Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

L’objectif général de cette procédure expérimentale est d’évaluer la pathogenèse, les réponses humorales et l’efficacité de la protection induites par les virus de type sauvage de la grippe A ou les vaccins antigrippaux à l’aide d’un modèle murin d’infection. Cette méthode peut aider à répondre aux questions sur la biologie des virus de la grippe A, telles que la pathogenèse virale, les réponses immunitaires et l’efficacité des vaccins antigrippaux ainsi que des antivirus. Le principal avantage de cette technique est que la souris a un système immunitaire similaire à celui des humains et que plusieurs souches sont disponibles qui peuvent être exploitées pour évaluer la base génétique des infections par le virus de la grippe A.

Car cette méthode peut donner un aperçu de l’efficacité des nouveaux vaccins contre la grippe, elle peut également être appliquée à des systèmes plus anciens tels que l’évaluation de traitements antiviraux potentiels, y compris les anticorps ou les médicaments. Après avoir élevé et marqué des souris C57B6 âgées de six à huit semaines dans des conditions exemptes d’agents pathogènes et préparé des dilutions du virus de la grippe A ou de l’IAV dans des conditions aseptiques. Utilisez une balance pour peser les souris et noter le poids.

Une fois qu’une souris est anesthésiée et que la profondeur de l’anesthésie a été vérifiée conformément au protocole de texte, placez la souris en position couchée dorsale. Insérez une pointe de pipette contenant 30 microlitres de l’inoculum viral dans la narine et éjectez lentement, mais constamment, la solution. Pour évaluer la morbidité et la mortalité, infectez trois à quatre groupes de souris femelles avec 10 doses complètes de type sauvage PR8 comme décrit dans le protocole de texte.

Surveillez et pesez les souris au cours des 14 prochains jours, à peu près au même moment pour minimiser les variations de poids dues à l’ingestion de nourriture. Après euthanasie des animaux qui ont survécu à l’infection virale et calcul de la dose létale virale de 50 % chez la souris ou MLD50 selon le protocole textuel. Infectez des souris femelles âgées de six à huit semaines avec des doses virales de 10 à 10 à la quatrième unité fluorescente ou FFU de type sauvage PR8.

Les deuxième et quatrième jours, pour prélever les poumons et la muqueuse nasale de la souris pour évaluation. Après avoir euthanasié les animaux, placez un animal en position couchée dorsale et utilisez de l’éthanol à 70 % pour désinfecter la fourrure sur le thorax. Utilisez des ciseaux pour couper la peau de la base de l’abdomen au sternum.

Ensuite, avec des ciseaux, faites des coupes d’un centimètre de la base de l’incision aux parties latérales de la souris. Retirez la peau de toute la partie supérieure de la souris jusqu’à la base de l’abdomen où la première incision a été pratiquée. Ensuite, utilisez les ciseaux pour couper la tête et placez-la dans une boîte de Pétri sèche et stérile.

Utilisez des ciseaux pour couper les jonctions entre le maxillaire et la mandibule et jetez la mandibule. Ensuite, avec les ciseaux, faites deux entailles aux extrémités des arcs zygomatiques et retirez-les. Utilisez une pince à dissection pour enlever les yeux.

Ensuite, à l’aide de la pince de dissection, tenez le crâne et utilisez un scalpel pour couper le crâne le long de la suture sagittale. Soulevez les deux moitiés du crâne avec le cerveau pour voir la muqueuse nasale. À l’aide du scalpel, coupez la partie du crâne avec le cerveau et jetez-la.

Placez le reste du crâne avec la muqueuse nasale dans un tube stérile. Conservez le tube sur de la glace si les échantillons sont traités le jour même ou congelez-le rapidement sur de la glace sèche si les échantillons seront traités plus tard. Pour éviter la contamination des échantillons, utilisez un désinfectant au dioxyde de chlore, pour nettoyer et désinfecter les outils de dissection entre chaque tissu récupéré et entre chaque dissection animale.

Ensuite, pour recueillir les poumons, placez l’animal en position couchée dorsale et utilisez des ciseaux pour couper la plura. En commençant à la base de la cage thoracique, utilisez des ciseaux pour couper les côtes d’un centimètre des deux côtés du sternum jusqu’à la partie supérieure des côtes. Faites une section transversale avec les ciseaux entre les deux incisions dans la partie supérieure de la cage thoracique et retirez la poitrine.

