Name: Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Découvrez une méthode standardisée pour isoler les cellules germinales mâles de mammifères par dissociation mécanique et cytométrie de flux. Ce protocole unique permet l'analyse moléculaire de la spermatogenèse.

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Les auteurs remercient l&#39;hôpital Hillside Animal (St. Louis, MO) pour les testicules de chien; Jason Arand et le laboratoire du Dr Ted Cicero à l&#39;Université de Washington à St. Louis (WashU) pour fournir des testicules de rat et Brianne Tabers pour aider à la collecte; Jared Hartsock et Dr. Salt&#39;s Lab à WashU pour les testicules de guinée; Et le Dr Michael Talcott à la Division de la médecine comparée chez WashU pour les testicules miniatures de porc. Les auteurs reconnaissent également le Alvin J. Siteman Cancer Center à la Washington University School of Medicine et Barnes-Jewish Hospital à St. Louis, MO, pour l&#39;utilisation de Siteman Flow Cytometry Core, qui a fourni un service de tri cellulaire. The Siteman Cancer Center est soutenu en partie par la subvention de soutien NCI Cancer Center # P30 CA91842. Cette recherche a été financée par une bourse de doctorat de FCT [SFRH / BD / 51695/2011 à ACL], des subventions des National Institutes of Health des États-Unis [R01HD078641 et R01MH101810 à DFC] et un contrat de recherche FCT [IF / 01262/2014 à AML].

