Name: Localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par ARN In Situ Hybridation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez l'hybridation in situ ARN pour localiser les gènes des récepteurs odorants faiblement exprimés dans les antennes d'insectes. Cette méthode utilise des sondes marquées DIG ou biotine pour une détection sensible.

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NOTE: Pour limiter la dégradation de l&#39;ARN, préparer des solutions en utilisant de l&#39;eau distillée autoclavée humide (à 121 ° C pendant 60 min) et également des matériaux autoclave humides. 1. Préparation des sondes antisens et sentiques RNA ISH <ol><li> Amplification et purification des gènes cible <ol><li> Premièrement, produire un fragment bicaténaire de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) à partir du plasmide contenant l&#39;ADNc complet de LmigOR1 avec une ADN polymerase Taq qui ajoute des adénines aux deux extrémités des fragments. <ol><li> Utiliser un volume de réaction final de 100 μL, contenant 50 μL de mélange réactionnel 2x, 4 μL chacun d&#39;amorces sens et anti-sens ( Tableau 1 ), 1 μl de gabarit plasmidique et 41 μL d&#39;H 2 O exempt de RNase. Utiliser la PCR suivante Protocole: 94 ° C pendant 5 minutes, suivi de 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 1 min, Suivi de 72 ° C pendant 10 min. </li><li> Répétez ces étapes pour produire le fragment double brin de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) et le fragment double brin de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Les amorces utilisées dans ces expériences sont présentées dans le tableau 1 . </li><li> Exécuter des produits de PCR sur 1,2% de gels d&#39;agarose dans un tampon 1x Tris-acétate-EDTA et visualiser l&#39;utilisation de coloration au bromure d&#39;éthidium. </li></ol></li><li> Extrayez ces produits de PCR en utilisant un kit d&#39;extraction de gel. <ol><li> Après électrophorèse, ajouter des bandes d&#39;ADN du gel et placer les tranches de gel dans un tube de 1,5 ml. Ensuite, ajouter 100 μl de tampon de liaison (Buffer PN) pour 0,1 g de tranche de gel. Vortex et incuber à 50 ° C jusqu&#39;à ce que la tranche de gel soit complètement dissoute. </li><li> Insérez une colonne d&#39;adsorption CA2 dans le tube de collecte et ajoutez 500 μL de tampon de balance (Buffer BL). Cela améliore la capacité d&#39;absorption et la stabilité de la membrane de la silice. CentriÀ 12 400 xg pendant 1 min. </li><li> Transférer le mélange de gel dissous dans l&#39;assemblage de la colonne d&#39;adsorption et incuber à la température ambiante pendant 2 min. Ensuite, centrifuger les tubes à 12 400 xg pendant 1 min. Jeter l&#39;écoulement et réinsérer la colonne d&#39;adsorption dans le tube de collecte. </li><li> Ajouter 600 μL de solution de lavage (éthanol ajouté, Buffer PW) deux fois. Centrifuger à 12 400 xg pendant 1 min. Jeter l&#39;écoulement et réinsérer la colonne d&#39;adsorption dans le tube de collecte. </li><li> Videz le tube de collecte et recentrifiez l&#39;assemblage de la colonne à 12 400 xg pendant 2 minutes pour permettre l&#39;évaporation de tout éthanol résiduel. </li><li> Transférer soigneusement la colonne d&#39;adsorption à un tube de centrifugation propre de 1,5 mL. Sécher à l&#39;air la pastille pendant 5 à 10 minutes et redissoudre l&#39;ADN dans un volume approprié ( par exemple 30 μL) d&#39;eau exempte de nuclease. </li><li> Incuber à TA pendant 2 min. Centrifuger à 12 400 xg pendant 2 min. Rejeter la colonne d&#39;adsorption et stocker l&#39;ADN à 4 ° C ou -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Construire les plasmides recombinants <ol><li> Individuellement ligaturer le fragment de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragment de LmigOR2 et 1251 pb fragment de LmigORco dans un vecteur de T qui contient des promoteurs de T7 ( en amont) et SP6 ( en aval) des ARN polymérases adjacentes à l&#39;ADN inséré en utilisant l&#39; ADN ligase T4. Préparer la réaction 10 μL suivante: 5 μL de tampon de ligature 2x, 1 μL de vecteur T, 3 μL (~ 100 ng) de l&#39;ADN du gène inséré et 1 μL d&#39;ADN ligase T4, et incuber O / N à 4 ° C. </li><li> Ajouter 5 ul de chaque plasmide recombinant contenant le fragment de 387 pb de LmigOR1, fragment 1303 pb du fragment LmigOR2 et 1251 pb de LmigORco séparément dans 50 pl de cellules compétentes d&#39; Escherichia coli DH5a dans des tubes stériles de 1,5 ml. <ol><li> Mélanger doucement et mettre les tubes dans de la glace pendant 30 min, puis les incuber pendant 90 s à 42° C. Transformez-les en glace pendant 3 min. </li><li> Ajouter 450 μL de milieu liquide Luria-Bertani (LB) sans ampicilline à chaque tube et les incuber dans un agitateur à 150 tr / min pendant 1 h à 37 ° C pour restaurer le E. coli DH5α. </li><li> Prendre une aliquote de 100 μL de chaque transformant et les utiliser pour inoculer des plaques de substrat solide LB contenant 50 μg / mL d&#39;ampicilline, 24 μg / mL de ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) isopropylique et 40 μg / mL de 5-bromo-4 -chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). </li><li> Incuber ces plaques dans un incubateur constant à 37 ° C pendant 18 h. Écran des plasmides recombinants cibles en utilisant la méthode de criblage bleu-blanc. Séquencez les plasmides recombinants cibles en utilisant le séquençage de Sanger et identifiez les directions des insertions des trois OR. </li></ol></li></ol></li><li> Sélectionnez les endonucléases de restriction pour linéariser les plasmides recombinants <ol><li> Utiliser des endonucléases de restriction