de la réponse d'échappement en vol pour les 12 premières conditions expérimentales présentes dans le dossier principal. La surface sous la courbe est calculée pour chaque répétition expérimentale afin de déterminer si les conditions expérimentales diffèrent significativement les unes des autres.

La surface sous la courbe et la valeur médiane pour chaque condition expérimentale sont exportées sous forme de graphique. En fonction du nombre de conditions présentes dans le dossier principal, le script effectue soit un test T de Welch non apparié bilatéral pour deux conditions, soit une anova avec deux corrections principales pour plus de deux conditions. Toutes les données numériques calculées par le script d'analyse de l'assay d'îlot sont également exportées et enregistrées sous forme de fichiers csv ou txt dans le dossier de sortie des données.

Les ataxies télangiectasiques sont des troubles du mouvement de transmission autosomique récessive causés par des mutations du gène ATM. La maladie se caractérise par une apparition précoce d'ataxie cérébelleuse. L'effet de l'extinction ubiquitaire de l'orthologue de la drosophile du gène ATM a été examiné dans le test de l'îlot et comparé à des témoins.

Dans l'ensemble, l'extinction ubiquitaire de l'orthologue chez la drosophile du gène ATM, Tefu, a significativement réduit la performance locomotrice dans le test de l'îlot par rapport aux témoins génétiques de fond. L'analyse manuelle des données enregistrées du test de l'îlot a donné le même résultat que l'analyse automatisée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser le test de l'îlot, comment exécuter la macro pour le test de l'îlot chez Drosophila, et comment utiliser le script d'analyse du test de l'îlot.

Lors de la mise en œuvre de ce protocole, il est important de garder à l'esprit que la qualité de la segmentation d'image est corrélée à la qualité des vidéos. Plus le contraste est élevé, plus l'analyse est fluide. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer la capacité locomotrice chez Drosophila en grand volume.

Après avoir utilisé ce test, d'autres tests, tels que ceux qui évaluent la géotaxie négative, peuvent être utilisés pour approfondir l'analyse des défauts locomoteurs.