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont respecté les règlements du comité des études animales de l&#39;Université de Washington à St. Louis. 1. Préparations pour le protocole de dissociation mécanique <ol><li> Pré-mouiller une cartouche de désagrégation de tissu jetable de 50 μm pour la dissociation d&#39;un testicule murin entier. REMARQUE: cette cartouche jetable de désagrégation de tissu contient des micro-lames conçues pour couper des tissus et un treillis métallique immobile avec environ 100 trous hexagonaux. Différentes tailles de maille pour cartouche de désagrégation tissulaire sont disponibles pour adapter ce protocole en fonction des espèces et des types de cellules souhaités. Des cartouches de 50 μm ont été utilisées pour toutes les espèces de mammifères mentionnées dans cet article. <ol><li> Chargez 1 mL de phénol glacé rouge sans 1x Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) sur la cartouche de désagrégation tissulaire jetable de 50 μm. REMARQUE: le rouge phénol peut interférer avec la détection de fluorescence rougePendant les FACS. </li><li> Aspirer 1x DMEM de la cartouche de désagrégation tissulaire avec une seringue jetable sans aiguille de 3 mL à partir du port de la seringue. </li></ol></li><li> Activez le système de désagrégation des tissus en appuyant sur le bouton &quot;ON&quot;. Ce système ne nécessite pas un «échauffement». </li><li> Préchauffez trois filtres jetables de 40 μm avec de la glace à l&#39;abri du DMEM. Placez chaque filtre jetable de 40 μm sur un tube conique de 50 ml. Pipettez 1 mL de 1x DMEM et laissez passer le liquide. </li><li> Préparer une boîte de Petri 100 mm x 15 mm pour la collecte de tissus testiculaires. Pipetter 500 μL de 1x DMEM sur la boîte de Petri. </li></ol> 2. Préparation du tissu testiculaire pour le protocole de dissociation mécanique <ol><li> Dissectez une souris mâle pour éliminer soigneusement les testicules entiers frais ou les fragments testiculaires (si vous rencontrez d&#39;autres espèces de mammifères) avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces chirurgicales. REMARQUE: Assurez-vous que les tissus sont exempts de graisse et de nécrose. Fr<html> Les tissus testiculaires génèrent une qualité de suspension supérieure à une cellule supérieure à celle des tissus congelés. <ol><li> Transférer des testicules / fragments recueillis dans la boîte de Petri 100 mm x 15 mm préparée contenant 500 μL de 1x DMEM. </li><li> Rincer doucement le tissu dans 1x DMEM pour éliminer les globules rouges (si présent). </li></ol></li><li> Retirez délicatement la tunica albuginea. L&#39;épaisseur de la tunica albuginea variera selon les différentes espèces. <ol><li> Prenez une extrémité du testicule avec une pince. </li><li> Percez l&#39;autre extrémité du testicule avec un scalpel tout en maintenant l&#39;extrémité du testicule avec une pince de l&#39;étape précédente. </li><li> Rincez les tubules testiculaires à l&#39;aide d&#39;un scalpel tout en maintenant l&#39;extrémité du testicule avec une pince à partir de l&#39;étape 2.2.1. </li></ol></li><li> Couper les tubules testiculaires en morceaux de ~ 2-3 mm 3 en utilisant un scalpel. </li></ol> 3. Obtention des suspensions monocellulaires par dissociation mécanique des tissus testiculaires &quot;Les résultats des étapes de dissociation décrites ci-dessous sont pour un testicule de souris chez l&#39;adulte. Les volumes de tissus testiculaires provenant de souris juvéniles ou non murines devraient être ajustés en conséquence. Les animaux juvéniles ne contiennent pas tous les stades des cellules germinales. La composition des tissus testiculaires change pendant les saisons de reproduction par rapport à la saison non associée. <ol><li> Transférer les petites pièces de tubules testiculaires dans la cartouche de désagrégation de tissu pré-mouillée de 50 μm en utilisant une pince et ajouter 1 mL de 1x DMEM. </li><li> Chargez la cartouche de désagrégation des tissus dans le système de désagrégation des tissus et procédez pendant 5 minutes en tournant le bouton du mode &quot;veille&quot; au mode &quot;courir&quot;. </li><li> Retirez la cartouche de désagrégation tissulaire du système de désagrégation des tissus et éliminez la suspension cellulaire avec une seringue jetable sans aiguille de 3 mL à partir du port de la seringue. <ol><li> Aspirez quelques fois pour éliminer tout liquide de la cartouche de désagrégation des tissus. ne pasTous les 1 ml peuvent être récupérés à partir de la cartouche de désagrégation tissulaire. </li></ol></li><li> Passer la suspension cellulaire aspirée à travers deux filtres pré-mouillés de 40 μm. Filtrer deux fois pour supprimer tous les agrégats cellulaires. <ol><li> Placez un filtre pré-mouillé de 40 μm dans un tube conique de 50 ml. Ajouter directement des cellules aspirées dans la seringue sur le filtre de 40 μm. Pipette la suspension à une seule cellule avec une pipette jetable. </li><li> Retirez le filtre pré-mouillé