Name: Analyse de la spécificité danticorps dhistone avec des microarrays de peptides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Découvrez une méthode complète d'analyse de la spécificité des anticorps d'histone utilisant des microarrays de peptides. Cette technique améliore le contrôle qualité en recherche épigénétique et chromatine.

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Ce travail a été soutenu en partie par l&#39;Institut de recherche Van Andel et une subvention de recherche des Instituts nationaux de santé (CA181343) à SBR

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

La fiabilité des anticorps dans les applications de recherche biomédicale est primordiale 46 , 47 . Ceci est particulièrement vrai dans la biochimie de la chromatine étant donné la position des anticorps comme outils clés pour la majorité des techniques développées pour caractériser l&#39;abondance et la distribution des PTM des histones. Le protocole présenté ici détaille un pipeline optimisé pour la conception, la fabrication et l&#39;utilisation de microarray...

L&#39;ADN génomique est emballé élégamment à l&#39;intérieur du noyau de cellules eucaryotes avec des protéines d&#39;histone pour former la chromatine. La sous-unité récurrente de la chromatine est le nucléosome, qui comprend 147 paires de bases d&#39;ADN enroulées autour d&#39;un noyau octamerique de protéines d&#39;histones - H2A, H2B, H3 et H4 1 . La chromatine est globalement organisée en euchromatine lâchement emballée et dans les domaines de l&#39;hétérochromatine étroitement emballés. Le degré de compactage de la chromatine régule la mesure dans laquelle les machines à protéines peuvent accéder à l&#39;ADN sous-jacent pour mener à bien des processus fondés sur l&#39;ADN fondamentaux comme la réplication, la transcription et la réparation. Les principaux régulateurs de l&#39;accessibilité du génome dans le contexte de la chromatine sont les PTM sur la queue non structurée et les domaines de base des protéines histoniques 2 , 3 . Les PTM d&#39;histone fonctionnent directement en influençant la structure de la chromatine 4 et indirectement à traversH le recrutement de protéines lecteur et leurs complexes macromoléculaires associés qui ont des activités de remodelage de la chromatine, enzymatiques et échafaudages 5 . Les études de la fonction PTM des histones au cours des deux dernières décennies suggèrent largement que ces marques jouent un rôle clé dans la régulation du devenir cellulaire, du développement organique et de l&#39;initiation / progression de la maladie. Alimenté par des progrès dans la technologie protéomique à base de spectrométrie de masse, plus de 20 PTM d&#39;histones uniques sur plus de 80 résidus d&#39;histones distinctes ont été découverts 6 . Notamment, ces modifications se produisent souvent dans des combinaisons et, conformément à l&#39;hypothèse du &quot;code histone&quot;, de nombreuses études suggèrent que les protéines de lecteur sont ciblées sur des régions discrètes de la chromatine en reconnaissant des combinaisons spécifiques d&#39;histones PTM 7 , 8 , 9 . Un défi majeur pour aller de l&#39;avant sera d&#39;assigner des fonctions à la grEn raison de la liste des PTM des histones et pour déterminer comment des combinaisons spécifiques de PTM d&#39;histones orchestrent les fonctions dynamiques associées à la chromatine. Les anticorps sont les réactifs lynchpin pour la détection des PTM des histones. En tant que tel, plus de 1 000 anticorps spécifiques des PTM d&#39;histone ont été commercialement développés pour être utilisés dans la recherche sur la biochimie de la chromatine. Avec le développement rapide de la technologie de séquençage d&#39;ADN à haut débit, ces réactifs sont largement utilisés par des chercheurs individuels et des initiatives de &quot;feuille de route&quot; d&#39;épigénomènes à grande échelle ( p . Ex . ENCODE et BLUEPRINT) dans ChIP-seq (immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage de la prochaine génération ) Pipelines pour générer des cartes spatiales à haute résolution de la distribution de PTM d&#39;histones dans l&#39;ensemble du génome 10 , 11 . Cependant, des études récentes ont montré que la spécificité des anticorps anti-histone PTM peut être très variable et que ces réactifs ne présentent pas<html> Des propriétés avorables telles que la reconnaissance de l&#39;epitope hors cible, une forte influence positive et négative par les PTM voisins et une difficulté à discriminer l&#39;ordre de modification sur un résidu particulier ( par exemple , mono-, di- ou tri-méthyllysine) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Par conséquent, un contrôle rigoureux de la qualité des réactifs d&#39;anticorps spécifiques des PTM d&#39;histones est nécessaire pour interpréter avec précision les données générées avec ces réactifs précieux. La technologie Microarray permet l&#39;interrogation simultanée de milliers d&#39;interactions macromoléculaires dans un format à haut débit, reproductible et miniaturisé. Pour cette raison, une variété de plates-formes de microarray ont été créées pour analyser l&#39;ADN protéique 19 ,&quot;&gt; 20, protéine-protéine 21 et interactions protéine-peptide 22. En effet, les microarrays de peptides histoniques sont apparus comme une plate-forme de découverte