Un système de co-culture hydroponique pour l'analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

L’objectif global de ce système est d’étudier l’interaction et les réponses réciproques de signalisation entre les plantes et les micro-partenaires ou les réponses des plantes aux produits chimiques ou aux facteurs abiotiques dans une configuration expérimentale simple qui imite étroitement l’environnement naturel. Cette vidéo montre la co-culture de plantes avec la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur les interactions microbiennes des plantes, la réponse microbienne ou au stress des plantes, et la signalisation moléculaire, y compris la signalisation complexe, même à un stade initial des interactions microbiennes d’une plante.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle aide à comprendre la signalisation naturelle et la réponse des interactions microbiennes d’une plante, dans une configuration simple qui inclut l’imitation de l’environnement naturel. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour donner un aperçu des interactions des plantes avec une seule espèce microbienne, elle peut également être utilisée pour étudier les interactions des plantes avec plusieurs espèces microbiennes ou avec des facteurs abiotiques. Nous avons eu l’idée de cette méthode en recherchant l’homéostasie de la signalisation cellulaire lors d’interactions plantes-microbes qui imitent étroitement les situations naturelles.

Pour commencer l’expérience, les graines doivent être stérilisées. Pour Arabidopsis thaliana, combinez environ 200 graines avec 500 microlitres d’eau désionisée dans un micro tube de centrifugation, et faites tourbillonner le tube à grande vitesse. Centrifugez le tube à 9000 x g pendant 30 secondes dans une micro-centrifugeuse de table.

À l’aide d’une pipette, prélever le surnageant d’eau. Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’hypochlorite de sodium à 2 % aux graines et vortex-les. Laissez le mélange se déposer à température ambiante.

Au bout d’une minute, centrifugez les graines. À l’aide de la pipette, prélever la solution d’hypochlorite de sodium. Ajoutez ensuite 500 microlitres d’eau stérile et déminéralisée aux graines et tourbillonnez le mélange.

Après avoir centrifugé le tube, retirez l’eau. Ajoutez 500 microlitres d’éthanol à 70 % aux graines et vortex le mélange. Après avoir laissé les graines se déposer pendant une minute, centrifugez le tube.

Prélever l’éthanol à 70 % à l’aide d’une pipette. Lavez les graines cinq fois avec 500 microlitres d’eau stérile et déminéralisée. Ensuite, mettez à nouveau en suspension les graines stérilisées dans 500 microlitres d’eau stérile et ultra pure.

Versez 25 millilitres de Murashige et Skoog, ou de milieu MS avec 04 % de phyto-gélose dans chaque boîte de Pétri stérile et profonde. Pour chaque boîte de Pétri, découpez un carré de 90 millimètres sur 90 millimètres de maille en acier inoxydable. Pliez les coins de chaque maille carrée juste assez pour que la maille s’insère à l’intérieur de la plaque de Petri.

Pliez les coins à un angle de 90 degrés par rapport à la masse du treillis pour permettre au treillis d’être soutenu par les coins, en laissant suffisamment d’espace en dessous pour le développement des racines. Mettez les carrés de maille coupés dans un bécher et couvrez-les de papier d’aluminium. Stérilisez les carrés de maille par autoclave à l’aide d’un cycle de séchage de 30 minutes.

Une fois que le milieu s’est solidifié dans les boîtes de Pétri et que le maillage est stérile, placez chaque carré de maille sur le milieu solide avec les coins pliés vers le bas. Poussez le treillis de manière à ce que les coins pénètrent dans le milieu et que la majeure partie du treillis touche la surface supérieure du média. Ensuite, utilisez une pipette stérile de 200 microlitres pour extraire les graines individuelles d’A thaliana stérilisées en surface et transférez doucement chaque graine sur le maillage.

Placez les graines de manière à ce qu’elles soient espacées en fonction de l’espèce végétale et des besoins expérimentaux. Fermez les boîtes de Pétri avec des couvercles et placez du ruban chirurgical poreux sur les bords des plaques. Enveloppez les graines dans du papier d’aluminium.

Stratification des graines en plaçant l’intégralité de la boîte de Pétri. Après deux jours, cultivez les graines dans la boîte de Pétri à 22 à 24 degrés Celsius avec une photopériode de 16 heures pendant 10 à 14 jours. Dans une hotte à écoulement stérilisée, versez 18 millilitres de fluide MS liquide autoclavé dans des réservoirs en verre cylindriques stériles avec des couvercles stériles.

Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, transférez doucement chaque carré de maille avec des semis âgés de 10 à 14 jours de la boîte de Pétri de milieu semi-solide vers un réservoir cylindrique hydroponique. Les semis présentés ici sont de la luzerne. Scellez les couvercles sur les réservoirs à l’aide d’un ruban chirurgical poreux.

