L'isolement des myoblastes humains, l'évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l'entrée de calcium par magasin

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir une population pure de myoblastes humains à partir du muscle squelettique adulte. Ces cellules sont utilisées pour des études fonctionnelles telles que l’évaluation de la différenciation myogénique et la mesure de l’entrée du calcium opérée par le magasin. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un isolement rapide, simple et reproductible des myoblastes primaires humains.

Ces myoblastes sont le nouvel ex-vivo pour étudier la signalisation calcique lors de la régénération musculaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine musculaire telles que l’identification des canaux ioniques et des facteurs de transcription impliqués dans la différenciation musculaire. Car cette méthode peut fournir un aperçu des fonctions des gènes lors de la différenciation myogénique humaine.

Il peut également être appliqué à d’autres études telles que la possibilité d’utiliser des cellules souches myogéniques pour traiter les dystrophies musculaires. Transférez l’échantillon musculaire dans une plaque stérile de six centimètres, lavez l’échantillon avec du PBS deux fois. Retirez tout tissu adipeux restant et pesez l’échantillon.

Ensuite, ajoutez de la trypsine et coupez le muscle en morceaux de moins de deux millimètres. Une fois haché, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer le tissu dans un flacon de dissociation de 200 millilitres contenant une barre d’agitation, puis continuez à recueillir le tissu haché dans une solution de trypsine jusqu’à ce que le flacon de dissociation soit rempli à 90 millilitres. Maintenant, incubez le tissu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes en remuant doucement.

Au bout d’une heure, ajoutez 10 millilitres de FCS pour arrêter la réaction et homogénéiser le mélange par trituration. Maintenant, chargez des crépines de 70 microns sur deux tubes de 50 millilitres et faites passer la moitié de la suspension cellulaire à travers chaque crépine en pipetant la suspension dans les filtres. Ensuite, faites une suspension des cellules dans un milieu de croissance et plaquez 200 000 cellules sur des plaques de six centimètres avec quatre millilitres de milieu.

Incuber les assiettes en changeant de milieu tous les trois jours. Après cinq à sept jours, les cellules devraient être confluentes à 70 à 80 %, puis colorez-les. Pour commencer, rincez la plaque de cellules confluentes avec du PBS.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de trypsine et laissez l’enzyme agir pendant trois minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant deux millilitres de fluide et collectez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, faites tourner les cellules vers le bas et remettez-les en suspension dans un millilitre de milieu.

Ensuite, faites un comptage des cellules tout en stockant les cellules sur de la glace. Pour l’analyse des faits, chargez sept tubes de 100 000 cellules chacun. Chargez les cellules restantes dans un huitième tube pour le tri.

Lavez les cellules avec un millilitre de tampon de télécopie froid, puis centrifugez les tubes et aspirez et jetez le surnageant. Ajoutez 200 microlitres de tampon de fax avec les anticorps appropriés et laissez les cellules incuber sur de la glace pendant 30 minutes. Après 30 minutes, lavez à nouveau les cellules et mettez-les à nouveau en suspension dans 500 microlitres de tampon de fax, puis triez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.

Après avoir exclu les cellules hématopoïétiques CD45 positives, séparez les cellules négatives CD45 en fonction de l’expression de CD56. Ensuite, on identifie la population CD56 positive pour CD34, CD144 et CD146. Réanalysez une fraction de la population triée, pour vérifier la pureté.

Maintenant, tirez les myoblastes humains et lavez-les avec cinq millilitres de milieu. Ensuite, suspendez-les dans un millilitre de fluide. Transférez la suspension dans une plaque de six centimètres avec quatre millilitres de fluide et incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 7 % de dioxyde de carbone.

Pour cette procédure, faites cultiver des myoblastes et faites un milieu de transvection frais. Incuber le milieu à température ambiante pendant 15 à 20 minutes. Pendant l’incubation du milieu, préparez les myoblastes.

Tout d’abord, rincez-les une fois avec du PBS. Ensuite, essayez de stabiliser les cellules adhérentes. Arrêtez la réaction en ajoutant deux millilitres de fluide.

Ensuite, collectez les cellules dans un tube de 50 millilitres. Faites-les tourner et remettez-les en suspension dans un millilitre de fluide. Pour chaque transvection, préparez 500 000 cellules dans 200 microlitres de milieu.

