Name: Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Découvrez une méthode d'électrophysiologie pour enregistrer la plasticité synaptique dans des tranches d'hippocampe aiguës avec stabilisation de l'oxygène. Cette technique améliore l'efficacité des expériences en neurosciences.

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W.W. menée, analysé et les expériences et a écrit le manuscrit. D.X. et C.P. a aidé à la préparation de la figure et mené les expériences. Ce travail a été soutenu par la FSNC (31320103906) et 111 (B16013) à C.T.

Les animaux ont été maintenus selon les normes établies de protection des animaux et les procédures des instituts des sciences cérébrales et état clé laboratoire de médecine neurobiologie de Fudan University, Shanghai, Chine.
1. préparation de la solution
Remarque : Consultez la Table des matières.
<ol>
	<li>Préparer le tranchage tampon (solution de mis à jour le Gey) : 92 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 2,5 mM glucose 25 mM, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pyruvate et 10 mM MgSO40,5 mM CaCl2.</li>
	<li>Ajuster le pH à 7,6 à l’aide de 1 NaOH M sans carbogenation.</li>
	<li>Stocker le tampon à 4 ° C. Remarque : Le titrage clarifie le liquide trouble. L’osmolalité est 305-310 mOsm. La carbogen21 contient 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène.</li>
	<li>Préparer le FSCA en diluant un 10 x solution de réserve du FSCA qui ne contient-elle pas de bicarbonate et glucose, ce qui donne une composition finale de : 124 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2et 1,25 mM KH2PO4.</li>
	<li>Ajouter le bicarbonate et le glucose pour atteindre 10 mM glucose et 26 mM NaHCO3.</li>
	<li>Carbogenate l’aCSF à travers un tube de silicone perforée avec une fin bloqué immédiatement après l’ajout du NaHCO3.</li>
	<li>Mesurer le pH tandis que carbogenating (pH 7,3 à 7,4). Remarque : La capacité de la mémoire tampon peut être ajustée légèrement en modifiant la quantité de NaHCO3. Étant donné que le pH qui en résulte est dépendante de la température, il est nécessaire de vérifier le pH qui en résulte tout en carbogenating à la température de travail (par exemple, 30 ° C).</li>
</ol>
2. préparation de tranches d’hippocampe aiguës
Remarque : Consultez la Table des matières.
<ol>
	<li>Placez un maillage tenue de tranche dans une chambre d’incubation pour obtenir des tranches cérébrale aiguë, emplit la chambre FSCA et carbogenate (4-6 L/h) au moins 30 min22 à 28-30 ° C.</li>
	<li>Refroidir les instruments chirurgicaux jusqu'à 2-4 ° C.</li>
	<li>Placer un bécher en verre rempli de froid et carbogenated tampon (2-4 ° C), maintenu dans un mélange d’eau et de glace, près le vibratome de tranchage.</li>
	<li>Anesthésier des rats ou des souris jusqu'à ce que les réflexes cornéens disparaissent (30-50 s) l’isoflurane en prenant 500 µL dans un bocal de verre de 2 L ou 12,5 µL dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Isoler le cerveau à l’aide d’une méthode décrite et visualisées en détail dans les publications de Mathis et al. (2011) 23 et Yuanxiang et al. (2014) 24.</li>
	<li>Refroidir le cerveau jusqu'à 2-4 ° C dans un tampon de tranchage glacé (pendant au moins 2 min) avant de disséquer le cervelet et séparant les hémisphères.</li>
	<li>Utilisez une lame chirurgicale froide pour disséquer un morceau du cortex dorsal à un angle de 70° sur le bord dorsal de chaque hémisphère25 pour obtenir des tranches transversales de la ventrale et la partie intermédiaire de l’hippocampe, comme illustré à la Figure 1C et E.</li>