tIl suffit non seulement de digérer dans le site de clonage multiple du vecteur, mais aussi de ne pas couper l&#39;ADN de l&#39;insert. Dans cette expérience, tous les 3 gènes sont insérés dans le vecteur T dans la direction correspondant à celle du vecteur. </li><li> Utiliser l&#39;endonucléase de restriction Nco I pour linéariser les plasmides recombinants contenant le fragment 387 pb de LmigOR1 , le fragment de LmigOR2 de 1,303 pb et le fragment de LmigORCO de 1,251 pb pour produire les sondes antisens. Utilisez l&#39;endonucléase de restriction Sp e I pour produire les sondes sens. NOTE: Si la direction d&#39;insertion correspond à celle du vecteur, un site de restriction unique à partir de la fin de T7 est sélectionné pour linéariser le plasmide recombinant et l&#39;ARN polymérase SP6 est utilisée pour préparer la sonde antisens. Un site de restriction unique à partir de la fin de SP6 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant, et l&#39;ARN polymérase T7 est utilisée pour préparer la sonde de détection. Sinon, si la direction de l&#39;insertion ne correspond pas à tLa direction du vecteur, puis un site de restriction unique à partir de la fin de SP6 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant et l&#39;ARN polymérase T7 est utilisée pour préparer la sonde antisens. Le site de restriction unique à partir de la fin de T7 est choisi pour linéariser le plasmide recombinant, et l&#39;ARN polymérase SP6 est utilisée pour préparer la sonde de détection. </li></ol></li><li> Purifier les plasmides recombinants linéarisés <ol><li> Digest 20 pg de chacun des trois plasmides recombinants contenant le fragment de 387 pb du fragment LmigOR1, 1303 pb de LmigOR2 et le fragment 1251 bp de LmigORco en utilisant la restriction Nco I endonucléase dans une réaction de 100 ul contenant 10 ul de 10 x tampon, 40 ul de plasmide de 0,5 pg / pl, 3 pl de Nco I et 47 ul de RNase h 2 O, suivie d&#39;une incubation de 3 h à 37 ° C. </li><li> De même, digérer 20 μg de chacun de ces trois plasmides recombinants, vousChantez l&#39;endonucléase de restriction Spe I. </li><li> Purifier ces plasmides digérés en utilisant un kit d&#39;extraction de gel tel que décrit au 1.1.2. Déterminer les concentrations de ces plasmides recombinants linéarisés extraits par spectrophotométrie et ajuster à 0,5 μg / μL. </li></ol></li><li> Préparer des sondes antisens et sensorielles <ol><li> Utilisez le système de transcription de l&#39;ARN T7 / SP6 pour générer des sondes antisens et sens. L&#39;ARN polymérase SP6 est utilisée pour transcrire l&#39;ARN bicaténaire pour les sondes antisens marquées par la DIG et la biotine pour ces trois gènes OR utilisant des plasmides recombinants linéarisés comme matrice in vitro . L&#39;ARN polymérase T7 est utilisée pour produire des sondes sens. Effectuer la réaction dans un volume final de 20 μL, contenant 2 μL de mélange 10 fois NTP, 2 μL de 10X tampon de transcription, 1 μl d&#39;inhibiteur de RNase, 2 μl d&#39;ARN polymérase T7 ou SP6, 4 μL de 0,5 μg / μL de plasmide linéarisé et 9 μL de H 2 O exempt de RNase, suiviPar incubation de 3 h à 37 ° C. </li><li> Incuber les sondes antisens et senseuses marquées par DIG et biotine pendant 30 minutes avec 1 μL d&#39;ADNase à 37 ° C. Ajouter 2,5 μL de LiCl 5 M et 75 μL d&#39;éthanol absolu, puis incuber les réactions pendant 30 min à -70 ° C. </li><li> Centrifuger à 15 000 xg pendant 30 min à 4 ° C. Découper soigneusement le surnageant. Ajouter 150 μL d&#39;éthanol à 70% pour laver le précipitant. Préparer l&#39;éthanol à 70% (1 L) en ajoutant de l&#39;éthanol à 95% (736,8 mL) à de l&#39;eau distillée stérile (263,2 ml). </li><li> Centrifuger à 15 000 xg pendant 30 min à 4 ° C à nouveau et sécher à l&#39;air libre la pastille pendant 5 à 10 minutes à la température ambiante. Ajouter 25 μL d&#39;H 2 O exempt de RNase pour dissoudre les sondes antisens et sens de l&#39;ARN. </li><li> Si la longueur du gène inséré est supérieure à 1 kb, par la suite, fragmenter les sondes antisens et sondes ARN à une longueur moyenne de ~ 300 pb par incubation dans des solutions tampons bicarbonate-carbonate. Effectuer la réaction dans un volume final de 50 μL, contenant 25 ul de la sonde d&#39;ARN et 25 ul de 60 ° C à la solution de tampon bicarbonate-carbonate de (80 mM de NaHCO 3, 120 mM de Na 2 CO 3, de pH 10,2). Le temps d&#39;hydrolyse requis est donné par une formule 17 précédemment publiée. </li><li> Ajouter 5 μL d&#39;acide acétique à 10% pour arrêter la réaction. Dans cette expérience, fragmenter les sondes antisens et sens LmigOR2 et LmigORco pendant 24 et 23 minutes, respectivement. T = (L o -L f ) / kXL o XL f L o = longueur initiale des fragments en kb L f = la longueur finale des fragments en kb K = la constante de vitesse pour l&#39;hydrolyse, environ 0,11 kb -1 min -1 T = temps d&#39;hydrolyse en min </li><li> Enfin, ajouter 250 μl de tampon d&#39;hybridation et stocker à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des sections de cryostat <ol><li> Precool le freeziNg microtome à -24 ° C. </li><li> Sélectionnez de nouveaux criquets mous adultes qui sont actifs et ont des antennes intactes. Couper les antennes en morceaux de 2-3 mm à l&#39;aide de rasoirs stériles. </li><li> Mettre le composé OCT sur un support de microtome à congélation et mettre un ou deux échantillons sur le composé à l&#39;horizontale. Ensuite, transférez le support dans le microtome de congélation à -24 ° C pour équilibrer jusqu&#39;à ce que le composé gèle. Retirez le support et recouvrez les échantillons avec un petit composé. Transférer le support dans le microtome de