Name: Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez une méthode d'injection sous-rétinienne assistée par tomographie à cohérence optique haute résolution pour la thérapie génique oculaire chez la souris. Cette technique permet une cartographie précise des sites d'injection et une évaluation quantitative de la vitalité des photorécepteurs en temps réel.

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Ce matériel est basé sur le travail soutenu, en partie, par le ministère des anciens combattants (VA), le Veterans Health Administration, le Bureau de recherche et le développement (laboratoire de recherche biomédicale et le développement) (Bourse de mérite VA 1I01BX000669). JMS travaille, en partie, comme médecin-chercheur, ophtalmologie, VA WNY ; MCB est employé, en partie, par VA WNY. L’étude a été menée à et financée en partie par le système de santé des anciens combattants Administration Western New York (Buffalo, NY). Contenu ne représente pas les vues du ministère des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis. Également pris en charge, en majeure partie, par le NIH/NEI R01 grant EY013433 (PI : JMS), NIH/NEI R24 accorder EY016662 (UB Vision Infrastructure Center, PI : M abattage, directeur - biophotonique Module : JMS), une subvention sans restriction pour le département d’ophtalmologie/Université à Buffalo de la recherche pour prévenir la cécité (New York, NY) et une subvention de la Fondation Oishei (Buffalo, NY). Nous reconnaissons le don de la lignée transgénique desP347S RHOhC1 et la souris de l’exon 1 knockout RHO de Dr Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) et le don du transgène modèle NHR-E à l’état hétérozygote sur le la souris exon 2 RHO knockout fond de Drs G. Jane Farrar et Peter Humphries (Trinity College, Dublin, Irlande).

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<li>Berger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoS One. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+mouse+retinal+layers+using+automated+segmentation+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+images%5BTitle%5D)+AND+%22TVST%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images.</a> TVST. 4 (4), 9(2015).</li>
<li>Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+caspase-12+to+preserve+vision+in+mice+with+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).</li>
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<li>Berger, A., al,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSOne%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).</li>
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Relations commerciales : MCB : None ; JMS : aucun. La rétine imaging system (RIS)23 utilisée dans cette étude est un dispositif novateur d’utilisation importante à n’importe quel groupe qui cherchent à mener des études de livraison de thérapie génique chez des souris, rongeurs ou petits animaux. Bien que les auteurs n’aient aucun conflit de déclarer à l’égard de cet appareil en ce moment, l’Université de SUNY Buffalo - et l’Administration des anciens combattants ont des droits dans la propriété intellectuelle et peut chercher à commercialiser cet instrument à l’avenir.

HR-SD-OCT fournit une méthode simple pour la caractérisation des modèles animaux de maladies humaines afin de déterminer leur utilité dans l’essai thérapeutique possible. La capacité de rapidement et sûrement caractériser un modèle animal de la maladie humaine est essentielle pour le processus de découverte de médicaments thérapeutiques (par exemple, thérapie de remplacement de gène, ribozyme ou shARN défiant thérapie génique, la thérapie génique combinée). HR-SD-OCT fournit une méthode simple, rapide et non inv...