	<li>Avec une spatule de ciment dentaire froid, transmettre un hémisphère à un morceau de papier filtre brièvement sécher la surface créée (1-2 s).</li>
	<li>Monter les deux hémisphères avec surfaces fraîchement coupées sur la plate-forme de tranchage glacée à l’aide de colle à action rapide ; a l’extrémité caudale du visage hémisphères la lame de rasoir (Figure 1D).</li>
	<li>Placez la plateforme tranchage dans la chambre de refroidissement d’un vibratome et remplir cette chambre avec le tampon de tranchage (2-4 ° C). Carbogenate à l’aide d’un tube de silicone perforé.</li>
	<li>Couper 350 µm tranches à l’aide de paramètres vibratome adéquat (par exemple, vitesse d’avancement lame : 1,2 mm/s, amplitude de la lame : 1 mm).</li>
	<li>Isoler la formation hippocampique du subiculum et le cortex entorhinal, à l’aide de deux canules d’injection (&#62; 28 G) comme des ciseaux.</li>
	<li>Retirer les bulles de la maille de tranche-tenue de la chambre d’incubation préalablement préparée à l’aide d’une pipette Pasteur.</li>
	<li>Transférer les tranches qui ont une transparence à la pyramidale de la strate de la plate-forme de tranchage sur le maillage de la chambre d’incubation. Éviter tout pliage, étirements, qui se chevauchent et flottant en aspirant le FSCA et la tranche dans une pipette Pasteur de grande bouche. Remarque : L’ensemble de la procédure (étape 2.5-2.14) peut prendre 5-10 min ; par conséquent, il est important de vérifier la température de la solution tampon au fil du temps à le maintenir à 4 ° C.</li>
	<li>Incuber les tranches à 30 ° C pendant au moins 1,5 à 2 h dans la chambre d’incubation et de fournir des carbogen pour 4-6 L/h. Remarque : Réglez la vitesse d’écoulement de la carbogen à faire circuler la mémoire tampon dans l’incubateur, mais éviter les tranches flottantes.</li>
</ol>
3. les modifications de la Carbogenation pour le FSCA recyclage de petits réservoirs
<ol>
	<li>Ajouter un connecteur 3 voies tube à la sortie du système recyclage (Figure 2B).</li>
	<li>Connecter le bras central du connecteur 3 voies tube avec un tube d’alimentation de carbogen et de réguler le débit avec un compteur de débit d’air (3-4 L/h, Figure 2D et Figure 4C).</li>
	<li>Ajouter un second connecteur de tube de 3 voies à l’entrée du système de recyclage. Connecter le bras moyen au tube face à l’appareil de chauffage en ligne, le haut du bras dans un tube mince de silicium (10 cm de longueur) et le bras inférieur dans le tube d’entrée du réservoir (filtre passe-bas ; Figure 4 ( C).</li>
	<li>Placer un presse-citron tube sur un tube de silicium mince (OD : 2 mm) à une position le long du tube où la pulsation de l’aCSF dans la chambre de tranche, produite par la pompe péristaltique, est à son minimum. Remarque : L’exode-carbogenation (sortie-carb.) modification réduit la sensibilité du niveau carbogenation au volume du réservoir aCSF, le FSCA taux, de recyclage et tube relative des postes au sein de l’aCSF petits réservoirs (&#60; 50 mL ; La figure 3). Concernant le filtre passe-bas, une certaine quantité d’air dans le tube en silicone mince réduit la pulsation de l’écoulement de l’aCSF ; ainsi, le tube doit être rempli pour la plupart à l’air.</li>
</ol>
4.Enregistrement des réponses synaptiques dans une chambre de tranche de Submersion
Remarque : Consultez la Table des matières.
