Détermination de l'expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d'astritcy primaires utilisant la biotinylation

Dans cette vidéo, deux méthodes seront présentées, la biotinylation à la surface cellulaire et la biotinylation pulse-chase. Dans la démonstration suivante, nous utiliserons des astrocytes. Ce sont les types de cellules gliales les plus abondants dans le cerveau, et il se trouve qu’elles expriment notre protéine d’intérêt, l’aquaporine-4.

Les méthodes que nous utilisons dans cet article pourraient être appliquées à de nombreux types de cellules différents, et celles-ci pourraient inclure soit des cellules en suspension, soit des cellules adhérentes. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier l’expression à la surface cellulaire et l’internalisation de pratiquement n’importe quelle protéine transmembranaire, à condition qu’elle possède un domaine extracellulaire accessible à la biotine. L’objectif global de cet essai de biotinylation à la surface cellulaire est de déterminer les effets de la laminine sur l’expression du canal perméable à l’eau Aquaporin-4 au niveau de la membrane plasmique des astrocytes.

Pour commencer cette procédure, retirez les cultures d’astrocytes de l’incubateur et jetez le milieu par aspiration. Lavez les cellules trois fois avec quatre millilitres de CM-PBS réfrigéré et placez la vaisselle sur de la glace pilée. Retirez le CM-PBS par aspiration, puis pipetez deux millilitres de tampon de biotine dans chaque puits.

Inclinez doucement les plats d’avant en arrière à quelques reprises pour assurer une couverture complète avant de placer les cultures sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, retirez le tampon de biotine, remplacez-le par quatre millilitres de tampon de trempe et conservez les cultures sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez et remplacez par la même quantité de tampon de trempe avant de laisser les cultures sur de la glace pendant 10 minutes.

Ensuite, jetez le tampon de trempe et lavez les cellules trois fois avec quatre millilitres de CM-PBS réfrigéré. Ensuite, grattez les cellules en un millilitre de CM-PBS réfrigéré et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, granulez les cellules par centrifugation à 100 g pendant trois minutes dans une microcentrifugeuse réfrigérée réglée à quatre degrés Celsius.

Après cela, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, laissez les échantillons sur de la glace pendant 30 minutes, en tourbillonnant toutes les cinq minutes. Ensuite, centrifugez le lysat à 14 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler tout détergent et matière soluble.

Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Économisez 50 microlitres de lysat et ajoutez-y 25 microlitres de tampon de chargement 3 X. Par la suite, dénaturez-le en le chauffant à 95 degrés Celsius dans un bain sec.

Il s’agit de la fraction d’entrée, contenant à la fois des protéines biotinylées à la surface des cellules ainsi que des protéines cytosoliques non biotinylées. À l’aide d’une pointe de pipette coupée, transférez 75 microlitres de billes d’agarose streptavidine dans le lysat et incubez-le à quatre degrés Celsius pendant trois heures sur un agitateur. Après cela, granulez les billes d’agarose streptavidine par centrifugation à 1 500 g pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius.

Économisez 50 microlitres de surnageant et ajoutez 25 microlitres de trois tampons de chargement X. Ensuite, dénaturez-le à 95 degrés Celsius dans un bain-marie ou un bloc chauffant. Celle-ci représente la fraction intracellulaire et est composée principalement de protéines cytosoliques non biotinylées.

Ensuite, mettez les billes en suspension dans un millilitre de tampon de lavage et balancez-les pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Granulez les perles et jetez le surnageant. Répétez ce processus quatre fois de plus pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées.

Ajouter 50 microlitres de tampon de chargement dilué à un X à l’aide d’un tampon de lyse. Libérez la biotine et la streptavidine des billes en les dénaturant à 95 degrés Celsius. Cette fraction ne doit contenir que des protéines biotinylées à la surface des cellules.

Par la suite, séparez les fractions d’entrée, de surface cellulaire et intracellulaires par SDS-PAGE et analysez par western blot. L’objectif global de l’expérience de biotinylation par chasse à impulsions est de déterminer le taux approximatif d’internalisation de l’aquaporine-4 dans les astrocytes. Tout d’abord, retirez les cultures d’astrocytes de l’incubateur et aspirez le milieu.

Ensuite, lavez les cellules trois fois avec quatre millilitres de CM-PBS réfrigéré et placez la vaisselle sur de la glace pilée. Aspirez le CM-PBS, puis pipetez trois millilitres de tampon de biotine dans chaque plat. Inclinez les plats d’avant en arrière plusieurs fois pour vous assurer que le tampon est bien réparti et laissez-les sur de la glace pendant 30 minutes.