usagé de 40 μm et placez un autre filtre pré-mouillé de 40 μm dans le tube conique de 50 ml. Pipettez la suspension monocellulaire collectée sur le filtre propre de 40 μm. </li><li> Recueillir la suspension filtrée à une seule cellule avec une pipette jetable propre. </li></ol></li><li> Pipettez la suspension de cellule filtrée vers la cartouche de désagrégation de tissu de 50 μm et procédez pendant encore 5 minutes dans un système de désagrégation de tissu. </li><li> Récupérer tout le liquide de la désagrégation tissulaireSur la cartouche. </li></ol> 4. Coloration avec Hoechst et Iodure de Propidium (PI) <ol><li> Transférer la suspension cellulaire récupérée de la cartouche de désagrégation tissulaire de 50 μm à un tube propre de 1,5 mL. On récupérera environ 1-1,5 ml de suspension monocellulaire. </li><li> Diviser la suspension monocellulaire récupérée en quatre tubes de 1,5 mL ou 5 mL. <ol><li> Pour les trois premiers tubes, pipeter 150 μL de suspension monocellulaire et repose pipette de suspension monocellulaire dans le dernier des quatre tubes (environ 550 μL de suspension monocellulaire). REMARQUE: Le montant de la suspension à une seule cellule dans le dernier tube peut varier en fonction de l&#39;efficacité de la récupération de la suspension cellulaire à l&#39;étape 3.6. </li></ol></li><li> Réglez le premier tube des quatre tubes comme un contrôle non contrôlé pour la session FACS. </li><li> Préparer des suspensions de cellules colorées à un seul colorant (PI ou Hoechst) comme témoins. Ajouter 2,5 μL de Hoechst ou 1 μL de PI à chaque tube (deuxième et thiRd). </li><li> Préparez un tube double taché. Ceci sera utilisé pour collecter des sous-populations de cellules germinales. Ajouter 2,5 μL de Hoechst et 1 μL de PI au dernier tube. NOTE: Hoechst a une durée de conservation de 2-3 mois. L&#39;utilisation de stocks de colorants plus anciens entraînera des modifications importantes lors de la session FACS. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l&#39;obscurité. Placez les échantillons dans un tube rotatif ou inversez les tubes de 1,5 mL toutes les 5-10 minutes. </li><li> Filtrer la suspension de cellules avec un filtre pré-mouillé de 40 μm et garder la solution filtrée sur de la glace et dans le noir jusqu&#39;à la session FACS. REMARQUE: L&#39;étape de filtration est nécessaire pour prévenir les touffes cellulaires pour FACS. En outre, le traitement avec la DNase (voir la figure 1 ) ou le sel dipotassique d&#39;acide 2-Naphthol-6,8-disulfonique (NDA 20 ) peut être utilisé pour limiter l&#39;agglutination cellulaire. Des périodes d&#39;attente prolongées affecteront le signal fluorescent détecté pendant les FACS et peuvent entraîner une augmentation de la mort cellulaire. </li&gt; </ol> 5. Paramétrage de la cellule activée par fluorescence (FACS) et purification des cellules testiculaires <ol><li> Préparez les tubes collecteurs FACS. <ol><li> Enduire 5 ml de tubes à base ronde en polypropylène ou 1,5 mL avec 400 μL de FBS pour la collecte des cellules. Décanter l&#39;excès de FBS après le revêtement. </li><li> Ajouter le milieu de collecte FACS (1x DMEM + 10% de sérum bovin fœtal, FBS) aux tubes: 1 mL pour tubes de 5 mL ou 100 μL pour tubes de 1,5 mL. </li></ol></li><li> Configurez les conditions de tri appropriées dans le trieur et le logiciel. REMARQUE: D&#39;autres machines de tri de cellules et logiciels d&#39;analyse peuvent être utilisés avec les stratégies de configuration et de verrouillage similaires décrites ci-dessous. Les conditions décrites ici ont été adaptées de Gaysinskaya et Bortvin 2 , Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 , et Getun, et al. 4 <ol><li> Chargez un laser ultraviolet avec 463/2Filtre passe-bande de 5 nm pour détecter le Hoechst blue et le filtre passe-bande LP de 680 nm pour détecter le rouge Hoechst et pour détecter le PI. </li><li> Utilisez un miroir dichroïque 555DLP pour distinguer le bleu de la fluorescence rouge. </li><li> Utiliser une buse de 70 μm et trier les cellules à une vitesse de 1000-2000 cellules / seconde. NOTE: L&#39;efficacité de tri est directement influencée par le débit. Des débits élevés (&gt; 3500 événements / s) augmentent la vitesse de tri mais entraînent une contamination des populations. Voir référence 12 pour plus d&#39;informations. </li></ol></li><li> Réglez les portes en utilisant des échantillons de contrôle. <ol><li> Charger et exécuter l&#39;échantillon non étagé. </li><li> Exclure les débris cellulaires basés sur le modèle FSC vs SSC. Les débris cellulaires apparaîtront dans le quadrant inférieur gauche de l&#39;intrigue. Réglez arbitrairement le seuil pour les débris cellulaires par l&#39;utilisateur ou le technicien du trieur de cellule. </li><li> Portez sur des cellules individuelles en ajustant le seuil pour FSC et la largeur d&#39;impulsion. Les différents trieurs de cellules ont différentes façons de distinguerGuild singlets. Comme la largeur d&#39;impulsion reflète les cellules