Name: Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez une méthode de caractérisation de l'embryogenèse chez Arabidopsis utilisant la microscopie DIC et la microscopie confocale. Cette technique permet d'observer la morphologie embryonnaire et l'expression des marqueurs GFP.

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Nous remercions le Dr Jessica Habashi pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions le Dr Xianyong Sheng du centre d’imagerie, Collège des Sciences de la vie, Capital Normal University (Pékin), pour effectuer la localisation de dosage DR5-GFP . Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la Science de le Gouvernement Municipal Beijing (CIT &#38; TCD20150102) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31600248).

Remarque : Ce protocole comporte trois parties : 1) observer la formation de modèles dans des embryons de Arabidopsis sauvage à l’aide de la microscopie DIC ; 2) caractérisant l’embryon modèle formation via l’observation de l’expression de protéines de marqueur à l’aide de laser confocal, microscopie ; et 3) déterminer le rôle d’un gène spécifique dans l’embryogenèse (en utilisant le mutant naa10 par exemple).
1. compensation de l’ovule
<ol>
	<li>Préparation du matériel plante Remarque : Le protocole décrit ici est un exemple sur comment faire pousser des plantes saines ; autres façons de faire pousser des plantes en bonne santé travaillent également.<ol>
		<li>Ajouter 100 graines dans un tube de 1,5 mL et puis ajouter 1 mL de 1,5 % d’hypochlorite de sodium (mix 15 mL de chlore de 10 % à 85 mL d’eau) pour stériliser les graines pendant 5 min. inverser le tube plusieurs fois pour s’assurer que la solution et les graines sont bien mélangés pour stériliser les graines surfaces complètement.</li>
		<li>Forcer les graines au fond du tube par centrifugation pendant 30 s à 1 200 g, éliminer le surnageant et lavez les graines avec de l’eau stérile quatre fois à un banc pour enlever l’hypochlorite de sodium résiduel.</li>
		<li>Ajouter 4,4 g de mélange de sels basal milieu de Murashige et Skoog (MS) et 10 g de saccharose à 1 L d’eau ultrapure. Incorporer le mélange pour dissoudre les sels et le saccharose. Ajuster la solution à pH 5,8 avec 1 M KOH, ajouter 3 g de gélifiant, tels que Phytagel, à la solution MS-saccharose et stériliser la solution à 121 ° C pendant 15 min faire le milieu MS.</li>
		<li>Verser 30 mL de milieu MS dans une boîte de Petri de 12 cm pour générer des plaques moyens MS.</li>
		<li>Placez les graines stérilisées sur la plaque de MS. La plaque de transfert vers une chambre de croissance et de conserver la plaque sous conditions de jours longs (22 ° C pendant 16 h, à la lumière et à 18 ° C pendant 8 h dans le noir) après stratification des graines (3 jours à 4 ° C dans l’obscurité).</li>
		<li>Après 8 jours de croissance, transférer les plantes dans le sol (mélange riche en nutriments du sol et la vermiculite dans un rapport 1:1) dans un plateau, couvrir le bac à couvercle blanc, transparent pendant 5 jours pour éviter la perte d’eau et laisser un espace pour éviter la vitrification des plantes.</li>
		<li>Retirer le couvercle du plateau et cultiver les plantes dans une chambre de plain-pied dans des conditions de jours longs (voir 1.1.5). Allumer la lumière à 06:00 et l’éteint à 22:00. Après environ 20 jours de croissance dans la chambre de plain-pied, les plantes seront ont fleuri et produit des siliques.</li>
		<li>Marque les boutons de fleurs avec un fil à la position de la graine les tiges dans l’inflorescence à 20:00 (n’utilisez pas la première à la troisième boutons floraux ; les siliques générés par ces boutons floraux généralement développent quelques graines avortées, et cela peut modifier la proportion de normal d’ovules anormaux). Définir le début de la pollinisation de l’ovule, comme lorsque le bourgeon marqué ouvre à fleurir à 08:00 le lendemain matin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Préparation de la solution de Hoyer
	<ol>
		<li>Ajouter 24 g d’hydrate de chloral dans un tube de 50 mL et envelopper le tube entièrement avec du papier aluminium (solutions d’hydrate de chloral ne sont pas stables sous la lumière).</li>
		<li>Ensuite, ajoutez 9 mL d’eau ultrapure et 3 mL de glycérol à la solution ci-dessus et secouer le tube pour dissoudre l’hydrate de chloral. Pour rendre la solution de Hoyer, laisser le tube reposer toute la nuit à température ambiante pour éliminer toutes les bulles.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dédouanement et la séparation de l’ovule