Ensuite, aspirez le tampon de biotine et remplacez-le par cinq millilitres de milieu chaud. Incuber une boîte de culture à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes et une deuxième boîte à la même température pendant 30 minutes. Laissez un autre plat à quatre degrés Celsius comme échantillon de zéro minute.

À la fin de la période d’incubation, jetez le milieu et lavez les cellules trois fois avec quatre millilitres de CM-PBS réfrigéré. Ensuite, aspirez le CM-PBS, puis pipetez six millilitres de tampon réducteur sur les cellules et laissez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, remplacez le milieu par six millilitres de tampon réducteur frais et placez l’échantillon sur de la glace pendant 15 minutes supplémentaires.

Cette étape est essentielle car le glutathion contenu dans le tampon réducteur clivera la biotine restante à la surface de la cellule. Cela garantit que seules les protéines internalisées seront marquées à la biotine. Ensuite, retirez la solution réductrice et remplacez-la par six millilitres de tampon de trempe.

Laissez l’échantillon sur de la glace pendant encore 15 minutes et répétez l’étape de trempe une fois de plus. Ensuite, jetez le tampon de trempe et lavez les cellules trois fois, avec quatre millilitres de PBS réfrigéré. Aspirez le CM-PBS, puis raclez les cellules dans un millilitre de PBS réfrigéré, à l’aide d’un élévateur de cellules, et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugation.

Granulez les cellules par centrifugation à 100 g pendant trois minutes. Après trois minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse. Laissez l’échantillon sur de la glace pendant 30 minutes et faites un tourbillon toutes les cinq minutes.

Centrifugez le lysat à 14 000 g, pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, pour granuler le détergent et les matières solubles. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation. Économisez 50 microlitres de ce lysat et ajoutez un tampon de chargement.

Par la suite, dénaturez les cellules à 95 degrés Celsius, dans un bain sec. Il s’agit de la fraction d’entrée, contenant à la fois des protéines endocytosées biotinylées, ainsi que des protéines non biotinylées. À l’aide d’une pointe de pipette coupée, ajoutez 150 microlitres de bouillie d’agarose streptavidine au lysat et incubez-la à quatre degrés Celsius pendant trois heures, sur un agitateur.

Après trois heures, granulez les billes d’agarose streptavidine par centrifugation, à 1 500 g pendant 30 secondes, à quatre degrés Celsius. Remettez les perles en suspension dans un millilitre de tampon de lavage et balancez-les pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Granulez les perles et jetez le surnageant.

Répétez ce processus quatre fois de plus pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées. Ensuite, granulez les billes par centrifugation à 1 500 g pendant 30 secondes, à quatre degrés Celsius. Jetez le tampon de lavage sus-jacent et ajoutez 50 microlitres d’un tampon de chargement.

Libérez la biotine et la streptavidine des billes, en les dénaturant à 95 degrés Celsius. Cette fraction ne doit contenir que des protéines de surface cellulaire internalisées. Ensuite, séparez l’entrée, la surface de la cellule et les fractions non liées, par SDS-PAGE, et analysez par Western blot.

On voit ici la surface cellulaire, les fractions intracellulaires et totales des astrocytes non traités, et les astrocytes traités avec de la laminine nanomolaire 24, sondée pour l’aquaporine-4 et le bêta-dystroglycane. Cet histogramme illustre les différences dans les niveaux de surface cellulaire de l’aquaporine-4, dans les astrocytes non traités et traités par la laminine, normalisés contre le bêta-dytroglycane. Dans cette figure, les fractions protéiques internalisées recueillies à zéro, 15 et 30 minutes ont été sondées pour l’aquaporine-4.

Et cet histogramme, résume l’internalisation de l’Aquaporine-4, pour quatre expériences indépendantes, normalisée par rapport aux valeurs pour le point temporel de la minute zéro. L’astérisque indique une augmentation statistiquement significative de la quantité d’Aquaporine-4, endocytosée entre 15 et 30 minutes. Lorsque le glutathion est utilisé pour rompre la liaison disulfure dans l’analogue de la biotine clivable, la contribution de l’aquaporine-4 de surface cellulaire à la fraction biotinylée est fortement réduite.

Il en résulte une nette différence entre les échantillons de zéro minute et de 15 minutes. Lorsque l’étape est omise, le signal provenant du pool de surface de cellule rend indétectable le changement entre les deux points temporels. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunofluorescence et la microscopie TIRF pourraient être appliquées pour répondre à des questions supplémentaires, y compris le trafic physique de la cargaison.