congélation à -24 ° C à nouveau pendant au moins 10 min ( Figure 1 ). REMARQUE: Évitez d&#39;obtenir des bulles dans le composé. </li><li> Fixez le support avec les échantillons dans le microtome de congélation, puis sectionnez les échantillons congelés dans des tranches de 12 μm d&#39;épaisseur à -24 ° C. </li><li> Décongeler les tranches une à une sur les diapositives (25 x 75 mm, sans nuclease) et sécher à l&#39;air pendant 10 min. </li></ol> 3. Fixation des sections <ol><li> Après la préparation du cryostat, Mettez les diapositives dans un récipient en plastique (~ 100 x 40 x 80 mm) et réparez les tissus en incubant les diapositives dans une solution de paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Laver les diapositives dans une solution salée tamponnée au phosphate 1X (PBS) pendant 1 min. </li><li> Pour éliminer les protéines alcalines, transférez les diapositives à 0,2 M HCl pendant 10 min. </li><li> Pour éliminer la protéine de surface de l&#39;acide nucléique, transférez les diapositives à 1XPBS avec 1% de Triton X-100 pendant 2 min. </li><li> Lavez les diapositives deux fois pendant 30 s en 1x PBS. </li><li> Enfin, rincer les lames dans la solution de formamide pendant 10 min à 4 ° C. </li></ol> 4. Hybridation <ol><li> Préparer les sondes antisens et sens <ol><li> Utilisez un tampon d&#39;hybridation pour diluer des sondes antisens ou sens dans l&#39;ARN dans les tubes sans nuclease de 1,5 ml. Dans cette expérience, pour toutes les sondes antisens et sens ( LmigOR1, LmigOR2 et LmigOrco ), ajouter 1 μL de sonde à 99 μL tampon d&#39;hybridation par diapositive. D&#39;une manière générale, l&#39;utilisation de dilutions 1: 100 de sondes antisens produit des signaux positifs significatifs et de faibles antécédents utilisant ce protocole. </li><li> Pour la détection chromogène, diluer individuellement les sondes marquées par DIG. </li><li> Pour la détection TSA, diluer LmigOR1 marqué au DIG avec des sondes LmigOrco marquées par la biotine ou LmigOR2 marqué au DIG avec des sondes LmigOR1 marquées par la biotine ensemble dans le tampon d&#39;hybridation. </li><li> Chauffer les dilutions pendant 10 min à 65 ° C et les mettre sur de la glace pendant au moins 5 min. </li></ol></li><li> Hybridation <ol><li> Vidangez les glissières et ajoutez 100 μL de sondes antisens diluées et sens (étape 4.1) aux sections de tissu. Ensuite, placez les lamelles (24 mm x 50 mm, sans nuclease) sur les sections de tissu. </li><li> Placez les diapositives couvertes horizontalement dans une boîte humide (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figure 2 ) et incupez uneT 55 ° C pendant 22 h. Ajouter la solution de formamide ou 1X PBS au fond de la boîte pour garder l&#39;environnement humide, mais ne pas immerger les glissières dans le liquide. </li></ol></li><li> Lavage et blocage. <ol><li> Après l&#39;hybridation, retirez soigneusement les lamelles. Laver les diapositives deux fois pendant 30 min dans une citrate de sodium salée (SSC) 0,1x à 60 ° C. REMARQUE: le lavage permet de placer les glissières dans un porte-coulisseau qui est ensuite placé dans un récipient en plastique et agité doucement sur une bascule (~ 50 tours par minute, figure 2 ). </li><li> Rincer les glissières dans une solution salée tamponnée à tris (TBS) pendant 30 s. </li><li> Ajouter 1 mL de réactif bloquant à 1% dans du TBS additionné de Triton X-100 à 0,03% sur chaque diapositive et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, jetez la solution de blocage. </li></ol></li><li> Immunohistochimie. <ol><li> Pour la détection chromogène, utiliser un réactif de blocage dans le TBS pour diluer 750 unités (U) / mL Anti-digoxigenine AP-anti-anti-conjugaisonDy à 1,5 U / mL AP solution. Ajouter 100 μL de solution AP par coulisseau couvert (24 mm x 50 mm). </li><li> Pour la détection TSA, utiliser un réactif de blocage dans le TBS pour diluer 750 U / mL d&#39;anticorps conjugués anti-digoxigénine AP et anticorps conjugué anti-biotine streptavidine HRP à la solution AP / HRP. Ajouter 100 μL de solution AP / HRP par diaphragme couvert (24 mm x 50 mm). </li><li> Incuber les glissières dans une boîte humide ( Figure 2 ) pendant 60 min à 37 ° C. Utilisez la solution de formamide ou 1X PBS pour garder la boîte humide mais pas détrempée. </li></ol></li></ol> 5. Coloration <ol><li> Retirez les lamelles avec précaution. Laver les diapositives trois fois pendant 5 min dans 1x TBS additionné de 0,05% de Tween-20. Rincer les glissières dans du tampon DAP (détection chromogène: pH 9,5, détection TSA: pH 8,0) pendant 5 min. </li><li> Coloration (détection chromogène) <ol><li> Ajouter 100 μL de solution de substrat NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) (diluée dans DAP;PH 9,5) à chaque diapositive. Placez soigneusement des lamelles (24 x 50 mm) sur les glissières. </li><li> Incuber les diapositives dans une boîte humide avec une solution de substrat pendant 10 min - O / N à 37 ° C. REMARQUE: Vérifiez le développement en regardant les diapositives de temps en temps sous le microscope. </li><li> Lorsque le développement est prêt, arrête la réaction en transférant les diapositives dans l&#39;eau. </li></ol></li><li> Coloration (détection TSA) <ol><li> Utilisez une seringue pour déplacer le substrat HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) à partir du filtre de la seringue (0,22 μm, Figure 2 ). </li><li> Ajouter 100 μL de HNPP / Fast Red substrat par glissière recouvert d&#39;une lamelle (24 x 50 mm). Incuber les diapositives pendant 30 min avec HNPP / Fast Red substrat à la RT. </li><li> Retirez les lamelles avec soin et