<ol>
	<li>Réchauffez la solution FSCA dans un bain d’eau à environ 28-30 ° C (cela permettra d’éviter la formation de bulles dans la chambre d’enregistrement).</li>
	<li>Démarrer le système de recyclage (4 à 5 mL/min) et activer le chauffage inline pour équilibrer le système pendant au moins 1 h.</li>
	<li>Faire tremper un petit morceau de papier et une maille en nylon fixés sur un fil de platine en forme de U dans la chambre de tranche de submersion pendant quelques minutes (Figure 4) de nettoyage pour lentilles.</li>
	<li>Enlever le fil de platine en forme de U.</li>
	<li>Eteignez le recyclage et déposer une tranche sur le papier de nettoyage pour lentilles.</li>
	<li>Placer immédiatement le maillage tenue de tranche sur le dessus de la tranche, mettre en marche la pompe et laisser la tranche équilibrer pendant 30 min sans plongeant l’objectif dans le fsca.</li>
	<li>Remplir la micropipette de borosilicate (c.-à-d., l’électrode d’enregistrement) avec aCSF (Astuce de résistance : rempli de MΩ 1-2, 1/3 avec aCSF) et fixez-le dans le porte-pipette.</li>
	<li>Vérifier l’isolation de l’électrode de stimulation métal en le plaçant dans NaHCO3 solution (&#62; 40 mM). Connecter l’électrode au pôle négatif d’un générateur de tension DC (1-2 V, pôle positif : fil d’argent ou de platine) et d’observer la formation de bulles à la pointe sous le microscope à dissection (&#62; grossissement x 60).</li>
	<li>La référence fils dans la chambre de tranche et placer l’électrode de stimulation de tungstène d’isolation époxy testés dans le support de manipulateur.</li>
	<li>Ajouter une deuxième électrode de référence à la chambre et branchez-le sur la prise de référence de la tête de l’électrode d’enregistrement (Figure 4A).</li>
	<li>Dans le logiciel de commande d’amplificateur, cliquez sur la case « mode zéro pince » et procéder en double-cliquant sur la case « liste de gain de sortie ». Choisir un gain de « 100 », double-cliquez sur la « passe-haut filtre zone de liste (Bessel), » choisissez « 0,1 Hz », puis double-cliquez sur la « passe-bas filtre zone de liste (AC) » pour choisir « 3kHz. »</li>
	<li>Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le sur « Acquire | Ouvrir le protocole ». Choisissez un protocole qui dispose de paramètres permettant de stimulations épisodiques et la numérisation des potentiels amplifiés à 10-20 kHz pour 50 à 100 ms et qui déclenche automatiquement un isolateur stimulus 10 ms après le début d’un enregistrement épisodique.</li>
	<li>Placez la stimulation et les électrodes d’enregistrement en ligne, parallèlement à la strate pyramidale, par exemple (Figure 4B et 5).</li>
	<li>Cliquez sur « acquérir | Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » (dans la fenêtre pop-up). Cliquez sur la case « source de détente » et choisissez « barre d’espace » comme la source de commande. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour démarrer l’acquisition et de noter la fenêtre pop-up avec un bouton de déclenchement.</li>
	<li>Dans le logiciel d’isolateur stimulus, cliquez sur la case « contrôle de la tension » et inscrivez « 0 ». Cliquez sur le bouton « Télécharger ». Cliquez sur la fenêtre « logiciel d’enregistrement », puis appuyez sur la barre d’espace. Répétez ce cycle en saisissant séquentiellement des valeurs de 1 à 8, par exemple, à 1 pas de mV dans la boîte de « contrôle de la tension ».</li>
	<li>La force de stimulation en corrélation avec les valeurs de fEPSP-pente et déterminer l’intensité de stimulation nécessaire pour obtenir 40 % de la fEPSP-pente maximale. Cliquez sur la « boîte de contrôle de la tension » et entrez la valeur déterminée. Cliquez sur le bouton « Télécharger ». Remarque : Un isolateur stimulus sert à appliquer la tension brève ou des impulsions de courant aux tissus du cerveau. Les impulsions biphasiques peuvent avoir 100 µs par phase.</li>
	<li>Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le bouton arrêter, puis le menu « Acquérir ». Cliquez sur « Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » dans la fenêtre pop-up. Cliquez sur la zone source de détente et a choisi le « horloge interne » comme la source de commande. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton d’enregistrement qui commence l’enregistrement automatique des potentiels de champ toutes les 30 s, par exemple. Cliquez sur le bouton « stop » après 30 à 60 min.</li>
	<li>Cliquez sur le menu « Acquérir », cliquez sur « Open Protocol », choisissez le protocole désiré de l’induction de la plasticité synaptique et cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour activer automatiquement la stimulation haute fréquence et l’enregistrement. Cliquez sur le bouton « stop ». Remarque : Dans le cas d’études relatives à la plasticité synaptique, appliquer un des paradigmes induction standard pour la potentialisation à long terme ou à long terme dépression après l’enregistrement de base prolongée. Des exemples représentatifs de la modulation résultante de la transmission synaptique sont illustrés dans la Figure 7 et Figure 8.</li>
	<li>Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur « Acquire | Ouvrir le protocole » et choisissez le même protocole comme au point 4.12. Cliquez sur le bouton « OK », puis cliquez sur « Enregistrer ». Garder d’exécuter automatiquement les enregistrements de domaine potentiels pour 2-4 h, par exemple. Cliquez sur le bouton « stop » pour terminer l’enregistrement.</li>
	<li>Dans le cas d’études pharmaceutiques, appliquer la pâte directement le FSCA réservoir si l’administration permanente composée est souhaitée (Figure 6).</li>
</ol>
5. nettoyage de l’installation et conseils
Remarque : Voir ci-dessous pour obtenir des conseils généraux.
