Name: Coloration immunofluorescente in situ de lautophagie dans les cellules souches musculaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Apprenez une technique de coloration immunofluorescente pour détecter l'autophagie dans les cellules souches musculaires de souris C57BL/6. Cette méthode permet de surveiller le processus autophagique dans les muscles intactes et blessés.

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Les souris ont été élevées et entretenues selon les procédures standard de l&#39;installation animale et tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par l&#39;Assurance du bien-être animal et le Comité éthique interne de recherche animale selon le ministère italien de la Santé et ont respecté le Guide NIH pour le soin et l&#39;utilisation de Animaux de laboratoire. 1. Blessure musculaire et le bloc in vivo de flux autophagique <ol><li> Blessure musculaire. <ol><li> Pour induire une lésion musculaire squelettique aiguë, injecter 20 μL de cardiotoxine 10 μM (CTX) directement dans le muscle tibial antérieur (TA) de souris C57BL / 6J de 2 mois qui pèsent environ 20 g. Utilisez un nombre égal de mâles et de femelles. Utiliser le membre contralatéral non perturbé comme témoin. REMARQUE: 10 μM de CTX dans une solution de chlorure de sodium à 0,9% doivent être filtrés (filtre PVDF 0,22 μm) et stockés à -20 ° C. Évitez les cycles répétés de congélation-décongélation. </li><li> À l&#39;aide d&#39;un iSeringue nsulin avec une aiguille 30 G, injecter CTX au milieu de la TA. Pour provoquer une blessure précise dans l&#39;AT, assurez-vous que l&#39;aiguille de la seringue entre dans le tendon distal, à 5 mm de profondeur, du bas vers le haut du muscle ( figure 1A ). </li></ol></li><li> Blocage du flux autophagique chez les souris non perturbées et blessées. <ol><li> Pour évaluer le flux autophagique, 24 h post-blessure (pi), administrer 50 mg / kg de chloroquine (CLQ) toutes les 24 h pendant 4 jours par injection intraperitoneale (IP) ( Figure 1B ). <ol><li> Dissoudre CLQ (10 mg / mL) dans PBS 1X et filtrer à travers une membrane de 0,2 μm. Pesez chaque souris et calculez la quantité de CLQ à injecter. REMARQUE: Préparez et utilisez la solution CLQ le même jour. Le stock CLQ peut être stocké jusqu&#39;à un mois à -20 ° C. Étant donné que l&#39;autophagie est un processus métabolique, procédez toujours au traitement CLQ toujours au même moment ( c.- à - d. Le matin befoÀ 10 heures du matin). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Sections de tissus musculaires <ol><li> Le sacrifice de la souris. <ol><li> Éuthaniser les souris 5 jours après la blessure. </li><li> Effectuer l&#39;euthanasie par dislocation cervicale ou par CO 2 (à suivre par dislocation cervicale pour confirmation). Étant donné que le processus d&#39;autophagie est lié aux habitudes de sommeil / alimentation de la souris, sacrifiez toujours les souris en même temps, de préférence le matin ( c.-à-d. Avant 10 h). </li></ol></li><li> Isolation et inclusion de TA. <ol><li> Avant la dissection, pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> L&#39;utilisation de ciseaux fait une petite incision perpendiculaire (3 mm de long) sur la peau dorsale de la souris au niveau des hanches. Coupez la queue et les pieds pour simplifier l&#39;élimination de la peau. Tirez la peau vers la queue et retirez-la pour exposer les muscles sous-jacents; Le muscle TA est facile à localiser, comme le montre la figure 2A </Forte&gt;. </li><li> Avec l&#39;aide de deux pinces, saisissez les tendons distal. </li><li> Couper les tendons distal; Les tendons TA et extensor digitorium longus (EDL) sont souvent coupés conjointement et ensuite séparés (voir étape 2.2.6). </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pince, maintenez le muscle AT par le tendon et tirez soigneusement le muscle vers l&#39;extrémité proximale (près du genou, figure 2B ). NOTE: À ce stade, les muscles EDL et TA sont facilement reconnaissables, le TA étant plus grand et plus superficiel que l&#39;EDL. </li><li> Séparez la TA du muscle EDL en tirant les deux tendons distal dans les directions opposées ( Figure 2C ). </li><li> Couper le tendon proximal. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pince, retirez le fascia mince qui recouvre le muscle, sans endommager le tissu. </li><li> Retirer l&#39;humidité excessive dans l&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;une serviette en papier. Assurez-vous que le muscle n&#39;est ni humide, ni excessivement sec, car l&#39;humidité excessive produira des signesUn dommage important au muscle et compromet la prochaine coloration. </li><li> Placez le composé de température optimale de coupe (OCT) au bas d&#39;un moule et placez le muscle dans celui-ci, dans l&#39;orientation indiquée sur la figure 2D . Ajouter 100% d&#39;isopentane à un bécher jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne une profondeur d&#39;environ 3-4 cm. Placez le bécher en contact avec de l&#39;azote liquide dans une boîte en polystyrène. </li><li> Ne laissez pas l&#39;azote liquide entrer dans le bécher, car il produira une mousse bouillonnante, qui peut affecter l&#39;inclusion et endommager les sections musculaires. </li><li> Observez l&#39;isopentane et attendez jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la température appropriée (entre -140 ° C et -150 ° C); À la température appropriée, une couche blanche solide d&#39;isopentane congelé cristallisera au fond du bécher. </li><li> Si l&#39;isopentane gèle entièrement le solide, fondre et refroidir à la température de congélation avant de passer à l&#39;étape suivante. </li><li> À l&#39;aide de pinces préchauffées, abaisser délicatement le moule dansL&#39;isopentane pendant environ 20 à 30 s. Placez l&#39;échantillon congelé dans un récipient avec de la glace carbonique jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit transféré à un congélateur de -80 ° C. REMARQUE: le protocole peut être mis en pause ici. </li></ol></li><li> Cryosections de tissus musculaires. <ol><li> Après au moins une nuit à -80 ° C, effectuez une cryotypie. </li><li> Retirez le couteau cryostat et la plaque anti-roulement du congélateur -20 ° C et placez-les sur les supports respectifs dans l&#39;armoire cryostat. </li><li> Mettez une goutte d&#39;OCT sur le talon de l&#39;échantillon et placez-le sur l&#39;échantillon congelé, en orientation NS verticale, tel que visualisé sur la figure 2D . </li><li> Placez le talon d&#39;échantillon sur le mandrin. </li><li> Sans tirer la plaque anti-roulement sur le couteau, faites quelques coupes à 40 μm pour éliminer les PTOM qui ne comprennent pas les muscles. Lorsque le muscle devient visible, réduisez l&#39;épaisseur de la tranche à 7-8 μm. </li><li> Retirer la plaque anti-roulement jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit alignée avecLe bord du couteau ou un peu au-dessus. </li><li> Couper les sections transversales de 7 à 8 μm d&#39;épaisseur et monter 3-4 tranches par lame histologique. REMARQUE: La température recommandée du cryostat est comprise entre -15 ° C et -23 ° C. Des coupes transversales des échantillons sont nécessaires pour l&#39;analyse ultérieure pour identifier les cellules souches musculaires dans la position de niche du satellite. </li><li> Pour maximiser l&#39;adhérence de la section, garder les diapositives à température ambiante pendant 10 à 15 minutes afin d&#39;éviter leur détachement pendant l&#39;incubation des anticorps. NOTE: L&#39;étape de séchage à l&#39;air pourrait affecter l&#39;immunocoloration, fournissant des résultats ambigus. Les diapositives peuvent être conservées sans fixation pendant plusieurs mois à -80 ° C. Le protocole peut être mis en pause ici. </li></ol></li><li> Vérification des dommages musculaires dans les criosections des muscles TA en effectuant une coloration par l&#39;éosine à l&#39;hématoxyline (H &amp; E). <ol><li> Évaluer la qualité du muscle ( c.-à-d. L&#39;efficacité de la lésion, l&#39;isolement musculaire et l&#39;inclusionIon, et criosections), effectuer une coloration H &amp; E. Pour chaque point de temps expérimental, réparer une diapositive avec 4% de PFA pendant 10 min. Après la fixation, lavez les glissières bien dans plusieurs changements de 1x PBS. REMARQUE: Attention. Le PFA est cancérogène et doit être manipulé avec soin. </li><li> Prenez une diapositive pour chaque point expérimental et placez-les dans un pot de coloration. </li><li> Remplir le pot avec une hématoxyline à 9 g / L jusqu&#39;à ce que les sections soient recouvertes et incuber pendant 8 min. </li><li> Recyclez l&#39;hématoxyline. </li><li> Laissez le pot sous l&#39;eau courante pendant 10 minutes pour éliminer l&#39;excès d&#39;hématoxyline. REMARQUE: Assurez-vous de ne pas couler l&#39;eau directement sur les sections. </li><li> Laver à l&#39;aide d&#39;eau stérilisée. </li><li> Incuber les sections avec de l&#39;éosine à 0,5% (p / v) dans de l&#39;éthanol acidifié à 90% pendant 1 min. </li><li> Recyclez l&#39;eosine. </li><li> Laver deux fois avec de l&#39;eau stérile pendant 3 min / laver. REMARQUE: procédez comme suit à un capot chimique. </li><li> Lavez les sections avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> lavageLes sections avec 90% d&#39;éthanol. </li><li> Lavez les sections à 100% d&#39;éthanol. </li><li> Incuber les sections avec 0,879 g / ml d&#39;o-Xylène. REMARQUE: Attention. L&#39;o-Xylène est inflammable et modérément toxique. Manipulez-le sous un capot chimique, portant un équipement de protection, y compris des gants, une blouse de laboratoire et un masque. </li><li> Recyclez l&#39;o-Xylène. </li><li> Mettez les glissières sur un morceau de papier pour sécher. </li><li> Fermez les diapositives à l&#39;aide d&#39;un support de fixation à base de xylène rapide. </li><li> Vérifiez la qualité des sections sous un microscope optique au grossissement 10X (voir la figure 3 ) REMARQUE: le protocole peut être mis en pause ici. </li></ol></li></ol> 3. Immunomarquage pour LC3 et MyoD dans les sections de tissus musculaires blessés <ol><li> Fixation des sections de tissu musculaire. <ol><li> Préparer une chambre d&#39;incubation en mouillant un morceau de papier et en le plaçant au fond d&#39;une boîte en plastique fermable pour maintenir un hautVel d&#39;humidité à l&#39;intérieur de la chambre. Réparer les sections de tissu avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) dans 1x PBS pendant 10 min. REMARQUE: Un morceau de papier humide est utilisé pour éviter de sécher l&#39;échantillon. Préparez PFA frais ou utilisez PFA stocké à -20 ° C. Mise en garde. PFA est toxique; La poudre doit être manipulée avec soin lors de la fabrication de la solution stock. Cette opération doit être effectuée dans un capot chimique, avec un équipement de protection, y compris des gants, une blouse de laboratoire et un masque. De plus, en solution, le PFA doit être manipulé avec précaution. </li><li> Retirez le PFA et lavez les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3 fois. </li></ol></li><li> Perméabilisation des sections de tissu musculaire. <ol><li> Dessinez une barrière hydrophobe autour des sections de tissu en utilisant un stylo pap. NOTE: Cette étape définit la surface autour des sections de tissu et minimise le volume d&#39;anticorps décrit aux étapes 3.4, 3.6, 3.7 et 3.9. </li><li> Couvrir les sections avec 200 μL de froid (-20 ° C)Metanol et mettre la chambre d&#39;incubation horizontalement à l&#39;intérieur d&#39;un congélateur à -20 ° C pendant 5 min. </li><li> Retirer la chambre d&#39;incubation du congélateur, aspirer le méthanol et laver les sections avec 1X PBS pendant 5 à 7 minutes à la température ambiante; Répétez cette étape 3x. </li></ol></li><li> Blocage <ol><li> Préparer une solution de blocs frais de 4% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans PBS 1x. REMARQUE: la solution BSA peut être stockée pendant 1 semaine à 4 ° C. </li><li> Incuber les sections avec une solution de bloc pendant au moins 60 minutes à la RT. </li><li> Retirez la solution de blocage. </li><li> Préparer 100 μL de mélange anti-Fab en diluant 20 μg / mL anti-Fab dans 1x PBS. Incuber les sections avec un fragment F (ab) purifié par affinité sans contrainte d&#39;IgG anti-souris pendant 1 h à la température ambiante. </li></ol></li><li> Incubation d&#39;anticorps primaire. <ol><li> Préparer 100 μL de mélange d&#39;anticorps primaire pour chaque diapositive en dissolvant les anticorps LC3 et MyoD dans 4% de BSA dans 1x PBS. Utiliser 5 μg /Ml d&#39;anti-LC3 (anticorps polyclonal de lapin) et 10 mg / L d&#39;anti-MyoD (anticorps monoclonal de souris). Incuber le mélange d&#39;anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavages. <ol><li> Retirer le mélange d&#39;anticorps primaire. </li><li> Laver les sections avec 1% de BSA dans 1X PBS pendant 10 min; Répétez cette étape 3x. </li></ol></li><li> Incubation secondaire d&#39;anticorps. <ol><li> Préparez 100 μL de mélange d&#39;anticorps secondaire pour chaque diapositive. Dissoudre le chèvre anti-lapin 488 (5 μg / mL) et la chèvre anti-souris 594 (5 μg / mL) dans de la BSA à 4% dans 1x PBS. REMARQUE: Évitez l&#39;exposition excessive à la lumière pour éviter le blanchiment au fluorochrome. Effectuez les étapes suivantes dans l&#39;obscurité. </li><li> Incuber les sections avec le mélange d&#39;anticorps secondaire pendant 45 minutes à la RT. </li><li> Retirer le mélange d&#39;anticorps secondaire et laver les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3x. </li></ol></li><li> Incubation d&#39;anticorps primaire. <ol><li> Diluer laminiAnticorps monoclonal n-2 (α-2-chaîne) (0,33 