Chercheurs mettent au point des thérapies géniques pour une variété de maladies dégénératives rétiniennes et rétiniennes dans l’espoir de traduire les nouvelles thérapeutiques en traitements pour les maladies humaines1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. domaine temporel ou tomographie en cohérence optique domaine spectral (SD-OCT) a été utilisée pour étudier les aspects de la dégénérescence rétinienne externe dans des modèles de souris spécifiques de maladie12,13,14 . HR-SD-OCT n’a pas, toutefois, été largement utilisé dans le contexte de l’optimisation évaluation de modèles murins pour déterminer le taux et l’uniformité spatiale de dégénérescence rétinienne, ou dans le cadre de l’évaluation préclinique du gène basé thérapeutique, par exemple, à évaluer le sauvetage, la toxicité ou l’étendue spatiale de vecteur livraison8,15,16. Une fois un modèle de souris est entièrement caractérisé, les données RH-SD-OCT peuvent servir comme une ressource informative et fiable pour mesurer l’impact de la thérapeutique à exercer de sauvetage ou toxicité dans des modèles murins de la dégénérescence rétinienne,17. Plusieurs groupes utilisent injection sous-rétinienne comme méthode de livraison de vecteur en raison de son efficacité à transduction des photorécepteurs et les cellules (pre) de l’épithélium pigmentaire rétinien. Toutefois, cela reste une méthode difficile à maîtriser, étant donné qu’il est généralement fait en chirurgie de la main-libre de la surface de la cornée et pose souvent des cataractes, des saignements et des décollements de la rétine involontaires qui se produisent par simple manipulation de la partie postérieure vitrifiée. Beaucoup de groupes encore tente des injections sous-rétinienne aveuglément et livrer le virus en utilisant des injections manuelles avec relativement de grand diamètre en acier inoxydable aiguilles (34G)8,17,18,19 ,20,21,22et quelques usages tomographie par cohérence optique (OCT) imagerie pour confirmer la livraison appropriée de vecteur à la rétine8,17, 20 , 22. quelques améliorations dans la méthode ont été récemment décrites à l’aide d’aiguilles microscale pilotées par un micromanipulateur22.
Nous présentons une approche intégrée qui facilite le positionnement de l’aiguille, et les injections sont facilitées par un ophtalmoscope stéréo dirigé personnalisé, conçu en laboratoire spécialement pour visualiser l’intérieur de le œil petit des souris17, 23. l’utilisation d’aiguilles micro verre tiré en conjonction avec le micromanipulateur stéréotaxique fournissent un meilleur contrôle du placement de l’aiguille avec aucune chirurgie coupé requis (c.-à-d., à travers la conjonctive et du tissu conjonctif) avant injection. L’utilisation de la pression régulée volumes d’injection cohérente d’injecteur micro contribue à livrer, et l’injection peut être faite avec la plus grande stabilité, précision et beaucoup plus lente que les injections manuelles effectuées par une seringue à main, réduisant ainsi la apparition de l’injection de bulles dans le œil. La plus petite aiguille permet d’éviter les fuites après retrait de l’aiguille, car le chemin est hermétique. Pour évaluer l’ampleur de l’injection/livraison, plusieurs groupes d’enquête dépendent de trouver et d’évaluer l’étendue de l’expression de protéines (EGFP) fluorescence verte améliorée dans la rétine (construction d’expression envoyée par le vecteur) à la fin expérimentale pour confirmer les injections réussies11,19,20,24, point (euthanasie). Cette approche (ne pas en utilisant OCT) pour vérifier la réussite chirurgicale gaspille une énorme quantité de ressources temps procédure chirurgicale et des animaux, puisque tous les animaux avec des échecs chirurgicaux (inconnus) doivent être maintenus, a suivi avec des mesures répétées jusqu'à ce que euthanasie et oeil de récolte (lorsque EGFP est mesurée). Confirmation de l’emplacement de l’injection dans la rétine peut être améliorée à l’aide de HR-SD-OCT pour démontrer que l’injection est située entre les couches correctes de la rétine (c'est-à-dire l’espace sous-rétinienne). HR-SD-OCT peut également être utilisé pour délimiter immédiatement les tentatives infructueuses (échecs chirurgicaux) pour déterminer les variables pertinentes en temps réel chirurgical afin d’améliorer l’approche. Nous avons trouvé que HR-SD-OCT offre nombreux avantages gène précliniques études de thérapie en autorisant rapide évaluation quantitative de la dégénérescence rétinienne externe, permettant l’identification/abattage d’animaux, étude qui ne répondent pas aux critères expérimentaux ( par exemple, injection sous-rétinienne incorrecte) et à direct suivi d’imagerie pour la région de le œil où vecteur a été livré (effet préclinique étant probablement) ainsi que le contrôle des régions où vecteur n’a pas remis. Depuis son développement, l’utilisation du SD-OCT a continué à être accepté et utilisé par les chercheurs de l’ophtalmologie et est aujourd'hui considérée comme la norme d’imagerie rétinienne dans des études scientifiques rétiniens de souris ou les rongeurs modèles13,25. HR-SD-OCT et ses capacités de logiciels ont été utilisées de manière intégrée unique pour atteindre son objectif de réussite quantitative génothérapie dans des modèles murins à chaque étape du processus, y compris la sélection de modèle animal, caractérisation de la dégénérescence dans choisie les modèles de maladies, livraison thérapeutique, cartographie des prestation de vecteur et l’évaluation de la toxicité/efficacité. L’utilisation des ressources humaines-SD-OCT permet la découverte de médicaments plus efficace à tous les niveaux du processus. Nous décrivons ici ces approches utilisées dans notre programme de découverte de médicaments de l’ARN.