informative pour la recherche sur la biochimie de la chromatine, permettant le profilage à haut débit des écrivains, des effaces et des lecteurs d&#39;histones PTM 15 , 23 , 24 , et aussi pour l&#39;analyse de la spécificité des anticorps d&#39;histone 17 , 25. Au-delà de leur application dans la recherche de la chromatine et de l&#39;épigénétique, les tableaux de peptides histoniques ont une utilité potentielle comme test diagnostique / pronostique pour le lupus érythémateux systémique et d&#39;autres maladies auto-immunes, Les autoanticorps de chromatine sont générés 26 , 27 . Nous décrivons ici un pipeline intégré que nous avons développé pour concevoir, fabriquer et quitter.Des microarrays de peptides d&#39;histone qui agissent pour générer des profils de spécificité pour les anticorps qui reconnaissent les histones et leurs PTM. Le pipeline est facilité par ArrayNinja, une application logicielle interactive ouverte, que nous avons développée récemment, qui intègre les étapes de conception et d&#39;analyse des expériences microarray 28 . ArrayNinja fonctionne mieux dans Google Chrome. En bref, une imprimante à microarray de contact robotique est utilisée pour déposer une bibliothèque de peptides d&#39;histones conjugués à la biotine à des positions définies sur des lames de microscope en verre revêtues de streptavidine. Les tableaux peuvent ensuite être utilisés dans un format de dosage compétitif et parallèle pour interroger les interactions anticorps-épitope ( Figure 1 ). La bibliothèque de peptides se compose de centaines de peptides synthétiques uniques hébergeant des PTM (acétylation de lysine, méthylation de lysine / arginine et phosphorylation de serine / thréonine) et en combinaisons pertinentes dérivées en grande partie de jeux de données protéiques. Méthodes de synthèse et de validation des peptides<html> Sont détaillés ailleurs 23 . Les données générées à partir de nos efforts actuels de dépistage d&#39;anticorps PTM d&#39;histone utilisant cette plate-forme de réseau sont archivées sur une ressource Web publique, la base de données de spécificité d&#39;anticorps Histone (www.histoneantibodies.com). Notamment, les microarrays de peptides d&#39;histones fabriqués avec des variations de ce protocole ont également été largement utilisés pour caractériser l&#39;activité des domaines de lecteur de PTM d&#39;histone 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 et plus récemment à l&#39;histone de profil Activités d&#39;écrivain et de gomme à effet PTM 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1: Traçage de la Procédure Stepwise pour le dépistage d&#39;anticorps sur un microarray de peptide histone. Les peptides d&#39;histone biotinylés abritant des modifications post-traductionnelles définies (cercles rouges et bleus) sont co-imprimés avec de la biotine-fluorescéine sur du verre revêtu de streptavidine. Les interactions positives sont visualisées sous forme de fluorescence rouge. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table><tbody><tr><td>Tampon d’impression</td><td>ArrayIt PPB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre revêtu de streptavidine</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polypropylène 384 plaque à puits</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-fluorescéine</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>imprimante à microréseaux de contact</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Imprimante</td>à</tr><tr><td>microréseaux Imprimante à microréseaux de contact</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Imprimante à microréseaux</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Block Buffer ArrayIt</td><td></td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Stylo à cire hydrophobe</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Barrière hydrophobe Stylo PAP</td></tr><tr><td>Silicon Joint</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Récipient d’hybridation</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>ou récipient similaire</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué à colorant fluorescent</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-lapin)</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué à colorant fluorescent</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-souris)</td></tr><tr><td>Cire Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>ou équivalent Scanner de microarrays</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Peptide Array</td><td>Active Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Histone Code Peptide Microarrays</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Wax</td><td>Royal Oak</td><td>GulfWax</td><td>pour imprimante de cire</td></tr><tr><td>Chambre d’hybridation de lames de microarray humidifié</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de lavage de lames de microscope à haut débit</td><td>Microscope ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td> centrifugeuse à lames</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Peptide d’histone biotinylé</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Exemple de peptide. Des peptides similaires avec diverses modifications sont disponibles auprès de plusieurs sources commerciales.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