	<ol>
		<li>Fixez un morceau de ruban adhésif double-face à une lame de verre de microscope. Placez une silique cultivé pour le nombre de jours après la pollinisation (DAP) sur la diapositive avec le pseudoseptum perpendiculaire à la surface ; cela il sera facile de diviser les carpelles (Figures 1 a et 1 b).</li>
		<li>Diviser les carpelles des deux côtés de la pseudoseptum avec une aiguille de seringue et fixer les deux carpelles disséqués à la diapositive afin que les ovules dans la silique sont visibles sous un stéréoscope (Figures 1 et D 1).</li>
		<li>Administrer 70 µL de solution de Hoyer sur la lame de verre et puis mouiller la pointe d’une paire de pinces à épiler à pointe fine avec une solution de Hoyer en plongeant. En utilisant le stéréoscope, déplacez les ovules dans la solution de la Hoyer sur la diapositive avec la pince à épiler pour nettoyer les embryons. Appliquer une lamelle à la diapositive doucement pour éviter de générer toutes les bulles.</li>
		<li>Mettre la lame finie dans une boîte dans une pièce sombre pendant 2-12 h (plus mature un ovule est, il faudra plus de temps) à la température ambiante. Embryons au stade de 2/4-cellules (DAP 1-2) peuvent être observées au microscope après 2 h, alors que les embryons entre l’octant et globulaires débuts (DAP 3) peuvent être observés après 4 h. Des embryons plus matures (4-8 DAP) peuvent être observées après 12 h.</li>
		<li>Examiner les ovules dégagés à l’aide de la fonction DIC d’un microscope. Recherchez les embryons dans un champ de faible puissance (10 X) et puis changer à un champ de haute puissance (objectif d’immersion d’huile-100 X) pour observer le modèle cellulaire chez les embryons avancés.</li>
		<li>Examiner les embryons à des stades de développement différents.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. caractérisation de la structuration de l’embryon et identité cellulaire par l’intermédiaire de l’Observation de l’Expression de la protéine marqueur
<ol>
	<li>Préparation du matériel végétal
	<ol>
		<li>Cloner le promoteur et la séquence de l’élément de réponse marqueur génétique ou hormone de codage et puis il se fusionnent avec une protéine fluorescente (tels que GFP) ; Insérez ensuite la construction dans le vecteur binaire (par exemple, pCambia1300). Ici, l’élément de réponse auxine DR5 est présentée comme un exemple de10.</li>
		<li>Introduire le plasmide DR5-GFP qui en résulte dans les plantes de type sauvage par Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation11. Sélectionner les plantes T1 à l’aide de plaques milieu MS contenant hygromycine (50 mg/mL de liqueur mère, dilué 1:1, 000). Les plantes transgéniques seront présentent de longues racines et génèrent deux feuilles en rosette après 8 jours de croissance dans les conditions décrites aux Articles 1.1.5.</li>
		<li>Transférer les plantes transgéniques dans le sol et les cultiver comme indiqué dans 1.1.6 et 1.1.7.</li>
		<li>Recueillir les graines T2 des lignes T1 indépendants. Semer des graines sur des plaques de MS-hygromycine, sélectionner les plantes portant une copie de l’insertion de DR5-GFP (le ratio de plantes résistantes aux plantes sensibles sera environ 3:1) et les transférer sur le sol.</li>
		<li>Cultiver les plantes T2 comme indiqué dans 1.1.6 et 1.1.7.</li>
		<li>Recueillir les graines T3 provenant des installations de T2. Semer des graines sur des plaques de MS-hygromycine, sélectionner les plantes transgéniques homozygotes (toutes les plantes d’une seule ligne exposera la résistance hygromycine) et les transférer sur le sol.</li>
		<li>Marquer les boutons floraux des plantes T3 homozygotes comme indiqué dans 1.1.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Observation de signal GFP
	<ol>
		<li>Mélanger 3 mL de glycérol à 47 mL d’eau ultrapure pour générer une solution de glycérol de 6 %.</li>
		<li>Fixez un morceau de ruban adhésif double-face à une lame de microscope de verre et fixer une silique comme indiqué à l’alinéa 1.3.1.</li>
		<li>Diviser les carpelles des deux côtés de la pseudoseptum avec une aiguille de seringue et fixer les deux carpelles disséqués à la diapositive sous un stéréoscope comme il est indiqué dans la section 1.3.2.</li>
		<li>Administrer 30 µL de 6 % de glycérol sur la lame de verre et placer tous les ovules de carpelles disséqués dans la solution à l’aide de pinces à épiler à pointe fine. Placez un lamelle couvre-objet sur la diapositive doucement.</li>