<ol>
	<li>Nettoyer le système chaque semaine en recyclant 10 % H2O2 pendant pas plus de 20 min, lavé avec désionisée H2O. Remarque : L’éthanol n’est pas recommandé pour le nettoyage. De même, il n’est pas recommandé de plonger l’objectif en H2O2et les fils de référence.</li>
	<li>Supprimer le sel précipité sur la surface de la lentille de l’objectif ou les environs de chambre avec 0,1 N HCl et ensuite de l’eau.</li>
	<li>Laver le barboteur de carbogen dans l’eau distillée ou 0,1 N HCl.</li>
	<li>Plonger la chambre d’incubation tranche à 10 % H2O2 pendant 5 minutes une fois par semaine et puis bien rincer la chambre d’incubation avec désionisée H2O.</li>
	<li>Dans le cas d’électrodes de stimulation metal, rincez l’électrode stimulant avec de l’eau désionisée après chaque expérience et essuyer doucement la pointe de l’électrode de stimulation avec un tampon d’ouate imbibé de l’éthanol pour éliminer le tissu résiduel.</li>
	<li>Réduire la résistance des électrodes de stimulation métal commercial en enlevant l’isolation à la pointe grâce à un coup soigneusement avec papier de verre.</li>
	<li>Réduire la perte de carbogen de l’aCSF tout en recyclage à travers les tubes de remplacement des tubes de silicium avec des tubes de polytétrafluoroéthylène.</li>
	<li>Garder les fils d’argent de l’électrode de l’enregistrement et l’électrode de référence à l’eau de Javel pendant plusieurs jours à AgCl se forment à la surface de fil.</li>
</ol>

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<li>Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+and+basal+orthodromic+population+spikes+in+hippocampal+CA1+in+vivo+show+different+origins+and+patterns+of+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation.</a> J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).</li>
<li>Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+microcirculation+chamber+for+inexpensive+long-term+investigations+of+nervous+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro.</a> Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).</li>
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<li>Du, H., Lin, J., Zuercher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+efficiency+of+CO2+injection+into+seawater+by+a+venturi+than+a+conventional+diffuser+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour+Technol%22%5BJournal%5D)">Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system.</a> Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).</li>
<li>Weinman, J., Mahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Analysis+of+Electrical+Properties+of+Metal+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Electron+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes.</a> Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).</li>
<li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.

Bien que les chambres tranche interface pièce plus robuste réponses synaptiques25,26,27,28, chambres de submersion assurent un confort supplémentaire pour l’enregistrement patch-clamp et fluorescence d’imagerie. Ainsi, nous avons décrit plusieurs aspects d’enregistrements possibles sur le terrain dans des tranches d’hippocampe aiguës en utilisant une chambre de tranche de submersion commerciale...