Tenez les poumons avec la pince, faites une incision à l’extrémité de la trachée juste avant les poumons et mettez les poumons dans un tube stérile. Placez les poumons ou la muqueuse nasale dans un homogénéisateur stérile et ajoutez un millilitre de milieu d’infection par le rhume. Homogénéisez l’échantillon en déplaçant le pilon de haut en bas pendant environ une minute à température ambiante jusqu’à ce que les poumons soient complètement perturbés.

Mettez l’échantillon homogénéisé dans un tube stérile. Centrifuger les échantillons à 300 x G pendant cinq à 10 minutes à température ambiante. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube stérile et jeter la pastille.

Conservez le surnageant à quatre degrés Celsius si le titrage viral est effectué le même jour. La veille du titrage, ensemencez des plaques de 96 puits avec des cellules épithéliales MDCK dans un milieu de culture tissulaire afin qu’elles atteignent environ 80 à 90 % de confluence. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Pour préparer une à 10 dilutions des échantillons homogénéisés de la muqueuse pulmonaire ou nasale, ajoutez 90 microlitres de milieu infectieux dans chacun des puits d’une plaque à 96 puits. Ajouter 10 microlitres de surnageant de l’un des échantillons homogénéisés dans les puits A1, A2 et A3, pour évaluer le titre viral de chaque échantillon et tripliquer. Ensuite, ajoutez 10 microlitres d’un autre surnageant des échantillons homogénéisés dans les puits, A4, A5 et A6. Après avoir ajouté le surnageant de l’échantillon à la rangée A, utilisez une pipette multicanaux pour mélanger en pipetant de haut en bas.

Transférez 10 microlitres de la rangée A à la rangée B et mélangez bien. Changez les pointes entre les dilutions et répétez le transfert de la rangée B à la rangée C et continuez de la même manière jusqu’à ce que vous atteigniez la dernière rangée, H. À l’aide d’un adaptateur multicanal d’aspirateur à vide, retirez le milieu de culture tissulaire des cellules MDCK dans les plaques à 96 puits et utilisez 100 microlitres par puits de 1x PBS pour laver les cellules deux fois. En commençant par les dilutions les plus élevées et en passant aux dilutions inférieures, transférez 50 microlitres par puits du surnageant dilué en série des échantillons homogénéisés vers la plaque à 96 puits des cellules MDCK, en transférant les dilutions les plus élevées de la rangée H à la rangée A des cellules.

Placez la plaque à 96 puits sur une plate-forme à bascule pendant une heure à température ambiante pour permettre l’absorption virale. Ensuite, à l’aide d’un adaptateur multicanal d’aspirateur sous vide, retirez l’inoculum et ajoutez 100 microlitres par puits de milieu post-infection. Incuber les cellules infectées pendant huit heures dans un incubateur à 33 degrés Celsius ou un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Procédez à la fixation, à la coloration, à l’imagerie et au calcul du titre viral comme décrit dans le protocole texte. Dans cette expérience, des souris ont été infectées avec différentes doses de PR8 de type sauvage. Le poids corporel et la survie de cinq souris par groupe ont été mesurés 14 jours après l’infection.

Les souris immunisées avec un FFU plus élevé de type sauvage PR8 ont perdu du poids plus rapidement et plus sévèrement et toutes sont mortes en conséquence. Le MLD50 de type sauvage PR8 dans cette expérience, calculé avec la méthode du roseau et du muench, était de 1,5 x 10 à la seconde FFU. Pour analyser les réponses humorales induites contre l’infection IV, 14 jours après l’immunisation, des souris ont été saignées pour analyser la présence d’anticorps contre les protéines virales totales et la présence d’anticorps neutralisants ciblant la protéine HA virale, à l’aide d’une inhibition de l’hémoagglutination ou HAI et d’un test de microneutralisation virale ou VN.

Comme on le voit ici, les résultats de l’essai indiquent que les sérums des souris immunisées avec une dose plus élevée de virus grippal vivant atténué (VVAI) avaient des titres d’anticorps plus élevés contre les protéines totales PR8 que les sérums des souris immunisées avec une dose plus faible. À l’aide des tests HAI et VN, les sérums de souris ayant reçu la plus grande quantité de VVAI PR8 avaient un titre plus élevé d’anticorps neutralisants, tandis que le sérum d’une souris immunisée avec la dose la plus faible avait le titre le plus faible d’anticorps neutralisants contre le PR8. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter les souris avec les virus de la grippe A, de la façon de les évaluer par leur pathogenèse, leurs réponses humorales et immunitaires et leur bioréplication dans les voies respiratoires supérieures et inférieures.

Après sa mise au point, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du virus de la grippe A pour explorer la pathogénicité, l’immunogénicité et l’efficacité protectrice des vaccins à anticorps vivants, en utilisant un modèle murin d’infection.