		<li>Comme le tégument et l’endosperme dans chaque ovule peuvent empêcher l’observation des signaux GFP dans l’embryon, extraire l’embryon de l’ovule. Cliquez sur la diapositive rapidement et doucement pour extraire l’embryon de l’ovule (plus mature un ovule est, moins de la force doit être appliqué à la diapositive).</li>
		<li>Examiner la lame pour à l’aide de laser confocal, microscopie à fluorescence GFP. Trouvez les embryons isolés sous un champ de faible puissance (10 X) et noter leur emplacement, puis changer à un champ de haute puissance (objectif d’immersion d’huile-100 X) pour observer l’expression DR5-GFP dans les embryons en définissant la source lumineuse de l’excitation à 488 nm pour la détection du signal GFP.</li>
		<li>Détecter l’expression de la GFP dans les embryons pour sélectionner la ligne T3 adaptée pour une analyse ultérieure.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. caractérisation de la Formation embryonnaire dans un embryon-lethal Mutant via la clairance de l’Ovule et l’Observation de protéine marqueur : Naa10 par exemple
<ol>
	<li>Structuration d’embryon chez les plantes mutantes naa10
	<ol>
		<li>Préparer les matières végétales comme indiqué dans 1.1.1-1.1.7.</li>
		<li>Identifier les naa10+ / − plantes par PCR avec des amorces spécifiques aux gènes5, puis marquez les boutons floraux de la naa10+ / − plantes comme indiqué dans 1.1.8.</li>
		<li>Effectuer le dédouanement de l’ovule et l’examen microscopique de naa10+ / − embryons figurant aux points 1.2 et 1.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analyse des protéines marqueur utilisant des embryons naa10
	<ol>
		<li>Obtenir approprié DR5-GFP de lignées transgéniques à l’aide de la procédure décrite au point 2.1-2.2.</li>
		<li>Franchir la ligne transgénique DR5-GFP homozygote avec une naa10+ / − plante pour obtenir naa10+ / − plantes qui sont homozygotes pour le marqueur de fluorescence GFP à la génération F2 (identifiée par PCR du gène-spécifique) pour caractériser naa10+ / −5 et observez le signal GFP au microscope utilisant une ligne DR5-GFP homozygote.</li>
		<li>Marquer les boutons floraux de naa10+ / − plantes qui sont homozygotes pour DR5-GFP comme indiqué dans 2.1.7.</li>
		<li>Rechercher le signal GFP dans des embryons de naa10 qui sont homozygotes pour DR5-GFP comme indiqué au point 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li>
<li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+flowering+plants%3A+setting+up+the+basic+body+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li>
<li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li>
<li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+plant%3A+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li>
<li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/genetics/abstract/0168-9525(93)90246-E">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li>
<li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li>
<li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aux%2FIAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li>
<li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li>
<li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li>
<li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dégagement de l’ovule est une méthode utile pour détecter la division cellulaire et d’évaluer la morphologie au cours de l’embryogenèse chez Arabidopsis; en utilisant cette technique, les embryons peuvent être observées directement sous DIC microscopie5,12. L’étape critique pour le dédouanement de l’ovule est étape 1.3.4. Le temps nécessaire au dégagement d’ovule dans étape 1.3.4 est variable. Embryons au stade de 2/4-cellules peuvent être clairement obs...

L’embryogenèse est l’événement plus tôt dans le développement de la plante. Une forme d’embryon mature d’un zygote à travers la division cellulaire et la différenciation sous strict contrôle génétique1,2. Arabidopsis embryons sont un modèle utile pour étudier le contrôle de la morphogenèse, parce que la séquence des divisions cellulaires au cours de l’embryogenèse suit un modèle attendu3,4. Cependant, un embryon d’Arabidopsis contenant un à plusieurs cellules est trop petit pour être observé et analysé. En outre, la mutation de certains gènes peut provoquer embryon létalité5, indiquant le rôle clé de ces gènes dans l’embryogenèse. La caractérisation de la formation chez les mutants létaux embryon fournit une base pour comprendre le mécanisme moléculaire par lequel gènes essentiels réglementent le développement des embryons.