analyse de la spécificité d&#39;anticorps d&#39;histone avec des microarrays de peptides

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Les modifications post-traductionnelles (PTM) sur les protéines d&#39;histones sont largement étudiées pour leur rôle dans la régulation de la structure de la chromatine et de l&#39;expression des gènes. La production en masse et la distribution d&#39;anticorps spécifiques aux PTM des histones ont considérablement facilité la recherche sur ces marques. Comme les anticorps PTM des histones sont des réactifs clés pour de nombreuses applications de biochimie de la chromatine, une analyse rigoureuse de la spécificité des anticorps est nécessaire pour une interprétation précise des données et des progrès continus sur le terrain. Ce protocole décrit une pipeline intégrée pour la conception, la fabrication et l&#39;utilisation de microarrays de peptides pour le profilage de la spécificité des anticorps histoniques. Les aspects de conception et d&#39;analyse de cette procédure sont facilités par ArrayNinja, un logiciel logiciel ouvert et interactif que nous avons développé récemment pour rationaliser la personnalisation des formats d&#39;impression microarray. Ce pipeline a été utilisé pour dépister un grand nombre d&#39;antibodie d&#39;histone PTM commercialement disponibles et largement utiliséesS, et les données générées à partir de ces expériences sont disponibles gratuitement via une base de données de spécificité d&#39;anticorps Histone en ligne et en expansion. Au-delà des histones, la méthodologie générale décrite ici peut être largement appliquée à l&#39;analyse des anticorps spécifiques de PTM.

Ce protocole a été utilisé pour concevoir et fabriquer une plate-forme de microarray peptidique pour l&#39;analyse de la spécificité d&#39;anticorps PTM des histones. Le tableau interroge une bibliothèque de plus de 300 caractéristiques peptidiques uniques (20 à 40 résidus de longueur) représentant une grande partie des combinaisons connues de PTM trouvés sur les protéines histone de coeur et variantes 38 . Ce pipeline a été un cheval de bataille pour le dépistage...

Ce manuscrit décrit des méthodes pour l&#39;application de la technologie des micro-aigres peptidiques au profilage spécifique des anticorps qui reconnaissent les histones et leurs modifications post-traductionnelles.

Analyse de la spécificité d&#39;anticorps d&#39;histone avec des microarrays de peptides