<table><tbody><tr><td>C57BL6 (J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>N129R-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2HRho 1T/1T</td><td>N/A N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envisu R-2200 Instrument de tomographie par cohérence oculaire (OCT)</td><td>Bioptigen</td><td>90-R2200-U1-120.&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie rétinienne (RIS)</td><td>Microscope interne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000C</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Extracteur de micropipettes flamboyant/brun</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>p-97</td><td></td></tr><tr><td>MMN-33 micromanipulateur&nbsp ;</td><td>Narishige USA</td><td>MMN-33</td><td></td></tr><tr><td>PLI-100&nbsp ; micro-injecteur</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1736</td><td></td></tr><tr><td>Porte-micropipette (rotatif)</td><td>Interne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Storage Receptacle</td><td>World Precision Instruments Inc.</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Tubes capillaires en verre borosilicaté 1,5-1,8 X 100 mm,&nbsp ;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0053</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-tribromoéthanol</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alcool Tert-amylique</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>240486-100ML</td><td></td>Sulfate d’atropine</tr><tr><td>Solution ophtalmique, USP 1 %</td> <td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-215-05</td><td></td></tr><tr><td>Goniovisc</td><td>BioVision Limited</td><td>NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>Solution ophtalmique de chlorhydrate de cyclopentolate, USP&nbsp ; 2 %</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-097-10</td><td></td></tr><tr><td>Pommade au sulfate de gentamicine USP, 0,1 %</td><td>Perigo</td><td>NDC 45802-046-35</td><td></td></tr><tr><td>Systane Ultra</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>9006619-1013</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracaïne</td><td>Bausch et Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>Solution ophtalmique, USP 0,5 %</td> <td>Bausch et Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Préparations virales</td><td>ViGene /UNC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanotiges d’or</td><td>NANOPARTz</td><td>D12M-850-1.75</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de fluorescéine AK-FLUOR 25 %</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-250-20</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Milton</td><td>18-825</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 30 gauge</td><td>Beckton Dickenson&nbsp ; &nbsp ;</td><td>W11604</td><td></td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Beckton Dickenson&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Progiciel Bioptigen Bioptigen</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solution ophtalmique de chlorhydrate de proparacaïne, USP 0,5 %</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-263-12</td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échelle</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poinçon</td><td>d’oreille Nat' l band</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CL 100 Source lumineuse</td><td>Welch Allyn</td><td>CL100</td><td></td></tr><tr><td>Azote gazeux</td><td>Jackson Soudage Alimentation</td><td>N/A Bain-marie</td><td></td></tr><tr><td>chauffé</td><td>Neslab</td><td>RTE-140</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>In House</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tapis chauffant</td><td>Cincinnatti Sub Zero</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Porte-souris en argile</td><td>Plast.i.clay American Art Clay Co.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>MedLine&nbsp ;</td><td>NDC53329-938-06</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs d’embouts en coton</td><td>American Health Service</td><td>Ctag</td><td></td></tr><tr><td>EtOH 70 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>Gants Nitrile</td><td>VWR</td><td>89038-272</td><td></td></tr><tr><td>Diagnosys ERG Color Dome instrument</td><td>Diagnosys Inc.</td><td>D125</td><td></td></tr><tr><td>Lentilles de contact</td><td>Interne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Diagnosys Software</td><td>Diagnosys Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Origin 6.1</td><td>OriginLab Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Électrodes de référence</td><td>Ocuscience</td><td>F-Thread Electrode (DTL) 24"</td><td></td></tr></tbody></table>

tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT est utilisé pour surveiller la progression de la dégénérescence des photorécepteurs dans des modèles de souris vivante, évaluer l’administration d’agents thérapeutiques dans l’espace sous-rétinienne et d’évaluer la toxicité et l’efficacité le in vivo. HR-SD-OCT utilise près de lumière infrarouge (800-880 nm) et a l’optique spécialement conçu pour l’unique optique de le œil de souris avec résolution axiale sub-2-micron. Modèles de souris transgéniques de dégénérescence rétinienne externe (photorécepteurs) et les contrôles ont été imagées pour évaluer la progression de la maladie. Verre tiré des micro-aiguilles servaient à administrer des injections rétinienne de sup d’adeno-associated virus (AAV) ou de nanoparticules (NP) via une approche trans-sclérale et trans-choroïdienne. Attention, positionnement de l’aiguille dans l’espace sous-rétinienne était nécessaire avant une injection pression calibrée, qui délivre le fluide dans l’espace rétinienne sub. Temps réel sous-rétinienne chirurgie a été réalisée sur notre rétine imaging system (RIS). HR-SD-OCT a démontré la dégénérescence rétinienne progressive uniforme en raison de l’expression d’un humain mutant mutante rhodopsine toxique (P347S) transgène (RHOP347S) chez la souris. HR-SD-OCT permet une quantification rigoureuse de toutes les couches des rétiniens. Couche nucléaire externe (ONL) épaisseur et photorécepteur segment externe (OSL) mesures de longueur sont corrélés avec la vitalité des photorécepteurs, dégénérescence ou de sauvetage. Le système de largage RIS permet une visualisation en temps réel des injections sous-rétinienne dans néonatale (~ P10-14) ou de souris adultes et HR-SD-OCT immédiatement détermine le succès de la livraison et cartes étendue aréale. HR-SD-OCT est un outil puissant capable d’évaluer le succès de la chirurgie sous-rétinienne chez la souris, en outre de mesurer la vitalité des photorécepteurs in vivo. HR-SD-OCT permet également d’identifier des cohortes animales uniformes pour évaluer le degré de dégénérescence rétinienne, la toxicité et sauvetage thérapeutique dans des études de recherche de thérapie génique préclinique.

Évaluer la présence, la taux et l’homogénéité de dégénérescence rétinienne externe modèle Mesures de l’ONL ont été enregistrés entre l’OPL et l’orme, définissant les limites de l’ONL en utilisant l’outil de l’étrier fourni dans le logiciel de l’instrument. Le but était de cartographier la progression de la dégénérescence rétinienne externe dans un modèle murin de PACA partiellement humanisés. Des images comparables d’un contrôle de la souris C57BL/6(J) et un mWT hC1/hC...

Nous démontrons une nouvelle approche à l’utilisation de tomographie à cohérence optique domaine spectral haute résolution (HR-SD-OCT) pour aider l’administration d’agents de thérapie génique dans l’espace sous-rétinienne, évaluer sa couverture areal et caractériser la vitalité des photorécepteurs.

Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

L’objectif global de cette procédure d’injection subrétinienne est de délivrer un vecteur à la rétine d’une manière mini-invasive et reproductible qui est observable en temps réel. Bonjour, cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans la recherche en thérapie génique sur l’efficacité de la livraison vectorielle et la toxicité des agents thérapeutiques. Certains avantages de cette technique incluent des dommages minimes à la rétine et à d’autres structures oculaires, une cartographie précise du site d’injection et des mesures quantitatives rigoureuses in vivo qui permettent une inférence statistique solide.Pour l’injection transgénique intraoculaire, placez d’abord une souris anesthésiée sur le stade d’observation d’un microscope du système d’imagerie rétinienne et placez les extrémités d’un iris émoussé stérile aux positions de sept et dix heures de la paupière tout en poussant les forceps ouverts et vers le bas pour induire doucement la proptose. Utilisez les forceps pour amadouer les paupières sous le globe oculaire et diriger la pointe de l’aiguille à environ un à 1,5 millimètre sous le bord du limbe cornéen. Ensuite, appliquez une goutte de solution stérile PBS à l’œil et couvrez l’œil avec un glissement stérile de couverture.Conduisez soigneusement l’aiguille dans l’œil à travers la conjonctive jusqu’à ce qu’une dépression scléricaale soit créée. Utilisez le micro manipulateur pour faire pivoter l’œil vers le haut jusqu’à ce que la dépression scléricane soit au point, puis conduisez l’aiguille vers l’avant pour créer un pic pointu dans la rétine avec le bout de l’aiguille. À l’aide du porte-aiguille, faire pivoter l’aiguille jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille passe par la sclère et l’EPR, ce qui permet à la farine dans le bout de l’aiguille d’être visible sous le tissu rétinien à proximité immédiate de l’espace subrétinien et du monocouche cellulaire d’épithélium pigmentaire rétinien.Conduisez la pointe de l’aiguille vers le bas de sorte qu’elle soit tangentielle au globe, puis activez la pompe d’injection avec l’interrupteur de pédale de pied. Après que 0,5 à un microlitres de solution transgénique a été livré à l’espace subretinal, retirez l’aiguille et confirmez que le sang est stable et que le fluide ne fuit pas hors du site du tractus d’injection. Pour confirmer le succès de l’injection, enregistrez un oct volume rectangulaire et comparez les images aux images des différents types de résultats d’injection potentiels.Après confirmation du placement approprié d’injection, utilisez cette image rectangulaire d’OCT pour cartographier l’étendue du bleb sur l’image de fundus. Pour cartographier l’étendue du bleb subretinal, ouvrez une image oct de volume rectangulaire de la bleb de telle sorte qu’un repère reconnaissable dans l’oeil soit inclus dans l’image. Ajoutez autant d’étriers que nécessaire pour identifier la position des bords gauche et droit du balayage B, ainsi que la tête du nerf optique, ONH, si elle est présente, et le point d’inflexion où la rétine se détache de l’EPR et choroïde, puis enregistrer les données.Compilez ensuite les fichiers enregistrés et tracez les données, créant efficacement une carte de l’injection bleb sur l’image OCT en face. Superposez les données tracées sur l’image fundus contenant le site d’injection et enregistrez l’image fusionnée. Utilisez cette image pour localiser les régions d’intérêt lors de l’imagerie OCT de suivi.Pour évaluer la dégénérescence rétinienne post-injection, ouvrez d’abord une image de volume rectangulaire à haute résolution enregistrée oct ou HRSD OCT et sélectionnez un balayage B à mesurer. Magnifiez l’image sélectionnée jusqu’à ce qu’elle remplisse l’écran et cliquez à droite sur l’image. Cliquez sur les étriers pour sélectionner le nombre approprié d’étriers, puis utilisez la fonction d’étrier de configuration pour assigner les étriers comme verticale dans la colonne de bloc d’angle et activer l’emplacement de l’étrier d’affichage pour faciliter le placement uniforme de l’étrier sur la rétine.Cliquez sur appliquer et déplacer chaque étrier à l’endroit approprié 0,1 à 0,2 millimètres de distance à travers le balayage B, en prenant soin de placer un étrier dans le centre de la tête du nerf optique, le cas échéant. Lorsque tous les étriers ont été placés, cliquez et faites glisser chaque étrier sur la longueur de la région d’intérêt, en fixant arbitrairement les étriers qui ne superposent pas les régions mesurables de l’analyse B à la longueur maximale. Pour mesurer l’épaisseur extérieure de la couche nucléaire, placez le dessus de chaque étrier à la membrane limite externe et