de temps pour transiter le laser, les cellules individuelles ont des valeurs inférieures par rapport aux agrégats multicellulaires. Le seuil de réglage sur un tracé pour FSC vs largeur d&#39;impulsion peut être utilisé pour sélectionner des singlets. </li><li> Réglez des tensions optimales du tube photomultiplicateur (PMT). </li><li> Utiliser des cellules colorées non colorées et colorées uniques pour établir le seuil du signal de fluorescence PI ou Hoechst. REMARQUE: Il est important d&#39;optimiser les tensions PTM de base pour les cellules d&#39;intérêt afin d&#39;établir la plage de fluorescence appropriée pour chaque colorant. Ceci est essentiel pour une détection et une sensibilité optimales du signal. Les cellules témoins tachées et non colorées sont utilisées pour établir une gamme de cellules colorées négativement et positivement avec des colorants PI et / ou Hoechst et minimiser le bruit dans les signaux. Pour d&#39;autres explications sur l&#39;optimisation de la tension PMT à l&#39;aide de cellules témoins, reportez-vous à Gaysinskaya et Bortvin 2 </li><li> Porte sur cellule en directS basé sur la coloration PI (PI négatif) et la trame FSC. Les cellules mortes seront positives pour la fluorescence PI. </li><li> Définir la porte de contenu en ADN en traçant un histogramme des nombres de cellules basés sur la fluorescence bleue Hoechst. 3 pics avec des concentrations croissantes de fluorescence Hoechst bleu devraient apparaître, représentant des cellules haploïdes (1C), diploïdes (2C) et tétraploïdes (4C). Réglez 3 portes, une pour chaque pic. </li><li> Observez au moins 500 000 événements sur le plan FSC vs SSC avant de procéder à un déclenchement sur les populations de cellules germinales. </li></ol></li><li> Portent différentes populations de cellules germinales. <ol><li> Mélanger l&#39;échantillon taché Hoechst / PI. </li><li> Définissez les trois premières portes parentales communes à toutes les populations. <ol><li> Exclure les débris cellulaires en fonction de la trame FSC vs SSC. Sélectionnez les caractères individuels en fonction de la trame FSC vs largeur d&#39;impulsion. Sélectionnez les cellules vivantes en fermant les cellules PI négatives. </li></ol></li><li> Définir la porte de la spermatogonie. </li><li> Plot PI cellules négatives basées sur la fluorescence bleue et rouge HoechstIntensités. La spermatogonie apparaît comme une population latérale (voir la figure 1 ). </li><li> Définir des portails pour les populations de cellules germinales restantes. REMARQUE: Reportez-vous à la figure 1 et à la figure 2 supplémentaire pour les détails visuels. </li><li> Plot PI cellules négatives dans la porte de contenu d&#39;ADN. <ol><li> Pour les spermatides, utilisez le pic avec la plus faible fluorescence Hoechst (1C). </li><li> Pour les spermatocytes II, garez le pic avec une fluorescence Hoechst intermédiaire (2C). </li><li> Pour les spermatocytes I, garez le pic avec la plus grande fluorescence Hoechst (4C). </li></ol></li><li> Tracer l&#39;intensité de fluorescence bleue et rouge de Hoechst pour affiner les populations de spermatocytes et de spermatozoïdes à partir des portes de contenu d&#39;ADN. </li></ol></li><li> Collectez les portes de sous-population sélectionnées dans les tubes de collecte précédemment préparés. Chaque testicule prendra en moyenne 45 minutes à 1,5 h pour collecter environ 0,5 à 6,0 x 10 6 cellules pour chaque sous-population. NOTE: Exposition prolongée des cellules à Hoechst maDéplacement légèrement de l&#39;emplacement des populations avec le temps. Rafraîchir les paramètres après 20-30 min de FACS. Le rendement maximal pour chaque sous-population dépendra de l&#39;efficacité de l&#39;étape de dissociation. </li></ol> 6. Evaluation microscopique des cellules purifiées <ol><li> Les cellules recueillies par centrifugation à 500-600 xg à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de solution tampon phosphate glaciaire 1x (PBS) ou 1x DMEM. REMARQUE: Le volume de ré-suspension peut être ajusté en fonction du nombre de cellules triées et de la concentration finale souhaitée. </li><li> Pipettez 40 μL de cellules lavées sur une glissière de verre propre et placez une lamelle. </li><li> Fixer les cellules restantes avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) et stocker des cellules fixes à 4 ° C dans l&#39;obscurité pour référence ultérieure. <ol><li> Pipetter 100 μL 4% de PFA directement dans les tubes de collecte. </li><li> En bref, tourbillonner les tubes ou la pipette quelques fois pour assurer un bon mélange de la suspension cellulaire. </li></ol></li><li> Visualisez les diapositives préparées dans un microscope équipé d&#39;une lampe UV pour détecter la fluorescence Hoechst sous un objectif 63X. Reportez-vous à la section Résultats - Évaluation morphologique des populations de cellules germinales classées - pour plus de détails sur la façon d&#39;identifier les types spécifiques de cellules germinales. </li></ol>