Pour chaque 500 microlitres de milieu de transvection, ajoutez une aliquote de 200 microlitres de cellules, puis mélangez en utilisant seulement deux coups de pistolet à pipette. Ensuite, laissez les réactions se poursuivre pendant cinq minutes à température ambiante. Après cinq minutes, transférez les réactions dans des boîtes de culture de 3,5 centimètres, chacune contenant une lamelle en verre.

Ensuite, ajoutez 1,3 millilitres de milieu pour un volume final de deux millilitres et incubez les plats. Après 48 heures de différenciation, les cellules peuvent être immunomarquées ou analysées à l’aide de l’imagerie calcique. Pour l’une ou l’autre option, lavez d’abord soigneusement les cellules deux fois en utilisant un millilitre de PBS à température ambiante pour les laver.

Essayez d’éviter de détacher les myotubes. Pour une imagerie calcique, couvrez les cellules lavées avec deux micromolaires fura-2 AM plus un acide thréonique micromolaire dans un milieu contenant du calcium. Ensuite, laissez-les incuber pendant environ 30 minutes avant de mélanger.

Ensuite, lavez les cellules deux fois avec un milieu contenant du calcium non modifié, puis incubez-les pendant 10 à 15 minutes pour l’estérification. Maintenant, retirez la lamelle d’une plaque de culture et installez-la dans la chambre expérimentale. Chargez la chambre avec un milieu contenant du calcium, placez-la sous un microscope, puis lancez l’enregistrement des données.

Fura-2 est excité alternativement à 340 et 380 nanomètres. La lumière d’émission est collectée à 510 nanomètres. La plongée dans les images nanométriques de 340 nanomètres par les images 380, fournit les rapports d’image car les fluctuations et la concentration de calcium sont relativement faibles, acquérir un rapport d’image toutes les deux secondes.

Après deux ou trois minutes, remplacez le milieu par un milieu sans calcium. Ensuite, pendant une ou deux minutes, surveillez l’activité du calcium stocké dans les cellules. Ensuite, ajoutez une thapsigargine micromolaire aux cellules pour épuiser leurs réserves internes de calcium.

Attendez huit à 10 minutes, puis remplacez rapidement le milieu par le milieu contenant du calcium et enregistrez pendant cinq minutes pendant que le calcium pénètre dans les cellules par les canaux successifs. Après avoir terminé l’expérience, analysez les images. Sélectionnez une zone où il n’y a pas de cellules pour la région un, ce qui définit l’arrière-plan, puis sélectionnez une zone dans le cytoplasme pour la région deux.

Les deux régions peuvent être dessinées sur n’importe laquelle des images de la série. Ensuite, allez dans l’onglet Exécuter des expériences et sélectionnez des images de référence pour les canaux 340 et 380, sélectionnez la première région, puis cliquez sur soustraire l’arrière-plan. Maintenant, exécutez l’intégralité de l’expérience pour supprimer l’arrière-plan de toutes les images.

Une fois terminé, cliquez sur l’option de journal des données pour ouvrir une feuille de calcul dans laquelle les données de temps et de ratio sont enregistrées. Les cellules musculaires ont été cultivées, élargies et triées par télécopieur. Les myoblastes représentaient plus de 60 % de la population analysée.

Les myoblastes humains primaires ont ensuite été cultivés dans un milieu de différenciation et immunomarqués pour le facteur de transcription des protéines MEF2 et de la chaîne lourde de la myosine. La majorité des cellules ont exprimé une chaîne lourde de myosine et ont formé des myotubes avec des valeurs d’indice de fusion d’environ 60 %, les 40 % restants des cellules sont restés des cellules mononucléées indifférenciées, également appelées cellules de réserve. L’expérience d’entrée de calcium décrite en magasin a été réalisée avec succès sur les cellules différenciées.

La réalisation de la même expérience sur des cellules transvectées avec de petits ARN interférents, dirigés contre les canaux perméables au calcium de la famille TRPC, montre que l’inactivation a eu un impact mesurable sur l’entrée du calcium opérée par le magasin. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les myoblastes humains des muscles squelettiques adultes. Nous utilisons ces cellules pour étudier les étapes successives de la différenciation musculaire et en particulier, la désactivation des facteurs de transcription et des canaux calciques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois heures si elle est correctement exécutée. Il s’agit d’une méthode rapide, simple et reproductible qui permet d’obtenir le rendement des myoblastes humains. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’empêcher les cultures de myoblastes d’atteindre une confiance totale, car il y aura une différenciation spontanée indésirable.