Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la position chromosomique optimale d’un élément d’ADN donné à l’aide de l’insertion aléatoire médiée par transposon, d’expériences de compétition et du séquençage du génome entier. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la réplication de l’ADN, telles que l’importance de la localisation chromosomique d’un élément génétique. L’avantage de cette technique est qu’elle associe l’insertion aléatoire basée sur le transposon à la sélection du clone le plus apte par avantage de croissance.

Ici, il est simplifié par la région E.coli DARS2. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’organisation chromosomique d’Escherichia coli, elle peut également être appliquée à d’autres bactéries. Après avoir préparé des cellules électrocompressrices telles que MG1655 delta DARS2 selon le protocole texte, ajoutez un microgramme de pNKBOR DARS2 à 40 microlitres de cellules et transférez le mélange dans une cuvette stérile pré-refroidie de 0,2 centimètre.

Insérez la cuvette dans la chambre d’électroporation. Ensuite, électroporez les cellules à 18 kilovolts, 500 ohms et 25 microfarad. La constante de temps doit être d’environ cinq millisecondes et aucun arc électrique ne doit se produire.

Récupérez rapidement la suspension bactérienne en la remettant en suspension dans un millilitre de bouillon LB préchauffé et transférez-la dans un tube à essai de 15 millilitres. Incuber les cellules dans des conditions de croissance aérée à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes sans sélection d’antibiotiques. Ensuite, placez les bactéries sur les plaques de gélose LB complétées par 50 microgrammes par millilitre de kanamycine et incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, comptez les colonies issues de l’électroporation. Une colonie est considérée comme égale à l’insertion d’un transposon chromosomique. Ajoutez un millilitre de bouillon LB dans chaque assiette et rincez toutes les colonies.

Réutilisez le même millilitre de bouillon LB pour augmenter la concentration bactérienne. Ensuite, regroupez toutes les colonies dans le même tube de 50 millilitres. Vortex le tube pour congeler le matériau de départ et mélanger un millilitre de suspension cellulaire avec un millilitre de glycérol à 50 % sur de la glace.

Transférez les tubes dans de la glace sèche pendant 10 minutes. Une fois les cultures congelées, transférez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Décongelez la bibliothèque de transposons à partir de moins 80 degrés Celsius sur la glace.

Mélanger par pipetage, puis transférer 100 microlitres de la bibliothèque de transposons dans 10 millilitres de LB dans un tube à essai de 15 millilitres. Cultivez les cellules aérées par des secousses continues à 37 degrés Celsius pendant huit heures jusqu’à la phase stationnaire. Ajustez les paramètres aux différentes conditions de croissance si vous le souhaitez.

Pour propager la population bactérienne environ toutes les 10 générations, transférez 10 microlitres de la phase précédemment stationnaire dans 10 millilitres de milieu frais préchauffé et faites pousser la culture pendant huit heures supplémentaires jusqu’à la phase stationnaire. Après chaque 100 générations de compétition, conservez cinq échantillons d’un millilitre et stockez-les à moins 80 degrés Celsius. Préparez la sonde pour le transfert de Southern contre une section d’un kilo-octet du NKBOR par amplification PCR à l’aide d’amorces spécifiques comme indiqué ici.

Exécutez les exemples à l’aide du programme suivant. Marquez le fragment de PCR résultant avec du dATP marqué à P32 à l’aide du système d’amorces aléatoires selon Smith et préparez l’ADN cellulaire total selon le protocole de texte. Digérer l’ADN cellulaire total avec Pvul qui coupe NKBOR contenant la région d’intérêt en dehors d’une région couverte par la sonde.

Effectuer un transfert de Southern à l’aide de gel d’agarose à 0,7 % selon Loebner-Olsen et von Freiesleben. Pour utiliser la marche génétique facile afin d’identifier les sites d’insertion de DARS2 à partir de clones uniques, après 700 générations estimées de compétition, isolez l’ADN génomique pour la matrice PCR en propageant d’abord les bactéries sur une plaque de gélose LB et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Inoculez le bouillon LB avec des colonies simples et cultivez-les pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Ensuite, transférez 20 microlitres dans 200 microlitres d’eau distillée autoclave. Injectez les colonies dans la solution, puis chauffez le mélange à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugez les échantillons à vitesse maximale pendant cinq minutes, puis conservez le lysat cellulaire à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation future.