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<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li>
</ol>

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel.

Compte tenu de la dynamique de la chromatine hautement conservée pendant la spermatogenèse chez les mammifères, l&#39;objectif de ce travail était de développer un protocole pour isoler les cellules germinales masculines dans différents stades de différenciation de différents tissus testiculaires de mammifères ( figure 1 ). L&#39;un des principaux obstacles à l&#39;application d&#39;un flux de travail unique à différents modèles animaux est la nécessité d&#39;ajustements spécifiques aux esp...

Compte tenu de l&#39;absence d&#39;un système in vitro représentatif de la progression de la spermatogenèse et de la présence d&#39;une grande hétérogénéité cellulaire chez les testicules, les études sur la biologie des cellules germinales masculines nécessitent des techniques robustes pour isoler les populations enrichies de types de cellules spécifiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été largement utilisé à cet effet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , car il fournit un rendement et une pureté élevés et surpasse d&#39;autres méthodes d&#39;isolement dans le nombre de types de cellules germinales qu&#39;il peut identifier et Sélectionnez 6 , 7 , 8 . Le principe de l&#39;analyse par cytométrie de flux est basé sur la détection de modèles de lumière différentielle suite à l&#39;excitation du faisceau laser de cellules individuelles. À mesure que la cellule passe à travers le laser, elle reflète / diffuse la lumièreÀ tous les angles, proportionnel à la taille de la cellule (diffusion vers l&#39;avant, FSC) et à la complexité intracellulaire (scatter latéral, SSC). Voir Ormerod 9 pour des informations détaillées sur la cytométrie en flux. Les cellules germinales mâles subissent des modifications spécifiques de la teneur en ADN, la structure de la chromatine, la taille et la forme dans différents stades de la spermatogenèse. Ainsi, des populations de cellules distinctes peuvent être identifiées et séparées en combinant la diffusion de la lumière et la coloration de l&#39;ADN avec des colorants fluorescents 10 , 11 . Plusieurs colorants peuvent être utilisés à cet effet (revus dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), tels que Hoechst-33342 (Hoechst) qui a été fréquemment utilisé dans l&#39;analyse par cytométrie de flux de cellules testiculaires au cours de la dernière décennie 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN d&#39;excitation avec la lumière UV, Hoechst émet une fluorescence bleue proportionnelle à la teneur en ADN cellulaire, alors que la fluorescence lointain reflète la variabilité dans la structure de la chromatine et la compaction 1 , 13 , 14 . En conséquence, les cellules germinales mâles dans différents stades de différenciation présentent des modèles spécifiques pendant FACS des suspensions de cellules individuelles colorées par Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Fait intéressant, en raison d&#39;un mécanisme d&#39;efflux de colorant qui n&#39;est actif que pendant le stade spermatogoniale, l&#39;intensité de la fluorescence Hoechst bleu n&#39;est pas proportionnelle à la teneur en chromatine dans ces cellules, et elles se groupent en tant que population latérale pendant Ho-FACS 15 . De plus, la combinaison de la coloration Hoechst avec l&#39;iodure de propidium (PI) non perméable permet aux utilisateurs de discriminer en direct (PI négatif) des cellules mortes (PI positives) pendant FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Cette stratégie a été précédemment utilisée dans les analyses cytométriques de flux de cellules germinales testiculaires et optimisée de manière approfondie dans la souris pour discriminer jusqu&#39;à 9 types de cellules germinales, y compris les cellules dans 4 différents stades de la méiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Aux fins de ce travail, la coloration Hoechst présente trois avantages principaux. Tout d&#39;abord, Ho-FACS a été appliqué avec succès à l&#39;isolement des cellules germinales masculines dans les modèles de souris 1 , 2 , 12 et d&#39;autres rongeurs tels que le rat et le cochon d&#39;Inde 17 , 18 , 19 . Deuxièmement, Hoechst est un colorant perméable aux cellules et ne nécessite pas la perméabilisation de la membrane, de sorte qu&#39;il préserveIntégrité des cellules. Enfin, aucun traitement par RNase n&#39;est requis puisque Hoechst se lie préférentiellement aux séquences d&#39;ADN 1 , 20 (ce qui signifie que l&#39;ARN est conservé et, en plus de l&#39;ADN et des protéines, peut être utilisé pour d&#39;autres études moléculaires en aval du germe différenciation cellulaire. Malgré la similitude dans la pléoïde de l&#39;ADN et / ou la colorabilité observée dans les analyses de cytométrie de flux d&#39;espèces de mammifères (revues dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga 3 ), il existe une grande variabilité dans les protocoles décrits pour l&#39;isolement masculin des cellules germinales par cytométrie de flux. Différentes études ont utilisé des protocoles spécifiques pour la dissociation des tissus et ont utilisé des colorants distincts liés à l&#39;ADN (seul ou en combinaison) et des stratégies de fermeture de FACS dans différents organismes modèles, principalement la souris, le rat et le cochon d&#39;inde. Par conséquent, la comparaison directe des données recueillies pour différentes espèces peut être affectée par le tabagismeDes artefacts techniques non issus de la variabilité entre les méthodologies. Il est important de noter que la conservation frappante de la dynamique de la chromatine dans la spermatogenèse des mammifères (2N-4N-2N-1N) suggère qu&#39;un protocole standardisé pourrait être appliqué transversalement à une variété d&#39;espèces de mammifères. L&#39;objectif de cette étude était de développer un flux de travail unique applicable à différentes espèces de mammifères, en combinant et en adaptant les techniques 2 , 20 précédemment publiées. La normalisation d&#39;une méthode de traitement des tissus a été obtenue en effectuant une dissociation mécanique afin de surmonter la nécessité d&#39;effectuer des ajustements propres aux espèces nécessaires à la digestion enzymatique 5 . Il est à noter que la dissociation mécanique du tissu testiculaire des rongeurs s&#39;est révélée supérieure à la digestion enzymatique des tissus 20 et Ho-FACS des suspensions de cellules individuelles générées par les deux méthodes.Des résultats comparables 5 . En tant que preuve de principe, ce protocole décrit les paramètres utilisés pour isoler jusqu&#39;à 5 populations de cellules germinales: la spermatogonie (SPG); Les spermatocytes primaires (SPC I) et les spermatocytes secondaires (SPC II) et les spermatides (SPD) - round (rSPD) et allongement (eSPD). Fait important, il est facile à mettre en œuvre dans le laboratoire, les principales exigences étant le système de dissociation des tissus et l&#39;accès à un trieur de cellules équipé d&#39;un laser UV. Ce flux de travail ( Figure 1 ) est rapide et direct et permet l&#39;isolement simultané de 4 populations de cellules germinales à partir de tissu testiculaire frais en moins de 2 h. Le temps de traitement réduit est essentiel pour maintenir l&#39;intégrité cellulaire pour d&#39;autres procédures en aval. En outre, sa performance réussie dans 5 espèces différentes suggère qu&#39;il pourrait être largement appliqué dans le clade de mammifères, ce qui en fait la méthode idéale pour isoler les cellules germinales pour des études comparatives de mammifères masculins reproducteurs biolOgy. Ce protocole est composé de trois sections majeures, en dehors des étapes préparatoires: (1) la dissociation mécanique du tissu testiculaire et (2) la coloration des cellules testiculaires avec Hoechst et PI, suivie par (3) le triage FACS de cellules spermatogènes pertinentes. Une fois recueillies, ces populations enrichies de différentes cellules germinales testiculaires de mammifères peuvent être utilisées pour une large gamme d&#39;applications. Ce protocole décrit une méthode de dissociation «unique pour tous» pour purifier les cellules germinales mâles de différentes espèces de mammifères différentes. Selon le type d&#39;étude que les utilisateurs souhaitent effectuer avec les cellules germinales isolées, d&#39;autres supports ou tampons peuvent être utilisés. Les étapes suivantes du protocole consistent à générer des suspensions monocellulaires à partir d&#39;un testicule murin entier.

