Tomographie à cohérence optique souris ultra haute résolution pour faciliter l’Injection intraoculaire dans la recherche de la thérapie génique rétinienne

L’objectif global de cette procédure d’injection subrétinienne est de délivrer un vecteur à la rétine d’une manière mini-invasive et reproductible qui est observable en temps réel. Bonjour, cette méthode peut être utilisée pour répondre à des questions clés dans la recherche en thérapie génique sur l’efficacité de la livraison vectorielle et la toxicité des agents thérapeutiques. Certains avantages de cette technique incluent des dommages minimes à la rétine et à d’autres structures oculaires, une cartographie précise du site d’injection et des mesures quantitatives rigoureuses in vivo qui permettent une inférence statistique solide.

Pour l’injection transgénique intraoculaire, placez d’abord une souris anesthésiée sur le stade d’observation d’un microscope du système d’imagerie rétinienne et placez les extrémités d’un iris émoussé stérile aux positions de sept et dix heures de la paupière tout en poussant les forceps ouverts et vers le bas pour induire doucement la proptose. Utilisez les forceps pour amadouer les paupières sous le globe oculaire et diriger la pointe de l’aiguille à environ un à 1,5 millimètre sous le bord du limbe cornéen. Ensuite, appliquez une goutte de solution stérile PBS à l’œil et couvrez l’œil avec un glissement stérile de couverture.

Conduisez soigneusement l’aiguille dans l’œil à travers la conjonctive jusqu’à ce qu’une dépression scléricaale soit créée. Utilisez le micro manipulateur pour faire pivoter l’œil vers le haut jusqu’à ce que la dépression scléricane soit au point, puis conduisez l’aiguille vers l’avant pour créer un pic pointu dans la rétine avec le bout de l’aiguille. À l’aide du porte-aiguille, faire pivoter l’aiguille jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille passe par la sclère et l’EPR, ce qui permet à la farine dans le bout de l’aiguille d’être visible sous le tissu rétinien à proximité immédiate de l’espace subrétinien et du monocouche cellulaire d’épithélium pigmentaire rétinien.

Conduisez la pointe de l’aiguille vers le bas de sorte qu’elle soit tangentielle au globe, puis activez la pompe d’injection avec l’interrupteur de pédale de pied. Après que 0,5 à un microlitres de solution transgénique a été livré à l’espace subretinal, retirez l’aiguille et confirmez que le sang est stable et que le fluide ne fuit pas hors du site du tractus d’injection. Pour confirmer le succès de l’injection, enregistrez un oct volume rectangulaire et comparez les images aux images des différents types de résultats d’injection potentiels.

Après confirmation du placement approprié d’injection, utilisez cette image rectangulaire d’OCT pour cartographier l’étendue du bleb sur l’image de fundus. Pour cartographier l’étendue du bleb subretinal, ouvrez une image oct de volume rectangulaire de la bleb de telle sorte qu’un repère reconnaissable dans l’oeil soit inclus dans l’image. Ajoutez autant d’étriers que nécessaire pour identifier la position des bords gauche et droit du balayage B, ainsi que la tête du nerf optique, ONH, si elle est présente, et le point d’inflexion où la rétine se détache de l’EPR et choroïde, puis enregistrer les données.

Compilez ensuite les fichiers enregistrés et tracez les données, créant efficacement une carte de l’injection bleb sur l’image OCT en face. Superposez les données tracées sur l’image fundus contenant le site d’injection et enregistrez l’image fusionnée. Utilisez cette image pour localiser les régions d’intérêt lors de l’imagerie OCT de suivi.

Pour évaluer la dégénérescence rétinienne post-injection, ouvrez d’abord une image de volume rectangulaire à haute résolution enregistrée oct ou HRSD OCT et sélectionnez un balayage B à mesurer. Magnifiez l’image sélectionnée jusqu’à ce qu’elle remplisse l’écran et cliquez à droite sur l’image. Cliquez sur les étriers pour sélectionner le nombre approprié d’étriers, puis utilisez la fonction d’étrier de configuration pour assigner les étriers comme verticale dans la colonne de bloc d’angle et activer l’emplacement de l’étrier d’affichage pour faciliter le placement uniforme de l’étrier sur la rétine.

