Dosage pour la Phosphorylation et microtubules liaison avec localisation de la protéine Tau dans les cellules du Cancer Colorectal

L’objectif général de cette procédure est d’étudier la phosphorylation de tau, les capacités de liaison des microtubules de tau et la localisation de tau, en utilisant la microscopie confocale dans les cellules cancéreuses colorectales. Cette méthode peut être efficace pour la plupart des domaines de recherche biologique, en particulier la recherche sur le cancer et la démence, où la phosphorylation et la liaison des microtubules sont des facteurs importants. Le principal avantage du test de phosphoratase présenté est qu’il permet de percevoir facilement l’ensemble de la phosphorylation des échantillons de protéines.

Le principal avantage du test de liaison aux microtubules est qu’il s’agit d’une procédure simple pour séparer les protéines de liaison aux microtubules des fractions non liantes. Cependant, le principal avantage de la technique de localisation de la protéine tau est qu’elle nécessite une quantité relativement faible d’anticorps primaires et secondaires. Pour commencer cette procédure, préparez tous les réactifs comme indiqué dans le protocole texte.

Transférer environ un million de cellules HCT 116 dans des boîtes de culture contenant un minimum de milieu essentiel complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline streptomycine. Lorsque les cellules atteignent 65 % de confluence, utilisez un aspirateur pour retirer le milieu supplémenté en FBS. Ensuite, ajoutez du MEM sans sérum, contenant de la curcumine ou du chlorure de lithium.

Incuber à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après cela, lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS glacé et froid. Ajoutez un millilitre de PBS glacé, puis utilisez un grattoir cellulaire pour racler les cellules et les transférer dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre.

Centrifuger pendant quatre minutes à 1800 fois G et quatre degrés Celsius. Nous suspendons les granulés de cellules dans 100 microlitres de tampon RIPA complet à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes, en veillant à tapoter régulièrement les tubes pour lyser les cellules. Ensuite, sonifiez brièvement les échantillons à une amplitude de 10 % en pulsant pendant 0,2 seconde et en arrêtant pendant 0,2 seconde, pour un total de 2 secondes.

Centrifuger l’homogénat cellulaire à 22, 570 fois G et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes étiquetés, puis mesurez la concentration en protéines par le test de Bradford, comme indiqué dans le protocole textuel. Après avoir préparé des échantillons contenant 20 microgrammes de protéines totales, ajoutez deux microlitres de tampon de phosphatase alcaline et 10 microlitres de phosphatase alcaline à chacun.

Ensuite, ajoutez de l’eau distillée, de sorte que le volume final de chaque échantillon soit de 20 microlitres. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant l’incubation des échantillons, préparez des échantillons supplémentaires à la même concentration, mais sans phosphatase à des fins de comparaison.

Au bout d’une heure, arrêtez la réaction en ajoutant soit de l’EDTA à une concentration finale de 50 millimolaires, soit de l’orthovanadate de sodium à une concentration finale de 10 millimolaires. Ajoutez un tampon de chargement de gel 4XSDS fraîchement préparé contenant 400 millimolaires de DTT. À l’aide d’un bloc chauffant, incubez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Vortex les échantillons, puis laissez-les refroidir à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, chargez 13 microlitres d’échantillon par puits ainsi que l’échelle moléculaire pesée sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Connectez le système d’électrophorèse à une source d’alimentation et réglez la tension à 70 volts pendant 20 minutes pour déplacer les échantillons de protéines du gel d’empilement dans le gel de résolution.

Après cela, augmentez à 125 volts et faites fonctionner le gel pendant environ 70 à 120 minutes jusqu’à ce que les échantillons et l’échelle de protéines atteignent la fin du gel. À l’aide d’un système d’électrobuvardage humide, transférez le gel sur une membrane de fluorure de polyvinylidène à 100 volts pendant environ 100 minutes. Ensuite, incubez la membrane pour éponger dans 4 % d’albumine sérique bovine pendant 90 minutes à température ambiante.

Incuber le transfert pendant la nuit dans une solution d’anticorps primaires à 4 degrés Celsius. Le lendemain, lavez la tache trois fois avec PBST, en lavant pendant sept minutes à chaque fois. Incuber dans la solution d’anticorps secondaires incertaine pendant 90 minutes à température ambiante.

Ensuite, lavez avec du PBST quatre fois, chaque lavage durant sept minutes. Développer le transfert à l’aide d’un kit de chimiluminescence selon les instructions du fabricant. Recouvrez le transfert développé d’une pellicule plastique transparente, puis acquérez des images de chimiluminescence du transfert à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence disponible dans le commerce.

Après avoir préparé des échantillons frais, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ultracentrifuger les échantillons à 100 000 fois G et 25 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, transférez 120 microlitres de chaque surnageant contenant du tau non lié dans des tubes séparés, nettoyés et étiquetés.

Ajoutez 120 microlitres de tampon d’échantillon Fibic à la pastille qui contient du tau lié. Après avoir bien mélangé, par vortex et pipetage, transférez le mélange dans des tubes propres et étiquetés. Après avoir préparé des échantillons de concentration protéique équivalente, ajoutez un tampon de chargement de gel 4XSDS frais contenant 400 millimolaires de DTT.