<table><tbody><tr><td>4 % paraformaldéhyde</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4 % PFA, Pour la fixation des cellules triées</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588 ;</td><td>Système de dissociation testiculaire</td></tr><tr><td>1X Dulbecco modifié Eagle medium</td><td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, pour la dissociation des testicules</td></tr><tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#340591</td><td>Cartouche de désagrégation pour la dissociation des testicules</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Scientific</td><td>#10082139</td><td>FBS, pour la collection FACS</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>#H3570</td><td>Hoecsht, Pour la coloration FACS</td></tr><tr><td>40 et micro ; Filtre à cellules m</td><td>GREINER BIO-ONE#</td><td>89508-342</td><td>Pour la dissociation des testicules</td></tr><tr><td>100x 15 mm</td><td>boîte de Pétri Falcon</td><td>#351029</td><td>Pour la dissection des testicules</td></tr><tr><td>5 mL Tubes à fond rond en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>Pour la collection FACS</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes Eppendorf</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>Pour la collection FACS</td></tr><tr><td>3 mL seringue inutile</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>Pour la dissociation des testicules</td></tr><tr><td>50 mL tube conique</td><td>MIDSCI</td><td></td>#C50R <td>Pour la dissociation des testicules&nbsp ;</td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Invitrogen</td><td>#L7011</td><td>PI, Pour la coloration FACS</td></tr><tr><td>Trieur de cellules MoFlo Legacy</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Pour FACS</td></tr><tr><td>Summit Cell Sorting software</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Pour FACS</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Thermo Scientific</td><td>#AM9625</td><td>PBS, Pour la microscopie</td></tr><tr><td>Lame de verre microscopique</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-544-4</td><td>Pour la microscopie</td></tr><tr><td>Lamelle en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>Pour la microscopie</td></tr><tr><td>Pipette de transfert jetable (3 mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>Pour la dissociation des testicules</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>Pour la dissociation des testicules</td></tr><tr><td>Lame chirurgicale en acier au carbone</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>Pour la dissection des testicules</td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé Countess</td><td>Invitrogen</td><td>#C10227</td><td>Pour le comptage automatique des cellules</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Sigma</td><td>#T8154</td><td>Pour la coloration de la viabilité</td></tr></tbody></table>

une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été l&#39;une des méthodes de choix pour isoler les populations enrichies de cellules germinales testiculaires de mammifères. Actuellement, il permet de discriminer jusqu&#39;à 9 populations de cellules germinales murines à haut rendement et à la pureté. Cette résolution élevée en matière de discrimination et de purification est possible en raison de changements uniques dans la structure et la quantité de la chromatine pendant la spermatogenèse. Ces motifs peuvent être capturés par cytométrie de flux de cellules germinales mâles colorées avec des colorants fluorescents liés à l&#39;ADN tels que Hoechst-33342 (Hoechst). Voici une description détaillée d&#39;un protocole récemment développé pour isoler les cellules germinales testiculaires de mammifères. En bref, des suspensions de cellules individuelles sont générées à partir du tissu testiculaire par dissociation mécanique, doublement colorées avec Hoechst et iodure de propidium (PI) et traitées par cytométrie en flux. Une stratégie de verrouillage en série, y compris le choix des cellules vivantes (PI négatif) avec une teneur différente en ADN (intensité Hoechst), iS utilisé lors du tri FACS pour discriminer jusqu&#39;à 5 types de cellules germinales. Ceux-ci incluent, avec des puretés moyennes correspondantes (déterminées par évaluation microscopique): spermatogonie (66%), spermatocytes primaires (71%) et secondaires (85%) et spermatides (90%), séparés en rond (93%) et allongés (87%) sous-populations. L&#39;exécution de l&#39;ensemble du flux de travail est simple, permet d&#39;isoler 4 types de cellules simultanément avec la machine FACS appropriée et peut être effectuée en moins de 2 h. Étant donné que le temps de traitement réduit est crucial pour préserver la physiologie des cellules ex vivo , cette méthode est idéale pour les études à haut débit en aval de la biologie des cellules germinales masculines. En outre, un protocole normalisé pour la purification multispécifique de cellules germinales de mammifères élimine les sources méthodologiques de variables et permet d&#39;utiliser un seul ensemble de réactifs pour différents modèles animaux.