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

L'objectif de cette vidéo est de décrire un pipeline intégré pour la conception, la fabrication et l'utilisation de puces à peptides afin de caractériser les spécificités des anticorps dirigés contre les histones. Les anticorps reconnaissant les histones et leurs nombreuses modifications post-traductionnelles sont des réactifs essentiels dans la recherche en biochimie de la chromatine. Nous comptons sur ces outils pour approfondir notre compréhension de la fonction des modifications des histones.Des études récentes révèlent des incohérences dans le comportement des anticorps anti-histones. Étant donné que le choix de l'anticorps est l'élément le plus critique dans les expériences d'épigénétique, des mesures rigoureuses et exhaustives de contrôle qualité sont nécessaires pour ces réactifs. Ici, nous décrivons un flux de travail intégré que nous avons mis au point pour concevoir, fabriquer et analyser des puces à peptides afin d'obtenir des profils de spécificité d'anticorps reconnaissant les histones et leurs modifications post-traductionnelles.Le pipeline est facilité par Array Ninja, une application logicielle interactive open source que nous avons développée, qui intègre les étapes de conception et d'analyse des expériences de puces à ADN. Pour commencer la conception de la lame, sous l'en-tête « Planifier la disposition de la lame », sélectionnez l'imprimante de puces à ADN qui sera utilisée. Ensuite, saisissez « empty » dans le champ de la plaque de chargement et appuyez sur Entrée.Régler le diamètre du spot à 275 micromètres et l'espacement entre les spots à 100 micromètres. Remplir les paramètres restants de manière appropriée pour l'expérience, en veillant à ce que la disposition permette suffisamment de réplicats. Dans l'aperçu de la disposition obtenu, placer le curseur de la souris sur chaque caractéristique unique de peptide sur la lame et saisir un identifiant de caractéristique dans la zone de texte contextuelle.Une fois chaque caractéristique unique étiquetée, cliquez sur « remplir ». Nommez la disposition de la lame et cliquez sur « valider votre plaque » pour enregistrer la disposition et générer une carte aux emplacements physiques de chaque caractéristique sur les plaques sources. Guidé par la carte de la plaque source, chargez un à deux microlitres de chaque caractéristique peptidique dans les puits désignés d'une ou plusieurs plaques 384 puits à faible volume, diluez chaque caractéristique 10 fois avec un tampon d'impression pour puces à protéines 1x, supplémenté avec 1 % d'albumine de sérum bovin et cinq microgrammes par microlitre de biotine marquée à la fluorescéine.Ensuite, centrifuger les plaques à 500 x G à température ambiante pendant deux minutes. Puis, vider le contenant des déchets de l'imprimante de puces à ADN. Remplir les récipients de l'humidificateur avec la solution lavée d'eau distillée stérile.Entrez les paramètres de la lame à réseau dans le logiciel d’impression de puces à ADN. Réglez la procédure de lavage sur un lavage d'une seconde avec une immersion unique, le post-lavage sur une réimmersion des pointes cinq fois, et l'humidité à 60 %. Ensuite, insérez les lames en verre revêtues dans les plateaux de substrat. Chargez les plateaux dans l’élévateur de plateaux.Insérez les plaques sources dans les supports de plaque et chargez les supports dans l'élévateur de plaque source. Exécutez le processus d'impression, puis retirez les plateaux de substrat de l'appareil. Bloquez les lames imprimées avec un tampon de blocage pour puces à protéines 1x pendant 30 minutes sous agitation.Ensuite, laver les lames dans du tampon salin phosphate à pH 7,6 à température ambiante pendant 10 minutes. Répéter le lavage avec une nouvelle portion de PBS. Sécher les lames par centrifugation pendant 30 secondes à température ambiante.Ensuite, préchauffez un imprimante à cire pour puces à ADN à 85 degrés Celsius pendant 30 minutes, ou jusqu'à ce que la cire soit fondue. Puis, insérez une lame avec le côté imprimé vers le bas dans le support et alignez le support avec le moule de l'imprimante. Appliquez le moule sur la lame et maintenez-le en contact pendant deux secondes, puis retirez rapidement la lame du support et examinez les bords de cire pour vérifier que les puces sont correctement délimitées.Conserver les lames séparées à quatre degrés Celsius, dans un endroit sec et sombre. Pour commencer la procédure d'hybridation, placer une lame de matrice séparée dans une boîte en plastique et recouvrir la lame de tampon d'hybridation. Équilibrer la lame pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, sous agitation lente.Séchez la lame en la centrifugeant dans une centrifugeuse pour lames de puces à ADN à température ambiante. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de chaque solution d'anticorps dirigé contre les modifications post-traductionnelles des histones dans au moins deux puits de la matrice et incubez à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après l'incubation, retirez la solution d'anticorps et lavez la matrice avec du PBS froid trois fois pendant cinq minutes chacune à quatre degrés Celsius.Ensuite, incuber la lame dans une solution d'anticorps secondaire marqué par un colorant fluorescent pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, en l'absence de lumière. Rincer la lame trois fois avec du PBS froid comme précédemment.Immergez la lame dans du PBS 0,1x à température ambiante pour éliminer l'excès de sel, puis séchez la lame par une brève centrifugation à température ambiante. Imagez la lame à l'aide d'un scanner de puces à ADN avec une résolution d'au moins 25 micromètres. Pour commencer l'analyse, utilisez un logiciel de traitement d'image pour fusionner les fichiers monocanaux provenant du scanner de puces à ADN.Ensuite, ouvrez Array Ninja et sélectionnez l'imprimante de puces à ADN appropriée dans l'en-tête permettant de quantifier les images. Saisissez le nom de la même disposition de lame dans la boîte de dialogue de chargement de la plaque, puis appuyez sur Entrée. Chargez le fichier d'image fusionnée et ajustez le contraste, la luminosité et le point médian selon vos préférences.Indiquez la résolution du scanner de puces, puis ajustez les marges supérieure et latérale afin d'aligner la grille de disposition de la lame avec l'image. Pour analyser un ensemble de puits comme des réplicats ou effectuer une autre analyse sélective, saisissez les coordonnées des puits dans les champs iPin, jPin et subA, puis appuyez sur Entrée. Cliquez pour activer/désactiver le zoom et afficher une image agrandie de la zone située sous le curseur.Ensuite, cliquez sur « spot seek » et attendez la fin du processus. Répétez la fonction de recherche selon les besoins pour centrer les cercles de la grille sur les points du réseau. Les points de référence peuvent être sélectionnés en appuyant sur la touche R, et les points présentant des débris ou une morphologie fortement altérée peuvent être désactivés en appuyant sur la touche A tout en survolant le point.Une fois les taches de référence du fond sélectionnées et les taches présentant une morphologie de pores ou une contamination désactivées, cliquez sur « remplir », puis sur « soumettre » pour effectuer la quantification. Un graphique en barres et un tableau s'afficheront sur une nouvelle page. Les spécificités de liaison de deux anticorps dirigés contre des PTM d'histones ont été évaluées à l'aide de cette méthode.On a observé qu'un anticorps ciblant une PTM d'histone, conçu pour reconnaître la lysine 9 triméthylée sur l'histone H3, se lie également à trois autres groupes de lysine triméthylés. Une silylation des résidus de lysine voisins a été observée pour influencer positivement le ciblage de la lysine 9 sur H3. Un anticorps dirigé contre la lysine 4 triméthylée sur l'histone H3 a également été trouvé pour interagir avec la lysine 4 monométhylée et diméthylée sur H3. La phosphoréaction des trois alanines voisines a été observée pour nuire négativement à la liaison au niveau de la lysine 4 dans cet essai.Ce protocole a été utilisé pour analyser un grand nombre des anticorps anti-histones les plus couramment utilisés et disponibles commercialement, et les données générées par ces expériences sont librement accessibles via la base de données sur la spécificité des anticorps anti-histones. Des variantes de ce protocole ont déjà été décrites pour l'analyse des lecteurs, écrivains et effaceurs d'histones, ce qui permet d'adapter facilement cette plateforme à d'autres domaines de recherche au-delà de l'épigénétique, pour toute bibliothèque imprimable d'intérêt. Plusieurs plateformes de puces à peptides d'histones sont disponibles à l'achat pour les utilisateurs qui n'ont pas accès au matériel spécialisé nécessaire à la synthèse des peptides et à la fabrication des puces.

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Analyse de la spécificité d'anticorps d'histone avec des microarrays de peptides

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