Une méthode détaillée est décrite ici pour la caractérisation de la formation dans la plante modèle Arabidopsis embryon par observation microscopique. La méthode consiste à dégagement ovule, suivie de l’observation microscopique d’un embryon. La caractérisation d’un mutant embryon létale est également décrite.
La morphologie des embryons à des stades différents de développement peut être déterminée directement par microscopie les ovules qui ont été effacées avec solution6,7 de Hoyer. Ces ovules présentent un indice de réfraction élevé ; ainsi, cet ovule méthode de compensation est particulièrement avantageuse pour les échantillons qui doivent être observées au microscope (DIC) de contraste interférentiel différentiel.
En outre, les gènes qui sont exprimés dans une cellule particulière ou un nombre limité de cellules au cours de l’embryogenèse utilisable comme marqueurs pour identifier les cellules de l’embryon. Par conséquent, la spécification d’identité cellulaire au cours de l’embryogenèse peut être annotée en contrôlant l’expression des protéines GFP-étiquetée marqueur laser confocal, microscopie à balayage. À l’inverse, observant le modèle d’expression d’un gène fonctionnelle inconnue - fusion deGFP durant l’embryogenèse peut fournir un lien entre la structuration de l’embryon et l’expression de ce gène et faciliter l’identification de nouveaux gènes qui sont requises pour l’embryogenèse chez Arabidopsis.
La méthode décrite ici peut également être utilisée pour caractériser le phénotype d’un mutant embryon létal et pour déterminer l’impact du gène affecté sur l’embryogenèse au niveau cellulaire. En outre, en combinaison avec une comparaison du modèle d’expression des gènes marqueurs durant l’embryogenèse entre plantes sauvage et mutantes, la méthode peut donner des indices sur les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans l’embryogenèse8,9. En effet, la méthode a été appliquée aux plantes de naa10 , et il a été constaté que la division anormale de l’hypophyse chez le mutant peut être causée par un changement dans la répartition de l’auxine au cours de l’embryogenèse,5.

<table><tbody><tr><td>Hydrate de chloral</td><td>Sigma</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Murashige et Skoog Milieu basal</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine</td><td>Roche</td><td>10843555001</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de croissance</td><td>Percival</td><td>CU36L5</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Zeiss Image M2</td><td>caméra : AxioCam 506 couleur</td></tr><tr><td>Microscopie confocale à balayage laser</td><td>Zeiss Oberkochen Zeiss LSM</td><td>5</td><td>filtres : BP 495 - 555 nm</td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Zeiss Oberkochen</td><td>Axio Zoom V16</td><td>caméra : AxioCam MRc5</td></tr><tr><td>sol riche en nutriments</td><td>KLASMANN, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 ml</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de 1,5 mL</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>d’hypochlorite de sodium à 10 %</td><td>Réactif analytique domestique</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td>Réactif analytique domestique</td></tr><tr><td>KOH</td><td></td><td></td><td>Réactif analytique domestique</td></tr><tr><td>glycérol</td><td></td><td></td><td>Boîte</td></tr><tr><td></td><td></td><td>de culture</td> de réactifs analytique domestique <td>Fournitures domestiques</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td>Fournitures domestiques</td></tr><tr><td>Lame</td><td></td><td></td> en verre <td>Fournitures domestiques</td></tr><tr><td>Seringue Fournitures</td><td></td><td></td><td>domestiques</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td></td><td></td> à pointe fine <td>Fournitures domestiques</td></tr><tr><td>Banc</td><td></td><td></td> super propre <td>Équipement domestique</td></tr></tbody></table>

une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Étant donné la nature hautement prévisible de leur développement, Arabidopsis embryons ont servi comme modèle pour l’étude de la morphogénèse chez les plantes. Cependant, embryons plante au stade précoce sont petites et contiennent peu de cellules, ce qui les rend difficiles à observer et à analyser. On décrit ici une méthode pour caractériser la formation du patron chez les embryons de la plante sous un microscope à l’aide de l’organisme modèle Arabidopsis. Suite à l’apurement des ovules frais à l’aide de la solution de Hoyer, le nombre de cellules dans et la morphologie des embryons pouvaient être observés, et leur stade de développement peut être déterminée par le microscope à contraste interférentiel différentiel à l’aide d’un 100 X lentille d’immersion d’huile. En outre, l’expression de protéines spécifiques de marqueurs taggés avec la protéine fluorescente verte (GFP) a été suivie pour annoter la spécification identité des cellules au cours de la structuration de l’embryon par laser confocal, microscopie à balayage. Ainsi, cette méthode peut être utilisée pour observer la formation de modèles dans des embryons de plante sauvage aux niveaux cellulaires et moléculaires et de caractériser le rôle de certains gènes dans la structuration de l’embryon en comparant la formation du patron chez les embryons de type sauvage et des mutants létaux embryon. Par conséquent, la méthode peut servir à caractériser l’embryogenèse chez Arabidopsis.