Suspensions cellulaires simples de la dissociation mécanique du tissu testiculaire La figure 2 compare les suspensions de cellules individuelles obtenues par dissociation mécanique du tissu testiculaire de souris dans différentes conditions. Les échantillons obtenus en traitant du tissu frais, non colorés ( Figure 2A ) ou colorés avec Hoechst ( Figur...

Ce travail décrit la standardisation d&#39;une méthode pour obtenir des populations de cellules germinales purifiées à partir d&#39;un tissu testiculaire de différentes espèces de mammifères. C&#39;est un protocole simple qui combine la dissociation des testicules mécaniques, la coloration avec Hoechst-33342 et l&#39;iodure de propidium, et le triage FACS, avec de larges applications dans des études comparatives de la biologie de la reproduction masculine.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

L'objectif général de cette procédure normalisée est d'isoler des types cellulaires germinaux mâles distincts à partir de différentes espèces de mammifères en utilisant un seul protocole. Cette méthode peut faciliter l'étude moléculaire de la spermatogenèse par une analyse à haut débit de différents types de cellules germinales. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'un seul jeu de réactifs peut être appliqué à diverses espèces de mammifères pour l'isolement simultané de quatre populations cellulaires germinales mâles différentes.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons décidé d'étudier l'évolution de motifs spécifiques de régulation de l'expression des gènes chez différents mammifères. Chris Holley, technologiste médical du Siteman Flow Cytometry Core, montrera comment utiliser le trieur cellulaire et définir les fenêtres de tri. Commencez par enlever le capuchon d'un testicule de souris unique et découpez le tissu en petits morceaux.Ensuite, utilisez une pince pour transférer de petits morceaux de tissu sur une cartouche de dissociation tissulaire de 50 micromètres préalablement humidifiée. Ajoutez un millilitre de milieu DMEM à la cartouche, puis placez la cartouche de dissociation tissulaire dans le système de dissociation tissulaire. Tournez le bouton de la position veille à la position marche, et traitez le tissu pendant cinq minutes.Ensuite, retirez la cartouche et utilisez une seringue jetable de trois millilitres pour aspirer la suspension cellulaire par le port de la seringue. Une fois tout le liquide récupéré, filtrez les cellules à travers deux filtres individuels jetables préhumidifiés de 40 micromètres afin d'éliminer les agrégats cellulaires, puis remettez la suspension dans la cartouche de dissociation. Incubez ensuite les cellules pendant cinq minutes supplémentaires.Pour colorer les cellules en vue d'un tri cellulaire activé par fluorescence, recueillir la suspension cellulaire dissociée dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, transférer 150 microlitres de cellules dans chacun de trois nouveaux tubes de 1,5 millilitre, en ajoutant le volume restant à un quatrième tube de 1,5 millilitre. En réservant le premier tube comme témoin non coloré, ajouter 2,5 microlitres de Hoechst dans le deuxième tube, un microlitre d'iodure de propidium dans le troisième tube, et à la fois le Hoechst et l'iodure de propidium dans le quatrième tube.Après 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière avec une rotation douce, filtrer les suspensions cellulaires à travers des filtres individuels de 40 microns préalablement humidifiés, dans des tubes coniques de 5 mL. Ensuite, placer quatre tubes de collecte contenant du DMEM supplémenté en FBS sous les becs de tri du cytomètre en flux, puis charger le tube témoin non marqué pour l’analyse. Utiliser un graphique de diffusion avant versus diffusion latérale pour exclure les débris cellulaires, et régler le seuil de diffusion avant et la largeur d’impulsion afin de permettre le tri des cellules individuelles.Un émargement rigoureux est essentiel pour optimiser la qualité de l'échantillon recueilli. Assurez la sélection de cellules individuelles en excluant les débris cellulaires et les agrégats multicellulaires. Utilisez les cellules monocolorées pour établir le seuil d'intensité de fluorescence de l'Hoechst et de l'iodure de propidium par rapport à l'échantillon non coloré.Ensuite, chargez l'échantillon expérimental doublement marqué et définissez les trois portes parentales comme vient de l'être démontré. Une fois les trois portes parentales définies, sélectionnez les cellules viables en fonction de l'absence de marquage par l'iodure de propidium et déterminez la teneur en ADN en traçant un histogramme du nombre