Ensuite, cultivez les plants à 22 à 24 degrés Celsius avec une photopériode de 16 heures et une agitation à 50 tr/min. Avant l’inoculation, examinez soigneusement le réservoir contenant les semis pour détecter toute contamination potentielle. Le fluide dans les réservoirs non contaminés doit être clair et transparent.

Si les réservoirs sont troubles et contaminés, jetez-les et numérotez le reste des réservoirs. Prélevez 20 microlitres de milieu hydroponique dans chaque réservoir numéroté et repérez-le sur une boîte de Pétri avec du bouillon Luria ou de l’agar LB. Incuber le plat à 28 degrés Celsius pendant 28 heures.

Inoculez immédiatement chaque réservoir hydroponique numéroté avec 50 microlitres de suspension d’agrobacterium tumefacians dans chaque réservoir hydroponique numéroté. Co-cultivez les semis et la bactérie A tumefacians à 22 à 24 degrés Celsius avec une photopériode de 16 heures et une agitation à 50 tr/min. Examinez la plaque LB tachetée après 12 et 28 heures d’incubation pour vérifier la stérilité du milieu de croissance hydroponique.

S’il y a une contamination, n’utilisez pas le réservoir numéroté correspondant inoculé avec des bactéries pour d’autres essais en aval. Ensuite, séparez les racines de la suspension bactérienne en soulevant la plaque de maille. Si vous utilisez des racines pour des analyses ultérieures, coupez les racines, rincez-les rapidement à l’eau double distillée et séchez-les sur du papier filtre stérilisé.

Si vous utilisez une feuille ou un autre tissu, coupez le tissu. Pour l’analyse du transcrit des plantes, les racines ou les pousses doivent être immédiatement déposées dans de l’azote liquide. Pour l’analyse des transcrits bactériens, transférez 1,5 millilitre de la culture à partir du réservoir de co-culture et granulez les cellules par centrifugation.

Après une co-culture appropriée, utilisez des ciseaux stériles pour séparer les racines secondaires individuelles, les branches latérales de la racine principale. Ensuite, rincez les racines dans de l’eau doublement distillée pour enlever les matériaux faiblement liés. Plongez chaque racine dans 30 microlitres d’eau sur une lame de microscope et couvrez-la d’une lamelle en verre.

Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles pour protéger les racines de la déshydratation. Visualisez ensuite l’attachement d’A tumefacians aux racines d’A thaliana par microscopie à fluorescence. Après une co-culture appropriée, séparez les plantes du milieu hydroponique.

Stérilisez les 18 millilitres de milieu hydroponique en les faisant passer à travers un filtre à pores de 0,2 micron dans des tubes coniques de 50 millilitres. Congelez les échantillons à 80 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, desserrez les bouchons des tubes coniques de 50 millilitres et placez-les dans une machine à lyophiliser pendant 36 heures.

Enfin, procédez au stockage ou au traitement des échantillons pour l’analyse HPLC et la détection des composés. Sans nutriments fournis artificiellement, A tumefacians c58 s’est développé dans le système de co-culture. En revanche, pratiquement aucune croissance bactérienne n’a été observée dans la culture témoin sans A thaliana.

Les systèmes de co-culture hydroponique peuvent être utilisés pour étudier l’attachement des bactéries à la structure racinaire, comme le montre cette visualisation microscopique, où les bactéries marquées à la fluorescence rouge PCherry ont été localisées à la structure racinaire de la plante avec une forme typique de roche ou de filament. Les profils d’expression génique des tiges des plantes et des microbes en interaction peuvent être déterminés via QRTPCR. Après huit heures de co-culture, huit cellules tuméfaciennes ont révélé une régulation de l’expression des gènes de virulence.

Dans le même temps, les racines d’A thaliana ont révélé une expression génique différentielle en réponse à la co-culture. Après 72 heures de co-culture, 35 composés ont été améliorés et 76 composés ont été diminués dans le sécrétome des plantes inoculées par rapport au témoin. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour étudier les interactions plantes-microbes et explorer les réponses réciproques entre les plantes et les microbes ou les partenaires du biome microbien, ou les réponses des plantes aux facteurs abiotiques dans une configuration simple qui imite étroitement l’environnement naturel.

Après avoir regardé cela avec vous, nous espérons que vous serez en mesure de mettre en place un système de co-culture microbienne végétale en hydroponie pour étudier les plantes moléculaires, les interactions microbiennes et les réponses de signalisation dans un environnement plus naturel et gérable.