μg / mL) dans BSA à 4% dans 1x PBS en utilisant 100 μL de mélange pour chaque diapositive. Incuber les sections dans le mélange d&#39;anticorps primaire pendant 1-2 h à la température ambiante. </li></ol></li><li> Lavages. <ol><li> Retirer le mélange d&#39;anticorps primaire. </li><li> Laver les sections avec 1% de BSA dans 1X PBS pendant 10 min; Répétez cette étape 3x. </li></ol></li><li> Incubation secondaire d&#39;anticorps. <ol><li> Préparez 100 μL de mélange d&#39;anticorps secondaires pour chaque diapositive en diluant le chèvre anti-rat 647 (5 μg / mL) dans 4% de BSA dans 1X PBS. Incuber les sections dans le mélange d&#39;anticorps secondaire pendant 45 minutes à la RT. </li><li> Retirer le mélange d&#39;anticorps secondaire et laver les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3x. </li></ol></li><li> 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI). <ol><li> Ajouter 200 μL de solution de DAPI 300 nM dans 1x PBS à chaque diapositive. Incuber pendant 5 min à la RT. Conserver la solution DAPI à 4 ° C dans lefoncé. </li><li> Laver les sections avec 1x PBS pendant 5 à 7 minutes; Répétez cette étape 3x. </li></ol></li><li> Montage des sections musculaires colorées. <ol><li> Retirer l&#39;excès de solution de lavage des sections. </li><li> Placer 10 μL de glycérol dans 1x PBS (3: 1) sur les sections teintes au milieu de la glissière et ajouter un lamelle, évitant ainsi la formation de bulles d&#39;air. </li></ol></li></ol> 4. Acquisition de microscopie confocale <ol><li> Acquérir les images en utilisant un microscope confocal à quatre laser intégré avec un système de capture d&#39;image et un logiciel d&#39;analyse. REMARQUE: MyoD est conjugué avec un colorant 594 qui est un colorant fluorescent rouge brillant, avec une excitation idéale pour le laser 594 nm (excitation: 590 nm, émission: 617 nm). Le LC3 est conjugué avec un colorant 488 qui est un colorant fluorescent vert clair, avec une excitation idéale pour la ligne laser 488 nm (excitation: 495 nm, émission: 519 nm). Le strainin est conjugué avec un colorant 647 qui estUn colorant brillant fluorescent lointain-rouge, avec une excitation idéale pour la ligne laser 647 nm (excitation: 650 nm, émission: 668 nm). </li><li> Placez les diapositives dans le bac du microscope et utilisez un grossissement de 63X pour détecter les signaux nucléaires. Concentrez-vous manuellement sur les zones régénératrices en centrant les champs de régénération active, en s&#39;appuyant sur la morphologie musculaire (voir la figure 4 ). NOTE: Dans le muscle non perturbé, la taille des myofibres est pratiquement constante ( figure 4A ), la régénération musculaire médiée par les blessures peut être reconnue par l&#39;apparition de petites myofibres, qui sont les fibres nouvellement formées après la régénération. En outre, le muscle en régénération active se caractérise par un infiltrage important qui est constitué de macrophages, de précurseurs fibro-adipogènes et de cellules localisées sur les muscles endommagés pour organiser la régénération musculaire ( figure 4B ). </li><li> Évaluer la coloration immunofluorescente dans le regenEn mettant l&#39;accent sur les MUSC qui sont situés sous la lame basale des myofibres. </li><li> Concentrez-vous sur les MUSC qui sont positifs pour la coloration MyoD et positionnés dans les myofibres marqués par la coloration à la laminine (voir la figure 4B , flèches blanches). </li><li> Utilisez au moins 3 souris / groupe expérimental et utilisez le microscope pour acquérir des images de grossissement 63X d&#39;au moins 7 champs pour chaque groupe expérimental. </li><li> Une fois que les zones régénératives sont identifiées, concentrez-vous avec la coloration DAPI, puis ajustez les autres canaux individuels. <ol><li> Utilisez les paramètres de microscope suivants: Canal A594 Pinhole 1.2 Airy Unit, Gain 791; Channel A488 Pinhole 1.6 Airy Unit, Gain 659; Channel A647 Pinhole 1.4 Airy Unit, Gain 719. </li></ol></li><li> Après avoir ajusté la mise au point des canaux individuels, procédez à l&#39;acquisition des images à une taille de cadre de 1 024 x 1 024 et à un intervalle de pixels de 12,61 μs. </li><li> Comptez le pourcentage de cellules MyoD positives (contrôle pour tIl corrige l&#39;emplacement sous la lame) qui sont négatifs pour le LC3 et le pourcentage de cellules MyoD-positives qui affichent un signal LC3. REMARQUE: Le pourcentage de cellules MyoD positives qui présentent une coloration LC3 est la lecture de ce protocole. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler

<html> Ce protocole décrit comment surveiller l&#39;autophagie dans les cellules souches du muscle squelettique pendant la régénération musculaire compensatoire. Plusieurs anticorps pour la co-coloration de LC3 et MyoD ont été essayés, et ceux qui travaillent dans des sections de tissus de souris et créent des résultats réussis sont listés ici (voir la Table des matériaux ). La perméabilisation avec le méthanol (voir étape 3.2.2) est fortement recommandée pour une coloration réussie. <p class="jove_c...

La régénération du muscle squelettique est le résultat de l&#39;interaction entre les cellules souches adultes (Cellules satellites musculaires, MuSC) et d&#39;autres types de cellules impliquées dans le processus de régénération. L&#39;homéostasie musculaire et la fonctionnalité sont maintenues par les signaux combinés découlant de la niche musculaire et des indices systémiques 1 , 2 . Tout au long de la vie, des changements dans la fonctionnalité MuSC, le niche musculaire et les indices systémiques ont été rapportés, entraînant le déclin des capacités fonctionnelles chez les personnes âgées 3 . Les MuSC sont placés dans une niche sous la lame basale et, lors d&#39;une blessure musculaire, sont activés pour réparer les muscles endommagés 4 , 5 . Afin d&#39;assurer une réponse régénératrice productive, il est essentiel que les MUSC coordonnent les différents processus nécessaires à la sortie de la quiescence, de l&#39;auto-renouvellement et de l&#39;expansion proliférative.Par la différenciation myogénique 6 . Chez les personnes âgées et dans les maladies chroniques musculaires, toutes ces fonctions sont compromises, entraînant une altération de la fonctionnalité musculaire 2 , 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . La macroatophagie (appelée ci-après autophagie) apparaît comme un processus biologique crucial essentiel pour préserver l&#39;homéostasie des tissus 14 . Le processus autophagique englobe les mécanismes de traite, où des portions de cytoplasme, d&#39;organelles et de protéines sont englouties dans des vésicules qui se dégradent éventuellement via la voie du lysosome, favorisant l&#39;élimination des molécules toxiques et le recyclage du macromoleCules. Cela fournit des composés riches en énergie pour soutenir l&#39;adaptation des cellules et des tissus sous contrainte ou d&#39;autres conditions défavorables 15 , 16 . Avec l&#39;activité de survie cellulaire, l&#39;autophagie peut également fonctionner comme inducteur de la mort cellulaire, selon le contexte du tissu cellulaire ( p. Ex. Tissu normal versus cancer) et le type de stimulus de stress 17 , 18 . Des preuves récentes indiquent que l&#39;autophagie est nécessaire pour maintenir la masse musculaire et l&#39;intégrité de la myofibre 19 , 20 et a été signalée comme étant altérée dans différentes dystrophies musculaires 21 , 22 , 23 , y compris la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) 24 , 25 , 26 , 27 </suP&gt; , 28 , 29 , 30. De même, une réduction progressive du processus autophagique a été observée chez les personnes âgées 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , après une perte de masse musculaire (appelée sarcopénie) 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , et dans la survie de myofibres 38 . Une relation étroite entre l&#39;autophagie et le potentiel régénérateur des muscles squelettiques a été anticipée par une étude du laboratoire de Wagers, qui a montré qu&#39;une restriction calorique améliore la disponibilité et l&#39;activité de MuSC 39 . C&#39;est nonLa nouvelle observation a été confirmée par l&#39;observation récente selon laquelle l&#39;axe Foxo3-Notch active le processus autophagique pendant l&#39;auto-renouvellement 40 et la transition MuSC de l&#39;état de repos à l&#39;état de prolifération 41 . Ces données concordent avec la réduction progressive de l&#39;autophagie basale de jeunes et anciens et de MuSCs gériatriques, en association avec le déclin numérique et fonctionnel des MuSC pendant le vieillissement 42 . Dans un article récent, nous avons démontré une relation étroite entre l&#39;autophagie et la régénération musculaire compensatoire qui distingue les premiers stades de la progression de la DMD. En conséquence, nous avons observé un flux autophagique réduit aux stades ultérieurs de la progression de la maladie, lorsque la régénération musculaire est compromise et que le dépôt de tissu fibrotique se produit. D&#39;une manière intrigante, nous avons montré que, dans les conditions de régénération, l&#39;autophagie est activée dans les MUSC et que la modulation du processus autophagique affecte l&#39;activation de MuSC et fuNationality 30 . Dans l&#39;ensemble, ces données mettent en évidence l&#39;urgence d&#39;explorer le processus autophagique dans les MUSC pendant la régénération musculaire dans des conditions normales et pathologiques et tout au long de la vie. Ici, nous fournissons un protocole pour surveiller le processus autophagique dans MuSC dans les conditions de régénération musculaire en effectuant l&#39;immunocoloration in situ pour la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules, un marqueur de l&#39;autophagie 43 et MyoD, un marqueur de Lignée myogénique, dans les sections de tissu musculaire du contrôle et des souris blessées. La méthodologie déclarée permet de surveiller le processus autophagique dans un compartiment cellulaire spécifique, le MuSC, qui joue un rôle clé dans l&#39;orchestration de la régénération musculaire.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>souris WT</td></tr><tr><td>Cardiotoxine 1</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td></td></tr><tr><td>Millex-VV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td>Unité de filtre à seringue, 0,1 & micro ; m, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma</td></tr><tr><td>Sel de diphosphate de chloroquine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>Attention : Nocif en cas d’ingestion</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine + 0,5 mL</td><td>BD</td><td>324825</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Intermediate</td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258</td><td></td>solution d’hématoxyline</tr><tr><td>, Harris Modified</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS32</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Ysolution, alcoolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>o-Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1040</td><td>Attention : Liquide et vapeur inflammables ; Peut être mortel en cas d’ingestion et de pénétration dans les voies respiratoires ; Nocif au contact de la peau ; Peut provoquer une irritation respiratoire ; Provoque une irritation oculaire grave</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Attention : Solide inflammable ; Nocif en cas d’ingestion ; Provoque une irritation de la peau ; Peut provoquer une réaction allergique cutanée ; Provoque de graves lésions oculaires ; Peut provoquer une irritation respiratoire ; Suspecté de provoquer un cancer</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt - Milieu de montage à durcissement rapide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment Chèvre Anti-souris IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-003</td><td></td></tr><tr><td>LC3B</td><td>Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps</td><td>2775</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti-MyoD clone (concentré) 5.8A</td><td>DAKO - Agilent Pathology Solutions</td><td>M3512</td><td></td></tr><tr><td>Laminin-2 (&alpha ;-2-chain) anticorps monoclonal</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>4H8-2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L)</td><td>Technologies de la vie</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Chèvre Anti-Souris IgG (H+L)</td><td>Technologies de la vie</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Chèvre Anti-Rat IgM Anticorps</td><td>Technologies de la vie</td><td>A21248</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