En 1951, les expériences de tranche cérébrale aiguë première signalés étaient menées1. En 1971, après avoir réussi in vitro des enregistrements de piriform cortex2,3 et la découverte que les neurones de l’hippocampe sont interconnectés transversalement le long de l’axe de septotemporal de l’hippocampe4, un de la premiers enregistrements in vitro de l’activité neuronale hippocampique a atteint5. La similitude des paramètres neurophysiologiques ou neurostructural de neurones dans des conditions in vivo et in vitro sont toujours l’objet d’un débat6, mais en 1975, Schwartzkroin7 a indiqué que la basale Propriétés des neurones sont maintenues in vitro et cette stimulation haute fréquence (c.-à-d., tétanisation) des afférents à la formation hippocampique induit une facilitation de longue durée des potentiels synaptiques8. Enregistrement de l’activité neuronale électrophysiologiques in vitro considérablement élargi l’étude des mécanismes cellulaires de la plasticité synaptique activité dépendante9,10, qui avait été découvert en 1973 par Bliss et al. 11 in vivo des expériences avec les lapins.
L’étude de l’activité neuronale ou tranches de cerveau, en particulier dans des tranches d’hippocampe aiguës, les voies de signalisation est maintenant un outil standard. Cependant, étonnamment, des expériences in vitro doivent encore être normalisées, comme en témoignent les multiples approches qui existent encore pour la préparation et l’entretien des tranches d’hippocampe aiguës. Reid et al. (1988) 12 a examiné les défis méthodologiques pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë dans différents types de chambres de tranche et les choix de niveau moyen, pH, température et oxygène de baignade. Ces paramètres sont encore difficiles à contrôler dans la chambre d’enregistrement en raison des éléments sur mesure de in vitro tranche-enregistrement des configurations. Publications peuvent être consultées qu’aide à surmonter les défis méthodologiques et qui décrive nouveaux types de chambres de tranche de submersion, comme un interstitiel microperfusion 3D système13, une chambre avec une hotte à flux laminaire et oxygène fournir un système multichambre enregistrement1614et un système de contrôle informatisé température15. Étant donné que ces chambres ne sont pas faciles à construire, la plupart des scientifiques s’appuient sur chambres tranche disponible dans le commerce. Ces chambres peuvent être montés sur un système de microscope, ce qui permet la combinaison d’électrophysiologie et de fluorescence imaging17,18,19. Étant donné que ces chambres de garder les tranches de cerveau immergés dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF), un débit élevé de la solution tampon doit être maintenue, augmentant les frais de demande de drogue. À cette fin, nous avons incorporé un système de perfusion recyclage avec écoulement-carbogenation qui offre une stabilité suffisante pour l’enregistrement de longue durée des potentiels de champ dans une chambre de tranche de submersion à l’aide d’un volume relativement petit fsca. En outre, nous avons résumé comment l’utilisation de ce système expérimental carbogenation/perfusion affecte le résultat de l’activité-dépendant de la plasticité synaptique10 et comment l’inhibition de l’élongation eucaryote facteur-2 kinase (eEF2K) module synaptique transmission20.

<table><tbody><tr><td>Réactifs requis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Chine</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Chine</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Chine</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &point moyen ; Réactif chimique Sinopharm 6H2O</td><td>, Chine</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Réactif chimique Sinopharm, Chine</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Réactif chimique Sinopharm, Chine</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>Réactif</td><td>chimique Glucose Sinopharm, Chine</td><td></td> 10010518 <td></td></tr><tr><td>NaH2 PO4</td><td>Réactif chimique Sinopharm, Chine</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Réactif chimique Sinopharm, Chine</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>Réactif chimique NaOH</td><td>Sinopharm, Chine</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Outils et matériaux pour la dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapitators</td><td>Harvard appareil</td><td>55-0012</td><td>pour la décapitation du rat</td></tr><tr><td>Ciseaux de bandage</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>pour la décapitation de la souris</td></tr><tr><td>lame à double tranchant</td><td>Flying