le fond de chaque étrier au bas de la couche plexiforme externe à des incréments de 0,1 à 0,2 millimètre sur la rétine.Après que tous les étriers ont été placés et ajustés à la taille, cliquez à droite sur l’image et cliquez enregistrer les données de l’étrier » puis répéter les mesures comme juste démontré pour chaque dixième de balayage B, en gardant les étriers ouverts et au même endroit sur l’axe x et ajuster les longueurs des étriers si nécessaire, sans les déplacer dans la x-direction. Lorsque toutes les analyses ont été mesurées, ouvrez les fichiers de données enregistrés et cliquez sur la date modifiée « pour organiser les fichiers en fonction du temps gagné. Ouvrez tous les fichiers pour chaque analyse B mesurée et compilez les données brutes de chaque analyse B dans un seul fichier du nombre d’images le plus bas au plus élevé et sélectionnez les colonnes de données, y compris le nom de l’étrier, la longueur et les colonnes X centrale.Assurez-vous que le centre X est le même pour toutes les analyses B mesurées pour chaque image OCT de volume rectangulaire traitée et supprimez toutes les données des étriers qui n’ont pas été utilisés pour enregistrer les mesures. Réglez l’étrier situé au centre de la tête du nerf optique à zéro et tracez les données pour X par rapport à plusieurs ensembles de données Y pour obtenir une fonction de parcelle 3D pour l’épaisseur de la couche nucléaire externe ou toute autre couche rétinienne mesurée. Comparez ensuite les mesures externes de la couche nucléaire entre les animaux de contrôle et les animaux expérimentaux avec les âges correspondants afin de déterminer le taux et l’uniformité de toute dégénérescence rétinienne potentielle.Pour la cartographie 3D des mesures rétiniennes, examinez les images oct post-injection et notez les repères identifiables, puis positionnez l’animal pour obtenir une image SDO CT de suivi de la même région, en prenant soin d’inclure les mêmes repères identifiables, et de traiter les images enregistrées comme nous venons de le démontrer. Il est très important d’obtenir des images oct de haute qualité qui comprennent des repères identifiables pour faciliter la réinvention des régions rétiniennes précédemment injectées. Afin de mesurer les changements dans la longueur du système d’exploitation, des étriers ont été placés de la membrane limite externe à la membrane Brooks, ce qui permet des mesures fiables puisque ces couches sont facilement identifiables dans les images OCT.Les différences dans les mesures entre ces couches de différentes lignées de souris ont été attribuées à des longueurs de segment externes plus courtes. Si l’injection subretinale est effectuée avec succès, l’ouverture de l’espace subretinal induit la production d’un bleb qui peut être clairement visualisé à la fois dans la vue en face de l’imageur HRSD OCT et dans les images de balayage B. La superposation de la carte frontalière du site d’injection permet la segmentation des mesures des tissus rétiniens et des ensembles de données sur la position de l’étrier afin de permettre des tests statistiques ultérieurs des effets d’agents thérapeutiques spécifiques sur la dégénérescence rétinienne.Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en dix minutes si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder l’environnement chirurgical propre et stérile. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie génique pour surveiller l’ensemble du processus d’injection chirurgicale subrétinent en temps réel et a créé un moyen de déterminer immédiatement le succès chirurgical in vivo.À la suite de cette procédure d’injection, l’OCT et d’autres méthodes comme la rétinographie électro peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur le sauvetage fonctionnel transgénique et/ou la toxicité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension comment effectuer des injections subrétiniennes transscleral et transchoroidal, comment cartographier l’étendue de la bêle d’injection sur l’OCT à partir de cette image, et obtenir des mesures rigoureuses des couches rétiniennes externes. N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs de thérapie génique peut être dangereux et que des précautions, comme le port de l’équipement de protection individuelle approprié, doivent toujours être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.

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Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

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Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne (Vidéo) | JoVE Journal

Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne

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