La preuve croissante indique que l&#39;autophagie est un processus de réglementation crucial pour préserver l&#39;homéostasie des tissus. On sait que l&#39;autophagie est impliquée dans le développement et la régénération du muscle squelettique, et le processus autophagique a été décrit dans plusieurs pathologies musculaires et des troubles musculaires liés à l&#39;âge. Un bloc récemment décrit du processus autophagique qui est en corrélation avec l&#39;épuisement fonctionnel des cellules satellites pendant la réparation musculaire confirme l&#39;idée que l&#39;autophagie active est couplée à la régénération musculaire productive. Ces données révèlent le rôle crucial de l&#39;autophagie dans l&#39;activation des cellules satellites pendant la régénération musculaire dans des conditions normales et pathologiques telles que les dystrophies musculaires. Ici, nous fournissons un protocole pour surveiller le processus autophagique dans le compartiment de cellules souches musculaires adultes (MUSC) pendant les conditions de régénération musculaire. Ce protocole décrit la méthodologie d&#39;installation pour effectuer une imagerie immunofluorescence in situ de LC3, et uneMarqueur d&#39;utophagie et MyoD, un marqueur de lignée myogénique, dans des sections de tissus musculaires du contrôle et des souris blessées. La méthodologie déclarée permet de surveiller le processus autophagique dans un compartiment cellulaire spécifique, le compartiment MuSC, qui joue un rôle central dans l&#39;orchestration de la régénération musculaire.

