Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

L’objectif général de cette procédure est de fournir une méthode permettant d’assurer des moyens simplifiés de carbogénation des ACSF de recyclage de petits volumes et de réaliser des enregistrements à long terme des potentiels de champ à l’aide d’une chambre d’enregistrement montée sur un microscope à fluorescence. Cette méthode peut nous aider à répondre aux questions clés dans le domaine des neuroplasticités relatives aux voies de lignine sous-jacentes qui régulent la transmission synaptique et la formation de la mémoire dans un mode cellulaire d’apprentissage et de souvenirs. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de stabiliser le niveau d’oxygène d’un petit réservoir biologique afin d’améliorer la rentabilité des expériences en utilisant des antagonistes ou des agonistes spécifiques.

La préparation des tranches aiguës de l’hippocampe est démontrée par les doctorants, Xia et Weiguang de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, utilisez une lame chirurgicale froide pour disséquer un morceau du cortex dorsal à un angle de 70 degrés le long du bord dorsal de chaque hémisphère. À l’aide d’une spatule en ciment dentaire froide, transférez chaque hémisphère sur un morceau de papier filtre pour sécher brièvement la surface.

Montez les deux hémisphères avec des surfaces fraîchement coupées sur la plate-forme de tranchage glacée à l’aide d’une colle adhésive à action rapide de sorte que l’extrémité caudale des hémisphères fasse face à la lame de rasoir. Ensuite, placez la plate-forme de tranchage dans la chambre de refroidissement d’un vibratome. Remplissez la chambre avec le tampon de tranchage à deux à quatre degrés Celsius et carbogénisez-le.

Après cela, coupez des tranches de 350 micromètres en utilisant les réglages de vibrotome adéquats. Isolez la formation de l’hippocampe du subiculum et des cortex entorhinaux à l’aide de deux canules d’injection comme ciseaux. À l’aide d’une pipette pasteur, retirez les bulles de la maille de maintien des tranches de la chambre d’incubation préalablement préparée.

Ensuite, transférez les tranches qui ont une certaine transparence au niveau de la strate pyramidale de la plate-forme de tranchage sur le grillage de la chambre d’incubation à l’aide d’une pipette pasteur à grande bouche. Dans cette étape, ajoutez un connecteur de tube à trois voies à la sortie du système de recyclage. Connectez le bras central du connecteur de tube à trois voies à un tube d’alimentation en carbogen et régulez le débit avec un débitmètre d’air.

Après cela, ajoutez un deuxième connecteur de tube à trois voies à l’entrée du système de recyclage. Connectez le bras central au tube faisant face au réchauffeur en ligne, le bras supérieur à un tube en silicone mince et le bras inférieur au tube d’entrée du réservoir. Ensuite, placez un presse-tube sur un tube mince en silicone à une position le long du tube où la pulsation de l’ACSF dans la chambre de tranche générée par la pompe péristolique est à son minimum.

Maintenant, faites tremper un petit morceau de papier de nettoyage d’objectif et un treillis en nylon fixé sur un fil de platine en forme de U dans la chambre de coupe d’immersion pendant quelques minutes. Après cela, retirez le fil de platine en forme de U. Arrêtez le recyclage et placez une tranche sur le papier de nettoyage des verres.

Ensuite, placez immédiatement le treillis de maintien de la tranche sur la tranche. Allumez la pompe et laissez la tranche s’équilibrer pendant 30 minutes sans plonger l’objectif dans l’ACSF. Pendant ce temps, remplissez l’électrode d’enregistrement avec de l’ACSF et montez-la dans le porte-pipette.

Vérifiez l’isolation de l’électrode de stimulation métallique en la plaçant dans une solution de bicarbonate de sodium. Connectez l’électrode au pôle négatif d’un générateur de tension continue et observez la formation de bulles à l’extrémité sous un microscope de dissection. Ensuite, placez l’électrode de stimulation en tungstène isolée à l’apoxy testée dans le support du manipulateur et le fil de référence dans la chambre de tranche.

Ajoutez une deuxième électrode de référence dans la chambre et connectez-la à la prise de référence de l’étage de tête de l’électrode d’enregistrement. Dans le logiciel de contrôle de l’amplificateur, cliquez sur la case du mode de pince zéro, puis double-cliquez sur la boîte de liste de liste du gain de sortie. Choisissez un gain de 100, double-cliquez sur la boîte de filtre passe-haut récipient, choisissez trois kilohertz et double-cliquez sur la boîte de liste de filtre passe-bas AC pour choisir 0,1 hertz.

Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur acquérir, ouvrir le protocole. Choisissez un protocole dont les paramètres permettent les stimulations épisodiques et la numérisation des potentiels amplifiés à 10 à 20 kilohertz pendant 50 à 100 millisecondes et qui déclenche automatiquement un isolateur de stimulus 10 millisecondes après le début d’un enregistrement épisodique. Placez les électrodes de stimulation et d’enregistrement en ligne et parallèlement à la couche pyramidale.

Ensuite, cliquez sur acquérir, modifier le protocole et choisissez l’onglet déclencheur dans la fenêtre contextuelle. Cliquez sur la case de la source du déclencheur et choisissez la barre d’espace comme source du déclencheur. Ensuite, cliquez sur le bouton OK et cliquez sur le bouton Enregistrer pour démarrer l’acquisition.

Dans le logiciel d’isolateur de stimulus, cliquez sur la case de contrôle de tension et entrez zéro. Cliquez sur le bouton de téléchargement. Ensuite, cliquez sur la fenêtre du logiciel d’enregistrement et appuyez sur la barre d’espace.

Répétez ce cycle en saisissant séquentiellement des valeurs de 1000 à 8000. Corrélez la force de stimulation avec les valeurs de pente FEPSP et déterminez la force de stimulation nécessaire pour obtenir 40 % de la pente maximale FEPSP. Cliquez sur la case de contrôle de tension et entrez la valeur déterminée.

Ensuite, cliquez sur le bouton de téléchargement. Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le bouton d’arrêt, puis sur le menu d’acquisition. Cliquez sur modifier le protocole et choisissez l’onglet déclencheur dans la fenêtre contextuelle.

Ensuite, cliquez sur la case de la source de déclenchement et choisissez la minuterie interne comme source de déclenchement. Cliquez sur le bouton OK, puis sur le bouton d’enregistrement qui démarre l’enregistrement automatique des potentiels de champ toutes les 60 secondes. Cliquez sur le bouton d’arrêt après 30 à 60 minutes.

Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur acquérir, ouvrir le protocole et choisissez le même protocole que l’enregistrement de base. Cliquez sur le bouton OK, puis sur Enregistrer. Continuez à exécuter automatiquement les enregistrements potentiels sur le terrain pendant deux à quatre heures.

Une fois l’enregistrement terminé, cliquez sur le bouton d’arrêt pour mettre fin à l’enregistrement. Cette figure montre les enregistrements représentatifs de la potentialisation dépendante de l’activité de la transmission synaptique à l’aide de la carbogénation à l’écoulement et de la carbogénation du réservoir avec le recyclage d’un petit réservoir ACSF. La potentialisation a été induite après le point zéro par trois trains de 100 hertz par seconde.

Cette figure montre que la carbogénation à l’écoulement avec recyclage d’un petit réservoir ACSF a amélioré l’induction de la LTD par rapport aux expériences avec carbogénation en réservoir uniquement. Une fois maîtrisée, la préparation de la tranche peut être effectuée en cinq à 10 minutes et un enregistrement stable du potentiel de champ peut également être réalisé pendant de nombreuses heures s’il est effectué correctement. Lors de cette procédure, il est important d’ajuster votre niveau de carbogénation, votre vitesse de perfusion, la position des électrodes et le stress de stimulation de votre équivalence spécifique.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme le patch clamp, la microscopie médico-légale peuvent être effectuées afin de répondre aux questions supplémentaires telles que la virilisation de la sève, la localisation cellulaire des sondes de ravin en réponse à l’induction de la plasticité synaptique dépendante de l’activité. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la neuroplasticité pour explorer la plasticité synaptique dépendante de l’activité en tant que mode cellulaire d’apprentissage et de mémoire dans des tranches hippocampiques in vitro de gènes de souris bien onglets et transgéniques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la préparation de coupes aiguës à partir de l’hippocampe temporal et comment obtenir des conditions stables pour l’enregistrement à long terme des transmissions synaptiques à l’aide d’un petit volume d’ACSF recyclé.

N’oubliez pas que travailler avec des animaux et des composés chimiques peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et la désinfection appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.