lavez les diapositives trois fois pendant 5 minutes dans 1X TBS additionné de 0,05% de Tween-20. </li><li> Utiliser 100 μL de substrat TSA / recouvert (24 x 50 mm 2 ) glisser. Incuber les glissières avec un substrat TSA pendant 10 min à la RT. </li><li> Retirez les lamelles avec soin et lavez les diapositives trois fois pendant 5 min dans 1x TBS additionné de 0,05% de Tween-20. </li></ol></li><li> Incorporer les glissières dans du PBS / glycerol (1: 3). REMARQUE: après avoir terminé ces procédures, les diapositives doivent être observées dès que possible parce que le signal fluorescent s&#39;arrête rapidement. </li></ol> 6. Observation <ol><li> Détection chromogène <ol><li> Observez les sections de tissu à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Choisissez les lentilles d&#39;objectif 10X, 20X et 40X pour observer les résultats de la détection chromogène. </li><li> Utilisez le logiciel DP-BSW pour analyser les résultats et capturer les images. </li></ol></li><li> Détection TSA <ol><li> Observer les coupes de tissus à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Les gènes marqués par DIG doivent être observés sous une lumière de 543 nm, présentant une couleur rouge, et les gènes marqués par la biotine devraient êtreObservé sous une lumière de 488 nm, présentant une couleur verte. Quand ils émergent, ils présentent une couleur jaune. </li><li> Choisissez les lentilles d&#39;objectif 20X et 40X pour observer les résultats de la détection TSA, respectivement. </li><li> Utilisez le logiciel FV1000 pour analyser les résultats et capturer les images. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+olfactory+receptors+are+heteromeric+ligand-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels.</a> Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).</li>
<li>Smart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+novel+seven+transmembrane+domain+proteins+that+can+signal+independently+of+heterotrimeric+G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).</li>
<li>Wicher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+odorant+receptors+are+both+ligand-gated+and+cyclic-nucleotide-activated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels.</a> Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).</li>
<li>Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+reception+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).</li>
<li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li>
<li>Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+odor+coding+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).</li>
<li>Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+locusts+and+related+acridids%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of locusts and related acridids.</a> Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).</li>
<li>Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00267823">A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes.</a> Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).</li>
<li>Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+olfactory+receptor+expression+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna.</a> Cell. 96 (5), 725-736 (1999).</li>
<li>Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+co-receptor+Orco+from+the+migratory+locust+%28Locusta+migratoria%29+and+the+desert+locust+%28Schistocerca+gregaria%29%3A+identification+and+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern.</a> Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).</li>
<li>Schultze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+co-expression+pattern+of+odorant+binding+proteins+and+olfactory+receptors+identify+distinct+trichoid+sensilla+on+the+antenna+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS One. 8 (7), e69412(2013).</li>
<li>Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+two+novel+odorant+receptors+in+the+locust+%28Locusta+migratoria%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria).</a> BMC Neurosci. 14, 50(2013).</li>
<li>Saina, M., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+olfactory+receptor+expression+and+localization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).</li>
<li>Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+receptors+are+expressed+in+olfactory+sensory+neurons+of+coeloconic+sensilla+on+the+antenna+of+the+desert+locust+%28Schistocerca+gregaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria).</a> Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).</li>
<li>You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+tuned+odorant+receptor+in+neurons+of+trichoid+sensilla+in+locust%2C+Locusta+migratoria%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria.</a> Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).</li>
<li>Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+two+%22Sensory+Neuron+Membrane+Proteins%22+%28SNMPs%29+of+the+desert+locust%2C+Schistocerca+gregaria+%28Orthoptera%3A+Acrididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae).</a> J Insect Sci. 16 (1), 33(2016).</li>
<li>Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAngerer%2C+LM+%22In+situ+hybridization%22">In situ hybridization</a>. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2(1992).</li>
<li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li>
<li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose%3A+Bio-blots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li>
<li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li>
<li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à divulguer ni aucun autre conflit d&#39;intérêts.

