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L'objectif global de ce test d'aversion au cuivre basé sur le statut nutritionnel est d'évaluer la réponse des nématodes à une substance chimique aversive et à une source de nourriture sur une période de quatre heures. Cela permet l'évaluation simultanée du statut nutritionnel. Cette méthode peut aider le domaine de la neuroscience comportementale en identifiant les mutants qui ne parviennent pas à moduler les modèles de locomotion et la réponse à une substance chimique aversive malgré les conditions de famine.

Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être menée sur une période prolongée, ce qui permet une analyse du statut nutritionnel à mesure que les vers deviennent progressivement plus affamés sur quatre heures. Pour préparer les organismes expérimentaux pour le test, sélectionnez 10 nématodes au stade L4 par flux, 24 heures avant de commencer le test, pour vous assurer que les organismes sont des adultes jeunes lorsqu'ils sont testés. Pour chaque mutant ou nématode témoin testé, sélectionnez 10 L4.

Maintenez les organismes L4, en utilisant des méthodes standard pendant 24 heures sur des plaques d'agar standard semées avec OP50 E.Coli. 24 heures avant l'essai, utilisez une règle et un marqueur permanent épais pour tracer une ligne sur le dessous d'une plaque de milieu de croissance de nématodes précédemment préparée ou NGM le long du bord extérieur. Marquez une barrière médiane équidistante de chaque bord de la plaque.

Semez la plaque avec 50 microlitres d'OP50 E.Coli sur un seul côté de la barrière de cuivre pour créer une pelouse uniforme. Utilisez les lignes marquées sur le dessous de la plaque pour vous assurer que les bactéries n'entreront pas en contact avec la solution de cuivre. Assurez-vous que la solution de cuivre se situera le long du bord de la plaque et formera une barrière médiane et transférez les bactéries de sorte que la solution de cuivre n'entrera pas en contact avec la source de nourriture.

Marquez un deuxième ensemble de plaques sans OP50 E.Coli, pour servir de témoin négatif. Laissez les bactéries sécher, puis incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant une nuit. Assurez-vous que les taches de bactéries ne sont pas perturbées lors du transfert des nématodes dans un incubateur à 37 degrés Celsius.

Une perturbation excessive pourrait modifier l'emplacement ou la forme de la zone de nourriture. Après une incubation pendant la nuit, retirez les plaques de l'incubateur et, en utilisant le dessous marqué de la plaque comme guide, pipetez 100 microlitres d'une solution fraîchement préparée de sulfate de cuivre(II) à 0,5 molar sur le bord de l'agar, pour créer une barrière extérieure de cuivre. Pipetez 25 microlitres de la solution de sulfate de cuivre(II) pour créer une barrière médiane.

Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre(II) n'entre pas en contact avec la zone de bactéries et laissez la solution de cuivre sécher sur la plaque. Vérifiez la sécheresse toutes les cinq minutes après le transfert, avec un tissu de laboratoire en tamponnant légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner. Immédiatement avant l'essai, transférez les organismes expérimentaux dans une plaque d'agar sans bactéries et laissez les nématodes se déplacer librement pendant une minute pour éliminer les bactéries en excès.

Ensuite, pipetez un millilitre de M9 sur la plaque avec les adultes jeunes, qui ont été transférés 24 heures auparavant afin de laver les vers dans un tube de microcentrifugation. Centrifugez les nématodes à 3 000 x G pendant une minute. Les vers devraient former un tas au fond du tube.

Aspiriez la solution M9 sans perturber le tas de vers. Ajoutez un millilitre de solution M9 au tas de vers. Inversez le tube pour mélanger les vers avec la solution.

Si des bactéries en excès ont été initialement transférées avec les vers, répétez l'opération jusqu'à cinq fois. Après le dernier lavage, aspirez le surnageant jusqu'à ce qu'il ne reste que 100 microlitres de solution M9 et le tas de vers. Transférez immédiatement les vers de la solution une fois que le lavage est terminé.

Pipetez 20 microlitres du tas de vers depuis le fond du tube sur la moitié de la plaque d'essai sans bactéries, assurez-vous que 10 vers sont transférés sur la plaque d'essai et qu'aucune nourriture contaminante n'est présente. Aucune bactérie ne doit être transférée sur les plaques de course de nourriture au cuivre. Enlevez l'excès de solution M9 des nématodes avec un tissu de laboratoire dans un délai d'une minute.

Assurez-vous que la solution M9 n'entre pas en contact avec la solution de sulfate de cuivre(II) et que les vers et la surface de l'agar restent intacts. Jetez les vers qui ont accidentellement été retirés avec le tissu de laboratoire. Une fois que la solution M9 a été retirée, et que tous les vers ont commencé des modèles de locomotion non liquides, c'est-à-dire lorsqu'ils ont cessé de se débattre.

Démarrez le chronomètre de l'essai, si des vers supplémentaires ont été accidentellement inclus, retirez-les en les sélectionnant avec de l'huile halocarbonée pour vous assurer qu'aucune bactérie n'est ajoutée à la plaque. Vérifiez les plaques d'essai toutes les 30 minutes. Pour les plaques d'essai avec des zones de bactéries, notez positivement les organismes s'ils atteignent la zone de nourriture sur une période de quatre heures.

Pour les plaques témoins négatives, notez positivement les organismes s'ils ont franchi la barrière. Nous avons utilisé le mutant N2 et la perte de fonction npr-9 et une souche de surexpression npr-9, appelée gain de fonction npr-9, pour évaluer les réponses à la famine et à l'aversion au cuivre. À la fin de l'essai, 100% des organismes de type sauvage ont été déplacés vers la source de nourriture, tandis que les organismes surexprimant npr-9 n'ont pas modulé les modèles de locomotion en réponse à la nourriture et ont continué à franchir la barrière aversive même après avoir touché la source de nourriture.

Sur une plaque sans nourriture, les organismes n2 ou npr9 perte de fonction ont rarement franchi la barrière de cuivre tandis que les nématodes surexprimant npr-9 ont franchi la barrière en avant et en arrière à plusieurs reprises. En effectuant cette procédure, il est important de se rappeler d'éviter de perturber la barrière de cuivre lors du transfert des nématodes et du M9 et de maintenir également des conditions cohérentes pour chaque souche afin d'éviter des facteurs de confusion.