Cliquez sur appliquer et déplacer chaque étrier à l’endroit approprié 0,1 à 0,2 millimètres de distance à travers le balayage B, en prenant soin de placer un étrier dans le centre de la tête du nerf optique, le cas échéant. Lorsque tous les étriers ont été placés, cliquez et faites glisser chaque étrier sur la longueur de la région d’intérêt, en fixant arbitrairement les étriers qui ne superposent pas les régions mesurables de l’analyse B à la longueur maximale. Pour mesurer l’épaisseur extérieure de la couche nucléaire, placez le dessus de chaque étrier à la membrane limite externe et le fond de chaque étrier au bas de la couche plexiforme externe à des incréments de 0,1 à 0,2 millimètre sur la rétine.

Après que tous les étriers ont été placés et ajustés à la taille, cliquez à droite sur l’image et cliquez enregistrer les données de l’étrier » puis répéter les mesures comme juste démontré pour chaque dixième de balayage B, en gardant les étriers ouverts et au même endroit sur l’axe x et ajuster les longueurs des étriers si nécessaire, sans les déplacer dans la x-direction. Lorsque toutes les analyses ont été mesurées, ouvrez les fichiers de données enregistrés et cliquez sur la date modifiée « pour organiser les fichiers en fonction du temps gagné. Ouvrez tous les fichiers pour chaque analyse B mesurée et compilez les données brutes de chaque analyse B dans un seul fichier du nombre d’images le plus bas au plus élevé et sélectionnez les colonnes de données, y compris le nom de l’étrier, la longueur et les colonnes X centrale.

Assurez-vous que le centre X est le même pour toutes les analyses B mesurées pour chaque image OCT de volume rectangulaire traitée et supprimez toutes les données des étriers qui n’ont pas été utilisés pour enregistrer les mesures. Réglez l’étrier situé au centre de la tête du nerf optique à zéro et tracez les données pour X par rapport à plusieurs ensembles de données Y pour obtenir une fonction de parcelle 3D pour l’épaisseur de la couche nucléaire externe ou toute autre couche rétinienne mesurée. Comparez ensuite les mesures externes de la couche nucléaire entre les animaux de contrôle et les animaux expérimentaux avec les âges correspondants afin de déterminer le taux et l’uniformité de toute dégénérescence rétinienne potentielle.

Pour la cartographie 3D des mesures rétiniennes, examinez les images oct post-injection et notez les repères identifiables, puis positionnez l’animal pour obtenir une image SDO CT de suivi de la même région, en prenant soin d’inclure les mêmes repères identifiables, et de traiter les images enregistrées comme nous venons de le démontrer. Il est très important d’obtenir des images oct de haute qualité qui comprennent des repères identifiables pour faciliter la réinvention des régions rétiniennes précédemment injectées. Afin de mesurer les changements dans la longueur du système d’exploitation, des étriers ont été placés de la membrane limite externe à la membrane Brooks, ce qui permet des mesures fiables puisque ces couches sont facilement identifiables dans les images OCT.

Les différences dans les mesures entre ces couches de différentes lignées de souris ont été attribuées à des longueurs de segment externes plus courtes. Si l’injection subretinale est effectuée avec succès, l’ouverture de l’espace subretinal induit la production d’un bleb qui peut être clairement visualisé à la fois dans la vue en face de l’imageur HRSD OCT et dans les images de balayage B. La superposation de la carte frontalière du site d’injection permet la segmentation des mesures des tissus rétiniens et des ensembles de données sur la position de l’étrier afin de permettre des tests statistiques ultérieurs des effets d’agents thérapeutiques spécifiques sur la dégénérescence rétinienne.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en dix minutes si elle est effectuée correctement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de garder l’environnement chirurgical propre et stérile. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie génique pour surveiller l’ensemble du processus d’injection chirurgicale subrétinent en temps réel et a créé un moyen de déterminer immédiatement le succès chirurgical in vivo.

À la suite de cette procédure d’injection, l’OCT et d’autres méthodes comme la rétinographie électro peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur le sauvetage fonctionnel transgénique et/ou la toxicité. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension comment effectuer des injections subrétiniennes transscleral et transchoroidal, comment cartographier l’étendue de la bêle d’injection sur l’OCT à partir de cette image, et obtenir des mesures rigoureuses des couches rétiniennes externes. N’oubliez pas que travailler avec des vecteurs de thérapie génique peut être dangereux et que des précautions, comme le port de l’équipement de protection individuelle approprié, doivent toujours être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.