La méthode décrite dans cet article peut servir à observer l’embryogenèse directement sous un microscope, annoter les spécifications d’identité cellulaire au cours de l’embryogenèse avec des marqueurs spécifiques et caractériser le rôle d’un gène particulier au cours de l’embryogenèse.
Des résultats représentatifs de l’analyse d’embryon structuration (à partir de l’étape allongée zygote au stade de maturité-bâton de marche) dans...

Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

L'objectif général de cette méthode est de caractériser la formation du modèle embryonnaire au cours de l'embryogenèse végétale en utilisant l'organisme modèle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, telles que l'embryogenèse chez Arabidopsis. Le principal avantage de cette technique est que la formation du modèle embryonnaire chez la plante modèle Arabidopsis peut être caractérisée par l'opération recommandée.La procédure est démontrée par Jinlin Feng, étudiante diplômante de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez 100 graines dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre d'hypochlorite de sodium pour stériliser les graines.Retournez le tube plusieurs fois pour vous assurer que les graines et la solution sont bien mélangées. Après cinq minutes, centrifugez le tube à 1200 Gs pendant 30 secondes. Éliminez le surnageant et lavez les graines avec de l’eau stérile quatre fois afin d’éliminer tout hypochlorite de sodium résiduel.Ensuite, ajoutez 4,4 grammes de mélange de sels basiques MS et 10 grammes de saccharose à un litre d'eau ultra-pure. Agitez pour dissoudre le sel et le saccharose. À l'aide de l'hydroxyde de potassium à une mole, ajustez le pH de la solution à 5,8.Ensuite, ajoutez trois grammes d'agent gélifiant et stérilisez la solution à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Versez 30 millilitres du milieu MS obtenu dans une boîte de culture de 12 centimètres. Placez les graines stérilisées sur la plaque MS.Transférez la plaque dans un réfrigérateur et conservez-la à quatre degrés Celsius à l’obscurité pendant trois jours afin de stratifier les graines. Ensuite, maintenez la plaque dans une chambre de croissance en conditions de long jour pendant huit jours. Puis, transférez les plantes en terre dans un bac.Couvrez le plateau avec un couvercle blanc transparent pour éviter la perte d'eau. Laissez une petite ouverture pour prévenir la vitrification des plantes. Au bout de cinq jours, retirez le couvercle et faites pousser les plantes dans une chambre climatique en conditions de jours longs.Après environ 20 jours de croissance, utilisez un fil pour marquer 10 à 15 bourgeons floraux au niveau des tiges des graines et de l'inflorescence à 20 h. Définissez le début de la pollinisation de l'ovule lorsque les bourgeons marqués s'ouvrent en fleurs, soit à 8 h le lendemain matin. Pour commencer la préparation de la solution de Hoyer, ajoutez 24 grammes de chlorhydrate dans un tube de 50 millilitres. Enveloppez complètement le tube dans du papier d'aluminium, en veillant à ce que le papier bloque entièrement la lumière.Ajouter neuf millilitres d'eau ultra-pure et trois millilitres de glycérol. Agiter le tube pour dissoudre le chlorhydrate. Laisser ensuite la solution de Hoyer préparée reposer toute la nuit à température ambiante afin d'éliminer les bulles éventuelles.Pour commencer, fixez un morceau de ruban adhésif double face sur une lame de microscope. Placez une silique, cultivée pendant le nombre de jours souhaité après la pollinisation, de sorte que le pseudoséptum soit perpendiculaire à la surface. À l’aide de l’aiguille d’une seringue, fendez les carpelles des deux côtés du pseudoséptum.Ensuite, fixez les deux carpelles disséqués sur la lame de façon que les ovules et le siliques soient visibles au stéréomicroscope. Déposez 70 microlitres de solution de Hoyer sur la lame en verre. Plongez ensuite une paire de pincettes à pointe fine dans la solution afin d'humidifier la pointe.