Utilisez un bloc de chaleur pour incuber les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vortex les échantillons, puis laissez-les refroidir à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Chargez 13 microlitres d’échantillon par puits et l’échelle de poids moléculaire sur un gel de polyacrylamide à 10 %.

Connectez les électrodes positive et négative du système d’électrophorèse à une source d’alimentation, puis réglez la tension sur 70 volts pendant 20 minutes. Après cela, augmentez à 125 volts et faites fonctionner le gel pendant environ 70 à 120 minutes jusqu’à ce que les échantillons et l’échelle de protéines atteignent la fin du gel. Utilisez un système d’électrobuvardage humide pour transférer le gel sur une membrane de fluorure de polyvinylidène à 100 volts pendant environ 100 minutes.

Incuber la membrane pour éponger dans 4 % d’albumine sérique bovine pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, incuber toute la nuit dans une solution d’anticorps primaires à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez la tache quatre fois avec du PBST, chaque lavage durant sept minutes.

Incuber le transfert lavé dans la solution d’anticorps secondaire appropriée pendant 90 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez avec du PBST pendant sept minutes en répétant le lavage quatre fois au total. Développer le transfert à l’aide d’un kit de chimiluminescence.

Couvrir d’une pellicule plastique transparente et acquérir des images à l’aide d’un système d’imagerie par chimiluminescence. Pour commencer, placez les lamelles de couverture dans les puits d’une plaque de couverture tissulaire à six puits, puis ensemencez 250 000 cellules dans chaque puits dans le milieu de culture recommandé. Après 24 heures, rincez les cellules deux fois avec du PBS.

Ajoutez du MEM sans sérum, contenant de la curcumine et incubez à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Après cela, lavez à nouveau les cellules avec du PBS glacé. Fixez les cellules dans du formaldéhyde à 3,7 % dans un incubateur à 37 degrés Celsius, dans l’obscurité.

Lavez les cellules avec du PBS, puis fixez les cellules dans du méthanol glacé à 20 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, incubez les cellules sur de la glace dans 3 % BSA et 0,1 % Triconex 100 dans PBS pendant 10 minutes. Lavez les cellules avec du PBS, puis incubez dans un tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 60 microlitres de solution d’anticorps primaires au morceau de fluorure de polyvinylidène coupé dans chaque puits. Placez les lamelles de manière à ce que les cellules entrent en contact avec la solution d’anticorps. Incuber toute la nuit à 4 degrés Celsius dans une chambre sombre et humide.

Le lendemain, lavez les cellules quatre fois avec du PBS. Ajoutez 80 microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chacun des morceaux de fluorure de polyvinylidène, en plaçant les lamelles de manière à ce que les cellules entrent en contact avec la solution d’anticorps. Incuber dans une chambre sombre et humide à température ambiante pendant deux heures.

Après cela, lavez les cellules quatre fois avec du PBS. Montez les échantillons dans le support de montage avec du DAPI, puis fixez les lamelles sur des lames de verre. Ensuite, incubez dans une chambre sombre à température ambiante pendant une heure et demie.

À l’aide d’un microscope confocal, examinez les lames. Dans cette étude, la phosphorylation spécifique de tau est évaluée à l’aide d’un anticorps phospho-tau. On observe que les cellules traitées avec de la curcumine expriment une diminution de la protéine tau à mesure que la concentration de curcumine augmente.

L’expression de Phospho-tau, en revanche, augmente à des concentrations plus faibles de curcumine, ne diminuant qu’à des concentrations très élevées. Les cellules traitées au chlorure de lithium sont ensuite examinées. Comme on peut le voir, l’expression de tau et de phospho-tau est significativement diminuée sous traitement au chlorure de lithium.

La phosphorylation globale est ensuite évaluée par dosage de phosphotase. On observe que la protéine tau migre plus rapidement dans les échantillons traités à la phosphotase par rapport à l’échantillon témoin non traité, ce qui indique que l’échantillon témoin est phosphorylé. Des échantillons de cellules traitées à la curcumine ont montré des résultats très similaires, indiquant que les lignées cellulaires du cancer colorectal traitées ne réduisaient pas la phosphorylation de la protéine tau.

Les échantillons traités à la phosphatase et les échantillons non traités ont été électrophorés, presque dans la même gamme dans les échantillons de cellules traitées au chlorure de lithium, indiquant une réduction de la phosphorylation de la protéine tau. Ensuite, le test de liaison microtubulaire d’échantillons cellulaires est établi avec succès en utilisant tau 352 comme contrôle positif. Comme le montre ici, la curcumine et une faible concentration de traitement au chlorure de lithium entraînent une inhibition de l’activité de liaison des microtubules.

Une microscopie confocale est ensuite réalisée. Après un traitement à la curcumine, on voit la protéine tau se déplacer vers le noyau. Cela confirme des études antérieures, rapportant que la protéine tau nucléaire est un acteur clé dans la protection de l’ADN neuronal.

Après avoir vu cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un test de phosphotase pour déterminer la phosphorylation complète d’échantillons de protéines et comment effectuer un test de liaison des microtubules. Vous devriez être en mesure de comprendre comment exécuter un test d’immunofluorescence par microscopie confocale en utilisant diverses petites quantités d’anticorps. Les procédures présentées ici sont rentables et contribueront potentiellement à la découverte et au développement de nouveaux agents thérapeutiques pour traiter différents cancers de la protéine tau-phorèse.