Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

L’objectif général de cette méthode est de caractériser la formation du modèle des embryons au cours de l’embryogenèse végétale à l’aide de l’organisme modèle. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la matière végétale, comme l’embryogenèse chez Arabidopsis. Le principal avantage de cette technique est que la formation du motif embryonnaire chez la plante modèle Arabidopsis peut être caractérisée par l’opération recommandée.

La démonstration de la procédure est assurée par Jinlin Feng, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez 100 graines dans un tube de 1,5 millilitre. Ajoutez un millilitre d’hypochlorite de sodium pour stériliser les graines.

Retournez le tube plusieurs fois pour vous assurer que les graines et la solution sont bien mélangées. Après cinq minutes, centrifugez le tube à 1200 Gs pendant 30 secondes. Retirez le surnageant et lavez les graines à l’eau stérile quatre fois pour éliminer tout résidu d’hypochlorite de sodium.

Ensuite, ajoutez 4,4 grammes de mélange de sel de base MS et 10 grammes de saccharose à un litre d’eau ultra pure. Remuer pour dissoudre le sel et le saccharose. En utilisant de l’hydroxyde de potassium à un mol, ajustez le pH de la solution à 5,8.

Ensuite, ajoutez trois grammes de gélifiant et stérilisez la solution à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Versez 30 millilitres du milieu MS obtenu dans une boîte de culture de 12 centimètres. Placez les graines stérilisées sur la plaque MS.

Transférez l’assiette dans un réfrigérateur et conservez-la à quatre degrés centigrades dans l’obscurité pendant trois jours pour stratifier les graines. Ensuite, conservez la plaque dans une chambre de croissance dans des conditions de jours longs pendant huit jours. Ensuite, transférez les plantes dans le sol dans un plateau.

Couvrez le plateau avec un couvercle blanc transparent pour éviter toute perte d’eau. Laisser un petit espace pour éviter la vitrification des plantes. Après cinq jours, retirez le couvercle et cultivez les plantes dans une chambre de plain-pied dans des conditions de jours longs.

Après environ 20 jours de croissance, utilisez un fil pour marquer 10 à 15 boutons floraux à la position des tiges des graines et de l’inflorescence à 20h00. Définissez le début de la pollinisation de l’ovule lorsque les bourgeons marqués s’ouvrent pour fleurir à 8h00 le lendemain matin. Pour commencer à préparer la solution de Hoyer, ajoutez 24 grammes de chlorhydrate dans un tube de 50 millilitres. Enveloppez complètement le tube dans du papier d’aluminium, en vous assurant que le film scelle toute lumière.

Ajoutez neuf millilitres d’eau ultra pure et trois millilitres de glycérol. Agitez le tube pour dissoudre le chlorhydrate. Ensuite, laissez reposer la solution de Hoyer préparée toute la nuit à température ambiante pour éliminer les bulles.

Pour commencer, fixez un morceau de ruban adhésif double face à une lame de verre de microscope. Placez une silique, cultivée pendant le nombre de jours souhaité après la pollinisation, sur le côté avec le pseudoseptum perpendiculaire à la surface. À l’aide d’une aiguille de seringue, fendez les carpiens des deux côtés du pseudoseptum.

Ensuite, fixez les deux carpiens disséqués à la lame de manière à ce que les ovules et la silique soient visibles sous un stéréoscope. Versez 70 microlitres de solution Hoyer sur la lame de verre. Trempez ensuite une pince à épiler à pointe fine dans la solution pour humidifier la pointe.

À l’aide du stéréoscope et de la pince à épiler, déplacez les ovules dans la solution de Hoyer pour nettoyer les embryons. Après cela, appliquez doucement une lamelle sur la diapositive, en veillant à ne pas générer de bulles. Placez la diapositive finie dans une boîte dans une pièce sombre pendant deux à 12 heures à température ambiante.