Eagle, Chine</td><td>74-C</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Ciseaux</td><td>RWD, Chine</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Bone Rongeurs</td><td>RWD, Chine</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère</td><td>Hammacher&nbsp ;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>spatule à ciment dentaire</td><td>Hammacher&nbsp ;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>pelle dentaire à double extrémité</td><td>Blacksmith Surgical, USA</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>Microtome vibrant</td><td>Leica, Allemagne</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>lame chirurgicale&nbsp ;</td><td>RWD, Chine</td><td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td>support chirurgical</td><td>RWD, Chine</td><td>S32007-14<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Équipement et matériaux d’électrophysiologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical Pipette Puller</td><td>Narishige, Japon</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Table d’isolation des vibrations</td><td>Meirits, Japon</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>enregistrement de type submergé chambre</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur 4 axes</td><td>Sutter, États-Unis</td><td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur</td><td>Molecular Devices, États-Unis</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données</td><td>Molecular Devices, États-Unis</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anaysis logiciel</td><td>Molecular Devices, États-Unis</td> Microscope à fluorescence <td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Japon</td><td>Source lumineuse LED FN1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>Micropipettes X-cite 120LED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Appareil de Harvard</td><td>GC150TF</td><td>micropipettes borosilicates d’enregistrement extracellulaire</td></tr><tr><td></td><td>Sutter, États-Unis</td><td>BF150-86</td><td></td> pince patch</tr><tr><td>électrode de tungstène</td><td>A-M Systems, USA</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>pompe péristaltique</td><td>Longer, Chine</td><td>BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>tubes pour pompe péristaltique</td><td>ISMATEC, Wertheim, Allemagne</td><td>SC0309</td><td>1x entrée, ID : 1,02 mm</td></tr><tr><td>tubes pour pompe péristaltique</td><td>ISMATEC, Wertheim, Allemagne</td><td>SC0319</td><td>2x tubes pour sortie, ID : 2,79 mm</td></tr><tr><td>caméra CCD</td><td>PCO, Allemagne</td><td>pco.edge sCMOS</td> papier de nettoyage d’objectif <td></td></tr><tr><td></td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube à centrifuger conique</td><td>Thermo scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Préchambre</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage en ligne</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - perfusion- et système de chambre de submersion-type

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Même si les expériences sur des tranches de cerveau ont été utilisés depuis 1951, problèmes subsistent qui réduisent la probabilité de réaliser une analyse stable et réussie de la modulation de la transmission synaptique lors d’enregistrements intracellulaires ou potentiel sur le terrain. Ce manuscrit décrit des aspects méthodologiques qui peuvent être utiles à l’amélioration des conditions expérimentales pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë et d’enregistrement des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ dans une chambre de disponible dans le commerce de l’immersion avec une unité de sortie-carbogenation. La sortie-carbogenation aide à stabiliser le niveau d’oxygène dans les expériences qui s’appuient sur le recyclage d’un réservoir tampon petit pour améliorer le rapport coût-efficacité des expériences de la drogue. En outre, le manuscrit présente des expériences représentatives qui examinent les effets de modes différents carbogenation et paradigmes de la stimulation sur l’activité dépendante de la plasticité synaptique de la transmission synaptique.

Dans la section protocole, nous décrit la préparation de tranches d’hippocampe aiguës de la partie ventrale et intermédiaire de la formation hippocampique (Figure 1) de souris C57BL/6 mâles et des rats Wistar mâles (5-8 semaines). La position des hémisphères sur la plate-forme de trancheuse contribue à garder stable et supprime la nécessité de stabilisation avec la gélose ou d’agarose. Le système de perfusion lui-même est basé sur une pompe péristaltique opér...