Il est difficile d&#39;effectuer l&#39;ARN ISH pour localiser les gènes OU dans les antennes d&#39;insectes car les niveaux d&#39;expression des gènes OR, à l&#39;exception de l&#39; ORco , sont très faibles et la conservation des tranches histologiques d&#39;antennes d&#39;insectes est très difficile. En outre, la détection TSA est également très délicate. Pour résoudre ces problèmes, les mesures suivantes devraient être prises. Les antennes sont sélectionnées à partir de criquets adultes nouvellement moustach...

Les antennes à insectes, qui sont les organes chimiosensibles les plus importants, sont recouvertes de nombreuses structures capillaires - appelées sensilla - qui sont innervées par les neurones récepteurs olfactifs (ORN). Sur la membrane des ORN d&#39;insectes, les récepteurs odorants (OR), un type de protéine contenant sept domaines transmembranaires, sont exprimés avec un corecepteur (ORco) pour former un hétérother qui fonctionne comme un canal ionique 1 , 2 , 3 odorant-gated. Différentes OR répondent à différentes combinaisons de composés chimiques 4 , 5 , 6 . Les langoustes ( Locusta migratoria ) s&#39;appuient principalement sur des indices olfactifs pour déclencher des comportements importants 7 . Les OR sont des facteurs clés pour la compréhension des mécanismes moléculaires olfactifs. Localiser un gène spécifique OR acridien au neurone d&#39;unLe type sensillum morphologiquement spécifique par ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) est la première étape dans l&#39;exploration de la fonction OR. L&#39;ARN ISH utilise une sonde d&#39;ARN complémentaire marquée pour mesurer et localiser une séquence d&#39;ARN spécifique dans une section de tissu, des cellules ou des montures entières in situ , fournissant des informations sur les processus physiologiques et la pathogenèse de la maladie. Les sondes d&#39;ARN marquées à la digoxigénine (DIG-marquées) et à la biotine ont été largement utilisées dans l&#39;hybridation d&#39;ARN. L&#39;étiquetage de l&#39;ARN avec la digoxigénine-11-UTP ou la biotine-16-UTP peut être préparé par transcription in vitro avec des ARN polymérases SP6 et T7. Les sondes d&#39;ARN marquées par DIG et biotine présentent les avantages suivants: non radioactifs; sûr; stable; très sensible; Très spécifique; Et facile à produire en utilisant la PCR et la transcription in vitro . Les sondes d&#39;ARN marquées par des DIG et des biotines peuvent être détectées de manière chromogène et fluorescente. Les sondes d&#39;ARN marquées par DIG peuvent être détectées avec de l&#39;anti-digoxigénine AlkaliNe phosphatase (AP) - anticorps conjugués qui peuvent être visualisés soit avec des substrats chimioluminescents très sensibles, chlorure de nitroblue tétrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine (NBT / BCIP) en utilisant un microscope optique ou avec 2 -hydroxy-3-naphtoïque-2&#39;-phénylanilide phosphate (HNPP) couplé au sel de chlorure de hemi-zinc de 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium (Fast Red) en utilisant un microscope confocal. Les sondes d&#39;ARN marquées par la biotine peuvent être détectées avec des anticorps conjugués anti-biotine et streptavidine avec des peroxydases de pistax (HRP) qui peuvent être visualisés avec des fluorescéine-tyramides à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal. Ainsi, une hybridation fluorescente in situ à deux couleurs peut être effectuée pour détecter deux gènes cibles dans une tranche en utilisant des sondes d&#39;ARN marquées par DIG et biotine. L&#39;ARN ISH avec des sondes marquées par DIG et / ou biotine a été utilisé avec succès pour localiser des gènes liés à l&#39;olfactif, tels que l&#39; OR , le récepteur ionotropique, la protéine de liaison aux odeursEt la protéine membranaire des neurones sensoriels, dans les antennes d&#39;insectes, mais sans s&#39;y limiter, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria et la crique du désert Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Cependant, il existe deux défis importants lors de l&#39;exécution de l&#39;ARN ISH pour les OR d&#39;insecte: (1) Les gènes OU (sauf ORco ) sont exprimés à des niveaux faibles et seulement dans quelques cellules, ce qui rend la détection du signal très difficile et (2) la préservation des tissus d&#39;insectes pour L&#39;histologie, de sorte que la morphologie est préservée et que le bruit de fond est faible, peut être difficile. Dans cet article, un protocole détaillé et efficace décrivant l&#39;ARN ISH pour la localisation des gènes OU dans les insectesDes antennes sont présentées, y compris la détection chromogène et l&#39;amplification du signal Tyramide (TSA).