de cellules en fonction de la fluorescence bleue de l'Hoechst. Définissez une porte pour chacun des trois pics de concentration croissante de fluorescence bleue de l'Hoechst, représentant les cellules haploïdes, diploïdes et tétraploïdes, et observez au moins 500 000 événements sur le diagramme de diffusion avant par rapport à la diffusion latérale.Tracer les cellules négatives pour l'iodure de propidium en fonction de leurs intensités de fluorescence bleue et rouge de l'Hoechst. Les spermatogonies apparaîtront comme une population latérale. L'intensité de fluorescence bleue de l'Hoechst est corrélée au contenu en ADN.Par conséquent, le réglage de cette fenêtre avant la génération des histogrammes bleu et rouge de l’Hoechst garantit la sélection des cellules ayant la ploïdie souhaitée. Pour l’isolement des spermatozoïdes, sélectionner le pic haploïde et choisir la population qui apparaît lorsqu’on représente la fluorescence bleue et rouge de l’Hoechst. Pour l’isolement des spermatocytes II, sélectionner le pic diploïde et choisir la population qui apparaît lorsqu’on représente la fluorescence bleue et rouge de l’Hoechst.Pour l'isolement des spermatocytes I, sélectionner le pic tétraploïde et choisir la population qui apparaît lorsque la fluorescence bleue et rouge de l'Hoechst sont tracées. Ensuite, trier les sous-populations sélectionnées dans des tubes de collecte individuels afin de recueillir environ 0,5 à 6 × 10⁶ cellules pour chaque sous-ensemble cellulaire. Les suspensions cellulaires obtenues par dissociation mécanique de tissu frais, non colorées ou colorées à l'Hoechst, montrent la présence de cellules isolées à divers stades de différenciation.Importamment, les structures cellulaires semblent être préservées, y compris les flagelles des spermatozoïdes. Après l'exclusion des débris cellulaires, 95 à 98 % des cellules sont des cellules uniques, dont 86 à 93 % sont vivantes. Le tracé de la fonction de la fluorescence bleue-rouge de l’Hoechst lors de la cytométrie en flux facilite l'identification de populations spécifiques de cellules germinales testiculaires.Comme prévu, la population d'haploïdes spermatides est la plus abondante, suivie par les cellules diploïdes spermatocytes II et les cellules primaires spermatocytes tétraploïdes, un schéma qui est conservé à travers les espèces. L'analyse microscopique des cellules triées révèle que les spermatogonies présentent une hétérochromatine péricentrique distincte, petite et ronde, qui se colore intensément au Hoechst. Les spermatocytes sont des cellules plus grandes et granuleuses, dotées de noyaux facilement identifiables qui montrent des variations de chromatine caractéristiques des cellules méiotiques dans la sous-population de spermatocytes I, ainsi que des noyaux nucléés ou diakinétiques dans les sous-populations de spermatocytes II.Les spermatides sont de petites cellules haploïdes de forme ronde ou allongée, que l'on peut distinguer des spermatogonies par la présence de chromocentres localisés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que le Hoechst est à la fois fortement sensible et génotoxique, et que la résolution des populations cellulaires peut être améliorée par des périodes d'incubation plus longues, selon les besoins.Après avoir suivi cette procédure, des méthodes omiques à haut débit peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant les modifications épigénétiques ou l'abondance et la diversité des transcrits et des protéines chez les espèces de mammifères dans un contexte évolutif. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de la reproduction masculine pour explorer les mécanismes régulateurs qui contrôlent la progression de la spermatogenèse chez plusieurs espèces de mammifères. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de traiter des échantillons testiculaires pour la cytométrie en flux avec le Hoechst et de la façon d'identifier et d'isoler différents types de cellules germinales mâles en fonction de leur signal au Hoechst.Les colorants liant l'ADN, tels que l'Hoechst et l'iodure de propidium, peuvent être extrêmement dangereux. Portez toujours des équipements de protection individuelle lors de la manipulation de ces réactifs.

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Découvrez une méthode standardisée pour isoler les cellules germinales mâles de mammifères par dissociation mécanique et cytométrie de flux. Ce protocole unique permet l'analyse moléculaire de la spermatogenèse.

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal

Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

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