Ce protocole décrit la stabilisation du niveau d’oxygène dans un petit volume de tampon recyclé et aspects méthodologiques de la plasticité synaptique activité dépendante d’enregistrement dans des tranches d’hippocampe aiguës immergés.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode permettant d'assurer un moyen simplifié de carbogénation du ACSF recyclé à petit volume et d'obtenir des enregistrements à long terme de potentiels de champ à l'aide d'une chambre d'enregistrement montée sur un microscope à fluorescence. Cette méthode peut nous aider à répondre aux questions clés dans le domaine des neuroplasticités relatives aux voies de la lignine sous-jacentes qui régulent la transmission synaptique et la formation de la mémoire dans un mode cellulaire d'apprentissage et de mémorisation. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de stabiliser le niveau d'oxygène d'un petit réservoir biologique afin d'améliorer l'efficacité économique des expériences utilisant des antagonistes ou agonistes spécifiques.La préparation des tranches aiguës d'hippocampe est démontrée par les étudiants en doctorat, Xia et Weiguang, de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, utilisez une lame chirurgicale froide pour disséquer un fragment du cortex dorsal selon un angle de 70 degrés le long du bord dorsal de chaque hémisphère. À l’aide d’une spatule en ciment dentaire froide, transférez chaque hémisphère sur un morceau de papier filtre afin de sécher brièvement la surface.Monter les deux hémisphères, dont les surfaces viennent d'être coupées, sur la plateforme de découpe froide à l'aide d'une colle adhésive rapide, de manière à ce que l'extrémité caudale des hémisphères soit orientée vers la lame de rasoir. Ensuite, placer la plateforme de découpe dans la chambre de refroidissement d'un vibratome. Remplir la chambre avec le tampon de découpe à deux à quatre degrés Celsius et le carbogéner.Ensuite, découpez des tranches de 350 micromètres à l’aide de réglages appropriés du vibrotome. Isolez la formation hippocampique du subiculum et des cortèxes entorhinaux en utilisant deux canules d'injection comme ciseaux. Éliminez les bulles du treillis de maintien des tranches de la chambre d'incubation préparée au préalable à l’aide d’une pipette Pasteur.Ensuite, transférez les tranches présentant une certaine transparence au niveau de la couche pyramidale de la plateforme de découpe vers la maille de la chambre d'incubation à l’aide d’une pipette de Pasteur à large embout. À cette étape, ajoutez un raccord tubulaire en té au niveau du flux sortant du système de recyclage. Connectez le bras central du raccord tubulaire en té à un tube d’alimentation en carbogène et réglez le débit à l’aide d’un débitmètre d’air.Ensuite, ajoutez un deuxième raccord tubulaire à trois voies à l'entrée du système de recyclage. Connectez le bras central au tube orienté vers le réchauffeur en ligne, le bras supérieur à un tube en silicone fin, et le bras inférieur au tube d'entrée provenant du réservoir. Puis, placez un pinceau sur un tube en silicone fin à un endroit du tube où la pulsation du ACSF dans la chambre de tranches, générée par la pompe péristaltique, est minimale.Maintenant, préimprégnez un petit morceau de papier de nettoyage pour lentilles et une maille de nylon fixée sur un fil de platine en forme de U dans la chambre à tranches immergée pendant quelques minutes. Ensuite, retirez le fil de platine en forme de U. Arrêtez la recirculation et placez une tranche sur le papier de nettoyage pour lentilles.Ensuite, placer immédiatement la grille de maintien de la tranche au-dessus de celle-ci. Allumer la pompe et laisser la tranche s'équilibrer pendant 30 minutes sans immerge l'objectif dans le ACSF. Pendant ce temps, remplir l'électrode d'enregistrement avec du ACSF et l'insérer dans le porte-pipette.Vérifiez l'isolation de l'électrode de stimulation métallique en la plaçant dans une solution de bicarbonate de sodium. Connectez l'électrode au pôle négatif d'un générateur de tension continue et observez la formation de bulles à l'extrémité sous un microscope stéréo. Ensuite, placez l'électrode de stimulation en tungstène isolée à l'apoxie testée dans le porte-électrode du manipulateur et le fil de référence dans la chambre de coupe.Ajoutez une deuxième électrode de référence dans la chambre et connectez-la à la prise de référence de la tête d'enregistrement de l'électrode. Dans le logiciel de contrôle de l'amplificateur, cliquez sur la case du mode de blocage à zéro, puis double-cliquez sur la liste du gain de sortie. Sélectionnez un gain de 100, double-cliquez sur la case du filtre passe-haut, choisissez