<table><tbody><tr><td><fort>Matériaux</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&fois ; TSINGKETM Master Mix</td><td>TSINGKE, Chine</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>Sans RNase H2O</td><td>TIANGEN, Chine</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>AGAROSE RÉGULIÈRE G-10</td><td>BIOWEST, ESPAGNE</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de liaison</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, Chine</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td> buffer <td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, Chine</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Solution de lavage</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, Chine</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, États-Unis</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, États-Unis</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha ;</td><td>TIANGEN, Chine</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco,</td><td>États-Unis 1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta ;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, Chine</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>Nco I</td><td>BioLabs, Nouvelle-Angleterre</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit Roche</td><td>, Suisse</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotine RNA</td><td>Labeling Kit Roche, Suisse</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Label, Roche, Suisse</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, Chine</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Pays-Bas</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Lames</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, Chine</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, États-Unis</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, États-Unis</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de tétrazolium nitroblue / sel de toluidine 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate</td><td>Roche, Suisse</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&times ; Tris-acétate-EDTA</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>V900483-1KG</td><td>0,04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1& fois ; Tris-acétate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, Chine</td><td>10000292</td><td>0,12 % d’acide acétique</td></tr><tr><td>1& fois ; Tris-acétate-EDTA</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>03677</td><td>Sel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) milieu liquide</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) milieu liquide</td><td>MERCK, Allemagne</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone de caséine (Tryptone)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) milieu liquide</td><td>MERCK, Allemagne</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Extrait de levure</td></tr><tr><td>Plaque à substrat solide LB</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019392</td><td>10 g/L Plaque</td></tr> à <tr><td>substrat solide NaCl LB</td><td>MERCK, Allemagne</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone à partir de caséine (Tryptone)Plaque à</td></tr> <tr><td>substrat solide</td><td>LB MERCK, Allemagne</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Extrait de levure</td></tr><tr><td>Plaque à substrat solide LBB</td><td>WISENT ING, Canada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Gélose de qualité bactériologique</td></tr><tr><td>10&fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,1)</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019392</td><td>8,5 % NaCl</td></tr><tr><td>10&fois ; Solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,1)</td><td>Sigma,</td><td>États-Unis V900041-500G</td><td>14 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>10&times ; Saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,1)</td><td>Sigma,</td><td>États-Unis V900268-500G</td><td>80 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>10&fois ; Solution saline tamponnée au tris (TBS, pH 7,5)</td><td>Sigma,</td><td>États-Unis V900483-1KG</td><td>1 m Tris-Base</td></tr><tr><td>10&fois ; Solution saline tamponnée au tris (TBS, pH 7,5)</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019392</td><td>1,5 M</td></tr><tr><td>Tampon de détection NaCl (DAP) &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; détection chromogène pH 9,5&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Détection TSA pH 8.0</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tampon de détection Tris-Base</td></tr><tr><td>(DAP) &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; détection chromogène pH 9,5&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Détection TSA pH 8,0</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019392</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Tampon de détection NaCl (DAP) &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; détection chromogène pH 9,5&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; Détection TSA pH 8.0</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl2&middot ; 6H2O</td></tr><tr><td>20&fois ; citrate salin-sodium (pH 7,0)</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20& fois ; citrate salin-sodique (pH 7,0)</td><td>Sigma,</td><td>États-Unis V900095-500G</td><td>0,3 M Na-Citrate</td></tr> 4 % solution <tr><td>de paraformaldéhyde (PFA, pH 9,5)</td><td>Sigma,</td><td>États-Unis V900894-100G</td><td>4 % paraformaldéhyde</td></tr><tr><td>Tampon de carbonate de sodium</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>V900182-500G</td><td>0,1 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Tampon de carbonate de sodium (pH 10,2)</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO3</ Tampon >carbonate de</td></tr> <tr><td>sodium (pH 