Ce protocole décrit une méthode in situ efficace pour détecter l&#39;autophagie dans les MUSC pendant la régénération musculaire. Traitements CTX In Vivo : Utilisez CTX pour induire des dommages musculaires dans les muscles TA et utilisez des muscles non perturbés comme témoins. Puisque l&#39;autophagie est très dynamique, bloquez le flux autophagique...

L&#39;autophagie active est associée à la régénération musculaire productive, ce qui est essentiel pour l&#39;activation des cellules souches musculaires (MuSC). Ici, nous fournissons un protocole pour la détection in situ de LC3, un marqueur autophagique dans les muSCs MyoD-positives de sections de tissu musculaire à partir de souris témoins et blessées.

Coloration immunofluorescente in situ de l&#39;autophagie dans les cellules souches musculaires

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

L'objectif général de ce protocole de coloration immunofluorescente est de surveiller le processus autophagique dans les cellules satellites musculaires au cours de la régénération du muscle squelettique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération tissulaire concernant la compréhension de la contribution de l'autophagie à la régénération musculaire et la surveillance de l'autophagie dans les cellules satellites. Le principal avantage de cette technique est que le processus autophagique peut être détecté directement dans les cellules satellites sur des coupes tissulaires provenant de muscles non perturbés et endommagés.Le démonstrateur de cette procédure sera Francesco Castagnetti, un excellent étudiant de mon laboratoire. Pour induire une lésion aiguë du muscle squelettique, charger une seringue à insuline équipée d'une aiguille de calibre 30 avec 20 microlitres de cardiotoxine stérile filtrée à une concentration de 10 micromolaire. Injecter directement la cardiotoxine dans le muscle tibial antérieur gauche d'un nombre égal de souris mâles et femelles de deux mois, d'un poids d'environ 20 grammes, de souche C57 black six.Pour évaluer

in-situ-immunofluorescent-staining-of-autophagy-in-muscle-stem-cells

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Microscopie time-lapse de marqueurs de l'autophagie marquées par fluorescence permet le suivi de la réponse de l'autophagie dynamique avec une haute résolution temporelle. Utilisation de l'autophagie spécifique et marqueurs organites dans une combinaison de 3 couleurs différentes, nous pouvons suivre la contribution d'une protéine à la formation autophagosome dans un contexte spatial et temporel robuste.

