Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée
21 août 2017
La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification des compartiments cellulaires où les antigènes exogènes sont traitées par dégradation associés au réticulum endoplasmique dans présentation croisée.
L’objectif global de cette expérience est de purifier le compartiment membraneux, où la dégradation des antigènes exogènes de type ERAD est effectuée en présentation croisée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la période d’immunité, telles que l’élucidation du compartiment cellulaire ou la dégradation de type ERAD en présentation croisée. Le principal avantage de cette technique est que les vésicules purifiées contiennent toutes les opérations moléculaires. Cela permet une dégradation de type ERAD de tous les antigènes exogènes. Cette méthode peut donc donner un aperçu de la présentation croisée. Par les cellules dendritiques, il peut également être appliqué à d’autres types de cellules présentatrices d’antigènes qui présentent une capacité de présentation croisée. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car il est impossible d’exclure tous les antécédents non spécifiques. Un jour avant la purification, divisez les cellules DC2.4 en 0,1 million de cellules par ml dans une plaque de culture tissulaire dans un tampon RPMI. Évitez de maintenir les cellules à un état confluent pour augmenter la probabilité d’incorporation d’antigènes exogènes. Avant que les cellules DC2.4 ne soient semi-confluentes, ajoutez de l’ovalbumine biotinylée, ou bOVA, en tant qu’antigène exogène. Ensuite, incubez pendant deux à quatre heures. Récoltez les cellules par pipetage doux à partir de la plaque tissulaire dans un nouveau tube conique de 50 ml. Centrifugez les cellules à 1000 X G pendant cinq minutes à 4
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Aperçu
Cet article présente un nouveau protocole d'isolement de vésicules permettant la purification de compartiments cellulaires impliqués dans le traitement des antigènes exogènes. La méthode s'intéresse au rôle de la dégradation associée au réticulum endoplasmique dans la présentation croisée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Immunologie
Contexte
- Comprendre le traitement des antigènes est essentiel pour la recherche immunologique.
- La dégradation associée au réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans le contrôle de qualité des protéines.
- La présentation croisée est indispensable à l'activation des lymphocytes T.
- Les méthodes actuelles d'isolement des vésicules peuvent manquer de spécificité.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole d'isolement de vésicules plus efficace.
- Approfondir la compréhension des mécanismes de traitement des antigènes.
- Faciliter la recherche sur la présentation croisée et les réponses immunitaires.
Méthodes utilisées
- Développement d'un protocole d'isolement de vésicules.
- Techniques de purification des compartiments cellulaires.
- Analyse de la dégradation associée au réticulum endoplasmique.
- Évaluation de l'efficacité de la présentation croisée.
Résultats principaux
- Le nouveau protocole améliore considérablement la pureté des vésicules.
- Compréhension accrue des voies de traitement des antigènes.
- Efficacité démontrée dans les tests de présentation croisée.
- Implications potentielles pour le développement de vaccins et l'immunothérapie.
Conclusions
- Le protocole développé offre une méthode fiable pour l'isolement des vésicules.
- Les connaissances acquises peuvent faire progresser la recherche en immunologie.
- Cette méthode pourrait conduire à des stratégies thérapeutiques améliorées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La purification de vésicules associées à la DER depuis des cellules dendritiques permet une analyse mécanistique de la présentation croisée, un processus essentiel pour le traitement des antigènes et l'activation immunitaire. Cette capacité renforce la confiance prédictive dans la validation de cibles pour des portefeuilles de découverte axés sur l'immunologie et oriente l'avancement ajusté au risque de candidats immunothérapeutiques. L'adaptabilité du protocole à d'autres cellules présentatrices d'antigènes élargit sa valeur stratégique pour les chaînes de recherche et développement en entreprise.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet l'étude directe des voies de dégradation de type ERAD dans le traitement des antigènes.
- Permet la validation fonctionnelle des mécanismes de présentation croisée dans les cellules dendritiques.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques dans le choix des cibles en immunologie.
- Offre une plateforme pour l'interrogation fondée sur des hypothèses du devenir des antigènes.
Développement de tests et criblage
- Fournit des vésicules purifiées adaptées à des dosages de reconstitution in vitro quantitatifs.
- Améliore la reproductibilité des dosages en isolant des compartiments cellulaires définis.
- Permet la standardisation des lectures de présentation croisée pour l'évaluation de composés.
- Facilite le développement de plates-formes de criblage évolutives et réutilisables pour les modulateurs du traitement des antigènes.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur les mécanismes immunitaires pertinents pour la maladie en modélisant la présentation croisée des antigènes.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique d'agents immunomodulateurs.
- Facilite l'identification de biomarqueurs translationnels associés aux voies de traitement des antigènes.
- Permet de prendre des décisions éclairées, ajustées au risque, concernant le développement des immunothérapies.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole de purification des vésicules s'inscrit à l'interface entre la découverte précoce et l'immunologie préclinique, en soutenant les flux de travail allant de la validation mécanistique de cibles à l'identification de candidats thérapeutiques.
- Biologie de la découverte : Fournit un système permettant de tester des hypothèses sur le traitement des antigènes et de préciser le rôle des voies ERAD.
- Screening : Propose des tests reproductibles et quantitatifs basés sur des vésicules pour évaluer les modulateurs de la présentation croisée.
- Analytique : Permet de mesurer le transport des antigènes, l'ubiquitination et les produits du traitement protéasomal.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les découvertes mécanistiques et les réponses immunitaires pertinentes pour les maladies ainsi que les stratégies de biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre un protocole standardisé et adaptable à divers types de cellules présentatrices d'antigènes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles immunitaires et réduit l'ambiguïté mécanistique.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et la scalabilité des tests de traitement des antigènes.
- Valeur stratégique : Permet de mieux prendre des décisions d'aller/arrêt et d'optimiser l'efficacité du capital dans les portefeuilles d'immunologie.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des candidats aux immunothérapies.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en biologie cellulaire, en immunologie et dans les techniques de purification des vésicules.
- Exige un accès à des instruments spécialisés de centrifugation et d'analyse.
- Implique une standardisation rigoureuse entre les équipes afin de minimiser le bruit de fond non spécifique.
- Peut être adapté à divers modèles de cellules présentatrices d'antigènes moyennant une optimisation du protocole.
- La contamination de fond et la pureté des vésicules restent des limites pratiques à résoudre.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Preparation of Microsomes
4:44
Purification of Microsomes with bOVA Underground ERAD
6:59
In Vitro Reconstruction of ERAD Ubiquination of bOVA Using Purified Microsomes
9:04
Results: Purified Microsomes and In Vitro Ubiquination of the Exogenous Antigen
11:06
Conclusion