10,2)</td><td>Sigma, États-Unis</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na2CO3</td></tr><tr><td>Solution de formamide (pH 10,2)</td><td>MPBIO, États-Unis</td><td>FORMD002</td><td>50 % de solution de formamide désionisée</td></tr><tr><td>(pH 10,2)</td><td></td><td></td><td>5&times ; Tampon bloquant le citrate salin-sodium</td></tr><tr><td>dans TBS</td><td>Roche, Suisse</td><td>11175041910</td> Tampon bloquant <td>Blot 1 %</td></tr><tr><td>dans TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td> Tampon bloquant <td>Triton X-100 0,03</td></tr> % <tr><td>dans TBS</td><td></td><td></td><td>1&times ; Solution saline de</td></tr><tr><td>phosphatase alcaline</td> tamponnée Tris <td>Roche, Suisse</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/mL anti-digoxigénine phosphatase alcaline conjuguée Tampon</td></tr><tr><td></td><td></td><td>bloquant dans la solution de</td>phosphatase<td>alcaline</td> TBS</tr><tr>/<td>peroxydase de raifort</td><td>Roche, Suisse</td><td>11175041910</td><td>1,5 U/mL anti-digoxigénine phosphatase alcaline conjuguée anticorps</td></tr><tr><td>Solution de peroxydase de phosphatase alcaline/radis de cheval</td><td>Kit TSA, Perkin Elmer, États-Unis</td><td>NEL701A001KT</td><td>Anticorps conjugué à 1 % de sreptavidedine de radis de cheval peroxydase</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline/peroxydase de radis de cheval Solution</td><td></td><td></td><td>Tampon de blocage dans le tampon d’hybridation</td></tr><tr><td></td><td>TBS MPBIO, États-Unis</td><td>FORMD002</td><td>Hybridation de formamide désionisé à 50 %</td></tr><tr><td> Tampon</td><td></td><td></td><td>2& fois ; </td></tr><tr><td>Tampon d’hybridation</td> de citrate salin-sodium <td>Sigma, États-Unis</td><td>D8906-50G</td> Tampon d’hybridation <td>10 % sulfate de dextran</td></tr><tr><td></td><td>invitrogen, États-Unis</td><td>AM7119</td><td>20 & micro ; g/mL de levure t-RNA</td></tr><tr><td>Hybridation Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0,2 mg/mL de spermatozoïdes de hareng ADN</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoïque-2'-phénylanilide phosphate/ 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium substrat de sel d’hémi-chlorure de zinc</td><td>Roche, Suisse</td><td>11758888001</td><td>1 % 2-hydroxy-3-naphtoïque acide-2'-phénylanilide phosphate (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>Phosphate de 2-hydroxy-3-naphtoïque-2'-phénylanilide/ 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium substrat de sel de chlorure d’hémi-zinc</td><td>Roche, Suisse</td><td>11758888001</td><td>1 % 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium hémi-chlorure de zinc (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>Acide 2-hydroxy-3-naphtoïque-2'-phosphate de phénylanilide / Substrat de sel de chlorure d’hémi-zinc de 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium</td><td>Tampon de détection</td>Signal de tyramide <td></td><td></td></tr><tr><td> substrat</td><td>d’amplification TSA kit, Perkin Elmer, États-Unis</td><td>NEL701A001KT</td><td>2 % fluorescéine-tyramides</td></tr><tr><td>Substrat d’amplification du signal tyramide</td><td>kit TSA, Perkin Elmer, États-Unis</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluant</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome de congélation</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>Spectrophotomètre cryostat</td><td></td>Jung CM300</tr><tr><td></td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Olympus, Tokyo, Japon</td><td>Olympus IX71microscope</td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td>, Tokyo, Japon</td><td>Olympus BX45 Microscope</td><td></td> confocal</tr></tbody></table>

localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par arn<em&gt; in situ</em&gt; hybridation

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Les insectes ont développé des systèmes sophistiqués d&#39;accueil olfactif pour détecter les signaux chimiques exogènes. Ces signaux chimiques sont transduits par Olfactory Receptor Neurons (ORN) logés dans des structures capillaires, appelées chemosensilla, des antennes. Sur les membranes des ORN, on pense que les récepteurs à l&#39;odorant (OR) sont impliqués dans le codage des odeurs. Ainsi, être capable d&#39;identifier les gènes localisés dans les ORN est nécessaire pour reconnaître les gènes OU, et constitue une base fondamentale pour d&#39;autres études fonctionnelles in situ . Les niveaux d&#39;expression d&#39;ARN d&#39; OR spécifiques dans les antennes d&#39;insectes sont très faibles et la conservation des tissus d&#39;insectes pour l&#39;histologie est difficile. Ainsi, il est difficile de localiser un OR à un type spécifique de sensilla en utilisant l&#39;hybridation in situ de l&#39; ARN. Dans cet article, un protocole d&#39;hybridation in situ ARN détaillé et très efficace, en particulier pour les gènes OU à faible expression des insectes, est introduit. En outre, un OR spécifique Gène waS identifiés en effectuant des expériences d&#39;hybridation in situ fluorescentes à double couleur en utilisant un gène de récepteur coextratifiant, Orco , comme marqueur.

Avec une détection chromogène, un petit sous-ensemble des cellules antenales dans chaque section antenale adulte a été désigné par les sondes antisens LmigOR1 et LmigOR2 marquées par DIG ( Figure 3 ). RNA ISH sur des sections consécutives pour localiser LmigOR1 et LmigOR2 a montré que les cellules antenales exprimant les deux gènes étaient situées dans des grappes d&#39;ORN exprimant LmigORco , ce qui ind...

Cet article décrit un protocole d&#39;hybridation in situ ARN détaillé et hautement efficace, en particulier pour les gènes de récepteur à l&#39;odorant (OR) à faible niveau, ainsi que d&#39;autres gènes, dans les antennes d&#39;insectes utilisant des sondes marquées par de la digoxigénine (DIG) ou biotinées.

Localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par ARN<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

L’objectif global de cette procédure est de localiser les gènes des récepteurs odorants exprimés de faible niveau ainsi que d’autres gènes dans les antennes des insectes à l’aide de sondes marquées à la digoxigénine ou à la biotine. Pour commencer cette procédure, sélectionnez les nouveaux criquets adultes en mue qui sont actifs et ont des antennes intactes, puis coupez les antennes en morceaux de deux à trois millimètres à l’aide de rasoirs stériles. Ensuite, appliquez le composé OCT sur un support de microtome congelé et placez les échantillons sur le composé horizontalement.Transférez le support dans le microtome de congélation à moins 24 degrés Celsius pour équilibrer jusqu’à ce que le composé gèle. Ensuite, sortez le support et recouvrez les échantillons d’un peu de composé. Transférez à nouveau le support dans le microtome de congélation à moins 24 degrés Celsius pendant au moins 10 minutes, puis divisez les échantillons congelés en tranches de 12 micromètres d’épaisseur.Par la suite, décongelez les tranches une à une sur des lames et faites-les sécher à l’air libre pendant 10 minutes. Après avoir préparé les sections du cryostat, placez les lames dans un récipient en plastique et fixez les tissus en incubant les lames dans une solution PFA à 4 % pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après 30 minutes, lavez les lames dans un PBS X pendant une minute.Pour éliminer les protéines alcalines, transférez les lames dans du chlorure d’hydrogène 0,2 molaire pendant 10 minutes, puis transférez les lames dans un PBS X avec 1 % de Triton X-100 pendant deux minutes pour éliminer la protéine de surface de l’acide nucléique. Ensuite, lavez les lames deux fois pendant 30 secondes dans un PBS X. Ensuite, rincez les lames dans une solution de formamide pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Égouttez les lames et ajoutez 100 microlitres de sondes antisens et sensorielles diluées, puis placez les lamelles sur les sections de tissu. Ensuite, ajoutez une solution de formamide ou un X PBS au fond de la boîte pour garder l’environnement humide, mais ne plongez pas les lames dans le liquide. Ensuite, placez les lames couvertes horizontalement dans une boîte humide et incubez à 55 degrés Celsius pendant 22 heures.Après l’hybridation, retirez soigneusement les lamelles. Lavez les côtés deux fois en les agitant doucement sur une bascule pendant 30 minutes dans 0,1 X SSC à 60 degrés Celsius, puis rincez les lames dans un X TBS pendant 30 secondes. Ajouter un millilitre de réactif bloquant à 1 % dans le TBS complété par 0,03 % de Tritin X-100 sur chaque lame et incuber pendant 30 minutes.Ensuite, jetez la solution de blocage. Pour la détection chromogène, utilisez le réactif bloquant dans le TBS pour diluer 750 unités par millilitre d’anticorps conjugués anti-digoxigénine-AP à 1,5 unité par millilitre de solution AP. Par la suite, ajoutez 100 microlitres de solution AP à chaque lame couverte.Pour la détection TSA, utilisez un réactif bloquant dans le TBS pour diluer 750 unités par millilitre d’anticorps conjugués anti-digoxigénine-AP et d’anticorps conjugués anti-biotine streptavidine HRP à la solution AP HRP, puis ajoutez 100 microlitres de solution AP HRP à chaque lame couverte. Ajoutez la solution de formamide ou un X PBS pour garder la boîte humide mais pas détrempée. Ensuite, incubez les lames dans une boîte humide pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.Lavez les lames trois fois pendant cinq minutes dans un X TBS complété par 0,05 %TWEEN 20 sur une bascule. Après cela, rincez les lames dans le tampon DAP pendant cinq minutes en laissant le récipient en plastique sur une bascule agité doucement. Pour la détection chromogène, ajoutez 100 microlitres de solution de substrat NBT/BCIP à chaque lame.Placez soigneusement les lamelles de couverture sur les lames, puis incubez les lames dans une boîte humide avec une solution de substrat pendant 10 minutes jusqu’à toute la nuit à 37 degrés Celsius. Vérifiez l’évolution en regardant les lames de temps en temps au microscope. Lorsque le développement est prêt, arrêtez la réaction en transférant les lames dans l’eau.Pour la détection TSA, utilisez une seringue pour déplacer le substrat HNPP/Fast Red du filtre de la seringue, puis ajoutez 100 microlitres de substrat HNPP/Fast Red à chaque lame recouverte d’une lamelle. Après cela, incubez les lames pendant 30 minutes avec un substrat HNPP/Fast Red à température ambiante. Après 30 minutes, retirez soigneusement les lamelles et lavez les lames trois fois pendant cinq minutes dans un X TBS complété par 0,05 % de 20 %.Incuber les lames avec 100 microlitres de substrat TSA par lame couverte pendant 10 minutes à température ambiante. Retirez soigneusement les lamelles et lavez les lames trois fois pendant cinq minutes dans un X TBS complété par 0,05 % de TWEEN 20 avant d’enrober les lames dans du glycérol PBS. Pour la détection chromogène, observez les coupes de tissus à l’aide d’un microscope optique.On voit ici le motif de marquage des sondes antisens LmigOR1 et LmigORco sur les sections consécutives de l’antenne de sauterelle. Voici le modèle de marquage des sondes antisens LmigORco et LmigOR2 sur les sections consécutives de l’antenne criquet. L’illustration des structures de type dendritique parfois marquées est présentée ici.Pour la détection TSA, observez les coupes de tissus à l’aide d’un microscope confocal. Ici, une hybridation in situ bicolore a été réalisée sur la section antennaire longitudinale pour illustrer l’expression de LmigOR1 et LmigORco. La localisation des cellules exprimant LmigOR1 dans des amas de cellules exprimant LmigORco a confirmé son identité neuronale, et voici une vue rapprochée des zones encadrées.Parfois une structure de type dendritique marquée est indiquée par une flèche, et les zones encerclées indiquent le cluster de neurones récepteurs olfactifs exprimant LmigORco et partageant le même sensillum.

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Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

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