Vivre imagerie cellulaire de l&#39;autophagie premiers événements: Omegasomes et au-delà

L'isolement et la culture d'une population pure de cellules satellites quiescentes, une population de cellules souches musculaires, est essentielle à la compréhension de muscle tige de la biologie cellulaire et la régénération, ainsi que la transplantation de cellules souches pour des thérapies dans la dystrophie musculaire et d'autres maladies dégénératives.

L&#39;isolement, la culture, et la transplantation de cellules satellites du muscle

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Cryosectioning de contigües Les régions d&#39;un muscle squelettique de souris unique pour l&#39;expression génique et analyses histologiques

Nous présentons ici un protocole détaillé pour détecter toutes deux de sénescence des cellules souches pluripotentes dans le muscle squelettique sur blessure tout en induisant en vivo reprogrammation. Cette méthode convient pour évaluer le rôle de la sénescence cellulaire au cours de la régénération tissulaire et reprogrammation in vivo.

Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

L’identification précise des cellules satellites est essentielle pour l’étude de leurs fonctions dans des conditions physiologiques et pathologiques différents. Cet article présente un protocole pour identifier les cellules satellites sur des coupes de muscle squelettique adulte par axée sur l’immunofluorescence souillant.

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Décrit ici est un protocole pour l'immunoétiquetage direct des myofibres nécrotiques dans les cryosections de muscle. Les cellules nécrotiques sont perméables aux protéines sériques, y compris l'immunoglobuline G (IgG). Révéler l'apport d'IgG par les myofibres permet l'identification et la quantification des myofibres qui subissent une nécrose indépendamment de l'état musculaire.

Immunolabelling Myofiber Dégénérescence dans les biopsies musculaires

Dans ce protocole, une méthode de culture in vitro et d’analyse fonctionnelle des cellules souches musculaires est décrite, qui préserve la plupart de leurs interactions avec leur niche endogène.

Essai de culture de myofibère unique pour l’évaluation de la fonctionnalité des cellules souches musculaires adultes Ex Vivo

Nous présentons ici un protocole de microscopie électronique optique corrélative corrélative sur coupe basé sur le marquage endogène par fluorescence comme outil pour étudier la localisation de protéines rares en relation avec l’ultrastructure cellulaire. La puissance de cette approche est démontrée par la localisation ultrastructurale de la LC3 endogène dans des cellules affamées sans traitement par la bafilomycine.

Localisation ultrastructurale de la LC3 endogène par microscopie électronique luminescente corrélative sur coupe

Le muscle squelettique comprend plusieurs types de cellules, y compris les cellules souches résidentes, chacune ayant une contribution particulière à l’homéostasie et à la régénération musculaires. Ici, la culture 2D de cellules souches musculaires et la niche des cellules musculaires dans un environnement ex vivo qui préserve de nombreuses caractéristiques physiologiques, in vivo et environnementales sont décrites.

Culture en vrac non fractionnée de muscles squelettiques de souris pour récapituler la niche et la quiescence des cellules souches

Injections locales d’une cellule de Schwann terminale marquante mitochondriale in vivo pour microscopie confocale. Cette méthode utilise des preuves de concept démontrées dans le tissu musculaire squelettique de souris avec un muscle sain ou malade pour fournir une visualisation mitochondriale à haute résolution.

Méthodes pour la quantification in situ de la morphologie mitochondriale dans les cellules musculaires et terminales de Schwann de souris

Ce protocole fournit une méthode standardisée pour isoler et enrichir les myoblastes primaires du muscle squelettique de la souris adulte et néonatale via la dissociation tissulaire, la filtration séquentielle, le préplaque et des conditions de culture définies, permettant l’établissement et le maintien de cultures de myoblast dérivées des cellules satellites pour des applications expérimentales en aval.

Isolement des cellules satellites du muscle squelettique pour les études de myogenèse in vitro

Apprenez une technique de coloration immunofluorescente pour détecter l'autophagie dans les cellules souches musculaires de souris C57BL/6. Cette méthode permet de surveiller le processus autophagique dans les muscles intactes et blessés.

Coloration immunofluorescente in situ de l'autophagie dans les cellules souches musculaires

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