Ensuite, concevez trois amorces imbriquées à recuire dans le transposon de votre choix, comme illustré ici. Utilisez 200 nanogrammes d’ADN génomique, une amorce emboîtée et une amorce aléatoire pour préparer une réaction PCR de 20 microlitres. Ensuite, exécutez les échantillons à l’aide du programme suivant.

Pour la deuxième amplification, utilisez un microlitre de la première réaction comme matrice et utilisez deux amorces imbriquées et la même amorce aléatoire. Effectuez une troisième réaction de la même manière en utilisant trois amorces imbriquées, la même amorce aléatoire et un microlitre de la deuxième réaction comme modèle. Exécutez les produits à partir de la réaction PCR finale sur un gel d’agarose à 1,5 % et une statine avec du bromure d’éthidium.

Découpez une bande dans la gamme de 100 à 800 paires de bases et isolez l’ADN à l’aide de n’importe quel kit d’extraction de gel d’ADN commercial selon les instructions du fabricant. Pour réaliser la cytométrie en flux, équilibrez chaque culture bactérienne en la maintenant en phase de croissance exponentielle pendant au moins 10 générations. Mesurez la DO 600 et assurez-vous qu’elle ne dépasse jamais 0,3.

Pour effectuer un écoulement de la rifampicine selon le protocole textuel, transférez un millilitre de culture dans un tube de 15 millilitres contenant 30 microlitres de RIF-CEF. Incuber le tube à 37 degrés Celsius en le secouant pendant au moins quatre heures. Pour l’échantillon EXP, transférez un millilitre de culture à croissance exponentielle dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace.

Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 15 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Remettez le granulé en suspension dans 100 microlitres de tris glacés 10 millimolaires pH 7,5 et ajoutez un millilitre d’éthanol glacé à 77 %. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.

Colorer les cellules en récoltant 100 à 300 microlitres de cellules fixes par centrifugation à 15 000 fois G pendant 15 minutes. Retirez le surnageant et utilisez 130 microlitres de solution de coloration de l’ADN pour remettre la pastille en suspension. Ensuite, incubez les échantillons sur de la glace et dans l’obscurité pendant 10 minutes.

Enfin, utilisez la cytométrie en flux pour déterminer l’origine par cellule, la masse cellulaire relative et le contenu relatif en ADN. Après l’extraction de l’ADN du pool de transposons initial et toutes les 100 générations de compétition estimées sur 700, l’ADN a été coupé avec Pvul qui est connu pour couper le transposon NKBOR DARS2 une fois dans une région non couverte par la sonde et un transfert de Southern a été effectué. Comme le montre ici, le pool initial de DARS2 manquait de bandes distinctes, ce qui montre que DARS2 a été inséré au hasard dans tout le chromosome.

Au fil du temps, un modèle est apparu où le grand nombre initial de clones de DARS2 s’est transformé en un seul ou quelques clones persistants de DARS2. Le séquençage du génome entier a été utilisé pour identifier les sites d’insertion de DARS2 à partir du pool de départ. Et après 400, 500 et 700 générations de compétition dans un sous-ensemble représentatif d’insertion séquencée, 98 % de toutes les insertions de DARS2 ont été trouvées à proximité de l’emplacement chromosomique DARS2 de type sauvage.

Et 2 % ont été trouvés ailleurs sur le chromosome. Il a été démontré précédemment que les cellules déficientes en DARS2 initiaient la réplication de manière synchrone et présentaient une diminution de la concentration d’origine par rapport aux cellules de type sauvage. Ici, la présence d’un élément DARS2 dans le terminus ne rétablit pas la synchronie ou le contenu d’origine cellulaire à des niveaux de type sauvage, tandis que les clones DARS2 sélectionnés IR et RPPH initient la réplication en synchronie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de déterminer la position chromosomique optimale d’un élément d’ADN donné. Cela se fait par des insertions aléatoires basées sur des transposons, suivies d’expériences de compétition et enfin de séquençage du génome entier.