Une fois le temps nécessaire écoulé, utilisez la fonction DIC du microscope pour examiner les ovules clairsemés. Localisez les embryons sous un champ de faible puissance, puis passez à un champ de haute puissance pour observer le modèle cellulaire des embryons développés. Ensuite, examinez les embryons à différents stades de développement.

Pour commencer, préparez le plasmide DR5 GFP et introduisez-le dans les plantes de type sauvage par transformation par l’intermédiaire d’agrobactéries à méthassiens, comme indiqué dans le protocole de texte. Sélectionnez les plantes T1 à l’aide de plaques de milieu MS contenant de l’hydrolysine. Ensuite, transférez et cultivez les plantes comme indiqué dans le protocole textuel pour obtenir des plantes T3.

À l’aide d’un fil, marquez les boutons floraux de la plante homozygote T3 à la position des tiges des graines à l’inflorescence à 20h00. Après cela, mélangez trois millilitres de glycérol avec 47 millilitres d’eau ultra pure pour générer une solution de glycérol à 6 %. Fixez ensuite un morceau de ruban adhésif double face à une lame de verre de microscope. Placez la silique d’une plante T3 sur la lame avec le pseudoseptum perpendiculaire à la surface.

À l’aide d’une aiguille de seringue, fendez les carpiens des deux côtés du pseudoseptum. Fixez les deux carpes disséqués à la lame de manière à ce que les ovules et la silique soient visibles sous un stéréoscope. Ensuite, versez 30 microlitres de glycérol à 6 % sur la lame.

Trempez une pince à épiler à pointe fine dans la solution pour humidifier la pointe. À l’aide du stéréoscope et de la pince à épiler, placez les ovules dans la solution de glycérol. Placez délicatement une lamelle sur la glissière.

Ensuite, tapotez la lame rapidement et doucement pour extruder l’embryon de l’ovule. Après cela, utilisez la microscopie confocale à balayage laser pour examiner la lame à la recherche de fluorescence de protéine fluorescente verte. Trouvez les embryons isolés sous un champ de faible puissance et notez leur emplacement.

Passez à un champ de haute puissance et réglez la source lumineuse d’excitation à 488 nanomètres pour observer l’expression de la GFP GR5 dans les embryons. Ensuite, détectez l’expression de la GFP et caractérisez la formation du modèle embryonnaire comme décrit dans le protocole texte. Dans cette étude, l’embryogenèse chez Arabidopsis est observée via la clairance de l’ovule, comme on peut le voir.

Après la clairance de l’ovule, les embryons à différents stades de développement sont distinguables à l’aide de la microscopie à contraste interférentiel différentiel. Le profil d’expression de la GFP GR5 au cours de l’embryogenèse est ensuite enregistré sous microscopie confocale à balayage laser. On voit que DR5 est exprimé dans le pôle racinaire des embryons globulaires et en forme de cœur de type sauvage.

DR5 s’exprime dans les extrémités des cotylédons embryonnaires et dans le système vasculaire des embryons matures de type sauvage. Après cela, le rôle de naa10 chez Arabidopsis au cours de l’embryogenèse est de l’examiner. L’hypothèse observée est anormalement divisée, avec une division oblique et verticale chez naa10 par rapport à une division asymétrique transversale chez les plantes de type sauvage.

Comme on le voit ici, les bœufs ont une distribution presque uniforme dans la plupart des embryons naa10 au stade globulaire, et conservent un signal plus large dans les hypothèses par rapport aux embryons de type sauvage. Ces résultats indiquent que naa10 est nécessaire à l’embryogenèse et qu’il peut être invoqué via la voie de signalisation des bœufs chez Arabidopsis. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler comment cultiver Arabidopsis en tant que matière végétale.

Suite à cette procédure, d’autres mesures telles que l’hybridation in situ peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’expression de gènes spécifiques à la cellule. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine de l’embryogenèse pour explorer le mécanisme moléculaire par lequel des gènes spécifiques médient l’embryogenèse chez Arabidopsis. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de caractériser l’embryogenèse chez Arabidopsis.