À l’aide du stéréomicroscope et de la pince, déplacer les ovules dans la solution de Hoyer pour nettoyer les embryons. Ensuite, poser délicatement une lamelle sur la préparation, en veillant à ne pas former de bulles. Placer la lame terminée dans une boîte, dans une pièce sombre, de deux à douze heures à température ambiante.Une fois le temps nécessaire écoulé, utilisez la fonction DIC du microscope pour examiner les ovules clarifiés. Localisez les embryons en champ grossissant, puis passez en champ élevé pour observer le motif cellulaire des embryons développés. Ensuite, examinez les embryons à différents stades de développement.Pour commencer, préparez le plasmide DR5 GFP et introduisez-le dans les plantes de type sauvage par transformation médiée par agrobactérie à l'aide de méthassians, comme décrit dans le protocole écrit. Sélectionnez les plantes T1 à l'aide de boîtes de milieu MS contenant de l'hydrolysine. Ensuite, transférez et cultivez les plantes comme indiqué dans le protocole écrit afin d'obtenir des plantes T3.À l’aide d’un fil, marquer les bourgeons floraux de la plante T3 homozygote au niveau des pédicelles des graines sur l’inflorescence à 20h00. Ensuite, mélanger trois millilitres de glycérol avec 47 millilitres d’eau ultra pure pour préparer une solution de glycérol à 6 %. Puis fixer un morceau de ruban adhésif double face sur une lame de microscope. Placer une siliques de plante T3 sur la lame, en orientant le pseudoséptum perpendiculairement à la surface.À l’aide d’une aiguille de seringue, séparer les carpelles des deux côtés du faux septum. Fixer les deux carpelles disséqués sur la lame de façon à ce que les ovules et le silicule soient visibles au stéréomicroscope. Ensuite, déposer 30 microlitres de glycérol à 6 % sur la lame.Trempez une paire de pinces à pointes fines dans la solution pour humidifier la pointe. À l’aide du stéréoscope et des pinces, déplacez les ovules dans la solution de glycérine. Placez délicatement une lamelle sur la préparation.Ensuite, tapez doucement et rapidement sur la lame afin d'extraire l'embryon du carpelle. Après cela, utilisez la microscopie à balayage laser confocale pour examiner la lame à la recherche de fluorescence de la protéine fluorescente verte. Repérez les embryons isolés sous un champ de faible puissance et enregistrez leur position.Passer à un grossissement élevé et régler la source lumineuse d'excitation sur 488 nanomètres pour observer l'expression de GR5 GFP dans les embryons. Ensuite, détecter l'expression de GFP et caractériser la formation du motif embryonnaire conformément au protocole décrit dans le texte. Dans cette étude, l'embryogenèse chez Arabidopsis est observée par clarification des ovules, comme on peut le voir.Après l'&#233;limination des ovules, les embryons &#224; diff&#233;rents stades de d&#233;veloppement sont discernables par microscopie &#224; contraste interf&#233;rentiel diff&#233;rentiel. Le profil d'expression de GR5 GFP au cours de l'embryogen&#232;se est ensuite enregistr&#233; en microscopie confocale &#224; balayage laser. L'expression de DR5 est observ&#233;e au p&#226;le racinaire des embryons de type sauvage de forme globulaire et cardiaque.On observe une expression de DR5 au niveau des extrémités des cotylédons embryonnaires et dans les tissus vasculaires des embryons sauvages matures. Ensuite, le rôle de naa10 chez Arabidopsis durant l'embryogenèse est examiné. L'hypothèse observée révèle une division anormale, avec des divisions obliques et verticales chez naa10, contrairement à la division asymétrique transversale observée chez les plantes de type sauvage.Comme on le voit ici, l'oxène présente une distribution presque uniforme dans la plupart des embryons naa10 au stade globulaire, et conserve un signal plus étendu dans les hypothèses par rapport aux embryons de type sauvage. Ces résultats indiquent que naa10 est nécessaire à l'embryogenèse et qu'il pourrait être impliqué via la voie de signalisation de l'oxène chez Arabidopsis. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de savoir comment cultiver Arabidopsis en tant que matériel végétal.Après cette procédure, d'autres mesures, telles que l'hybridation in situ, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'expression de gènes spécifiques aux cellules. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l'embryogenèse pour explorer le mécanisme moléculaire par lequel des gènes spécifiques régulent l'embryogenèse chez Arabidopsis. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de caractériser l'embryogenèse chez Arabidopsis.

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