trois kilohertz, puis double-cliquez sur la liste du filtre passe-bas CA pour sélectionner 0,1 hertz.Dans le logiciel d'enregistrement, cliquez sur acquérir, puis ouvrez le protocole. Choisissez un protocole dont les paramètres permettent des stimulations épidodiques et la numérisation de potentiels amplifiés à 10 à 20 kilohertz pendant 50 à 100 millisecondes, et qui déclenche automatiquement un isolateur de stimulus 10 millisecondes après le début d'un enregistrement épidodique. Placez les électrodes de stimulation et d'enregistrement en ligne et parallèlement au stratum pyramidal.Ensuite, cliquez sur acquérir, modifier le protocole, puis sélectionnez l'onglet déclenchement dans la fenêtre contextuelle. Cliquez sur la zone source de déclenchement et choisissez la barre d'espace comme source de déclenchement. Ensuite, cliquez sur le bouton OK et cliquez sur le bouton enregistrer pour démarrer l'acquisition.Dans le logiciel de l'isolateur de stimulus, cliquez sur la zone de contrôle de la tension et entrez zéro. Cliquez sur le bouton de téléchargement. Ensuite, cliquez sur la fenêtre du logiciel d'enregistrement et appuyez sur la barre d'espace.Répétez ce cycle en entrant successivement des valeurs allant de 1000 à 8000. Corréléz l'intensité de la stimulation avec les valeurs de la pente du PPSF et déterminez l'intensité de stimulation nécessaire pour obtenir 40 % de la pente maximale du PPSF. Cliquez sur la case de contrôle de tension et saisissez la valeur déterminée.Ensuite, cliquez sur le bouton de téléchargement. Dans le logiciel d'enregistrement, cliquez sur le bouton d'arrêt, puis sur le menu acquérir. Cliquez sur modifier le protocole et sélectionnez l'onglet déclenchement dans la fenêtre contextuelle.Ensuite, cliquez sur la zone de source de déclenchement et sélectionnez le minuteur interne comme source de déclenchement. Cliquez sur le bouton OK, puis sur le bouton d'enregistrement qui démarre l'enregistrement automatique des potentiels de champ toutes les 60 secondes. Cliquez sur le bouton d'arrêt après 30 à 60 minutes.Dans le logiciel d'enregistrement, cliquez sur Acquérir, ouvrez le protocole, puis sélectionnez le même protocole que celui utilisé pour l'enregistrement de base. Cliquez sur le bouton OK, puis cliquez sur Enregistrer. Continuez automatiquement les enregistrements des potentiels de champ pendant deux à quatre heures.Lorsque l'enregistrement est terminé, cliquez sur le bouton d'arrêt pour mettre fin à l'enregistrement. Cette figure montre des enregistrements représentatifs de la potentialisation dépendante de l'activité de la transmission synaptique utilisant la carbogénation en sortie et la carbogénation du réservoir avec le recyclage d'un petit réservoir d'ACSF. La potentialisation a été induite après le point zéro dans le temps par trois trains de 100 hertz par seconde.Cette figure montre que la carbogénation en sortie avec recyclage d’un petit réservoir d’ACSF améliore l’induction de la DLT par rapport aux expériences utilisant uniquement la carbogénation du réservoir. Une fois maîtrisée, la préparation des tranches peut être réalisée en cinq à dix minutes, et un enregistrement stable des potentiels de champ peut également être maintenu pendant plusieurs heures si la procédure est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d’ajuster le niveau de carbogénation, la vitesse de perfusion, la position des électrodes et l’intensité de stimulation de votre système spécifique.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que le patch clamp ou la microscopie médico-légale peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la virilisation de la localisation cellulaire des sondes Ravin en réponse à l'induction d'une plasticité synaptique dépendante de l'activité. Depuis son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de la neuroplasticité pour explorer la plasticité synaptique dépendante de l'activité comme mode cellulaire d'apprentissage et de mémoire dans des tranches hippocampiques in vitro de souris transgéniques bien caractérisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation aiguë de tranches issues de l'hippocampe temporal, ainsi que de la mise en place de conditions stables pour l'enregistrement à long terme des transmissions synaptiques à l'aide d'un faible volume de ACSF recyclé.N'oubliez pas que le travail avec des animaux et des composés chimiques peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et une désinfection adéquate doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type (Vidéo) | JoVE Journal

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

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