Name: In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Découvrez la culture in vitro d'ovules pour l'imagerie en cellules vivantes de la polarisation du zygote et du développement embryonnaire chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode permet de suivre les dynamiques cellulaires en temps réel.

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Microscopie dans ce travail a été menée à l’Institut de transformatrices biomolécules (WPI-ITbM) de l’Université de Nagoya et soutenue par le Japon Advanced Plant Science Network. Ce travail a été soutenu par les bourses de la Japan Science and Technology Agency (projet ERATO T.H. et M.U.) et la société japonaise pour la Promotion de la Science : une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 et JP15H05955 pour M.U. et amendements. JP16H06465, JP16H06464 et JP16K21727 pour T.H), une subvention pour les jeunes scientifiques (B, Nos. JP24770045 et JP26840093 pour M.U.) et une subvention de recherche exploratoire difficiles (no JP16K14753 pour M.U.).

1. préparation du milieu de Culture In Vitro Ovule <ol><li>faire le milieu liquide pour l’in vitro culture ovule (&#34; N5T moyenne &#34;) contenant 1 x Nitsch basale mélange de sel, 5 % (p/v) dihydrate de tréhalose, 0,05 % (p/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide (MES)-KOH (pH 5,8) et 1 x Gamborg &#39; solution de vitamines de s.</li>
	<li>Ajuster le pH à 5,8 avec KOH.</li>
	<li>Stériliser le milieu autoclavage (121 ° C, 20 min) ou filtrer à travers un filtre de 0,22 µm. 
	Remarque : Le milieu stérilisé peut être stocké à 4 ° C pendant 2 à 3 mois.</li>
</ol> 2. Préparation de l’appareil tableau de PDMS Micropillar <ol><li>coupe l’appareil de micropillar PDMS par un couteau, une lame de rasoir ou de ciseaux pour s’insérer dans la partie en verre (14 mm φ) d’un plat de fond en verre de 35 mm. 
	Remarque : La procédure complète de la construction du dispositif PDMS est décrit dans les précédents documents 8 , 9, et donc les détails sont omises ici. Des plats avec des volumes plus petits, tels que des plaques de 4 puits ou 96 puits, fond en verre peuvent être utilisés pour l’imagerie à court terme sans le dispositif de.</li>
	<li>Stériliser le dessus de l’appareil PDMS sous lumière UV pendant 15 min.</li>
	<li>Tourner le dispositif PDMS par à l’aide de la pince à épiler pointe carrée et gardez-le sous exposition aux UV lumière pendant 15 min stériliser bas.</li>
	<li>Transférer le dispositif stérilisé de PDMS dans une boîte de Petri de 35 mm et ajouter le support de N5T jusqu'à ce que l’appareil est complètement trempée dans le milieu (environ 5-7 mL).</li>
	<li>Mettre le plat dans une chambre à vide et réduire la pression pour dégazer. Gardez passer l’aspirateur pendant 3 h pour la nuit jusqu'à ce que l’air dans l’appareil est remplacé par le milieu. 
	Remarque : L’appareil peut être enlevé par des bulles d’air sous un vide fort.</li>
	<li>Prendre le périphérique de la capsule en la tenant avec une pince à épiler pointe carrée et mettez-le sur du papier absorbant pour enlever le support supplémentaire sur le côté et le bas. 
	NOTE : le support sur le tableau de micropillar (surface supérieure) ne doit pas être supprimé car il sera utilisé pour la culture de l’ovule.</li>
	<li>L’appareil sur un verre de lame 76 x 26 mm, veiller à préserver la partie micropillar dans la partie supérieure, de transfert et de recouvrir l’appareil avec 35 mm culture plat couvercle afin d’empêcher le milieu ne se dessèchent pas lors de l’extraction d’ovule suivant.</li>
</ol> 3. Silique Dissection et Extraction d’ovules <ol><li>stériliser une aiguille (0,40 mm G) et des pinces fines en l’essuyant avec l’éthanol à 70 %. L’aiguille est facilement manipulé en l’attachant à un bâton de bois ou de seringue.</li>
	<li>Vérifier l’inflorescence de la plante, puis sélectionnez les siliques appropriées pour l’expérience. Les siliques mm environ 5 contiennent des zygotes et des siliques de 8-10 mm comprennent jeunes embryons globulaires.</li>
	<li>D’accise les siliques à l’aide de pinces à épiler et placez-les sur le ruban adhésif double-face sur un verre de lame 76 x 26 mm. Une silique contient environ 40-60 ovules et 3-4 siliques (c.-à-d., les ovules de 120-240) sont suffisants pour un seul appareil.</li>
	<li>Ouvrir la silique (paroi de l’ovaire) pour voir les ovules à l’intérieur à l’aide de l’aiguille stérilisée et pince à épiler sous un stéréomicroscope. Couper seulement la paroi de l’ovaire afin que les ovules ne sont pas endommagés.</li>
	<li>Transférer la silique ouvert dans le milieu de la N5T sur le périphérique PDMS (préparé à l’étape 2.7) et libérer les ovules dans le milieu avec l’aiguille ou pincettes.</li>
	<li>, Mettez une petite lamelle couvre-objet (18 x 18 mm) sur le dispositif PDMS pour pousser les ovules dans les espaces dans le tableau micropillar.</li>
	<li>Enlever le couvercle en verre en le tirant horizontalement à l’aide de pince à épiler ou avec les doigts pour éliminer le milieu extra.</li>
	<li>Retournez l’appareil PDMS, placez-le dans un plat de fond en verre de 35 mm et appuyez légèrement sur l’appareil en poussant à l’aide de la pince à épiler pointe carrée pour le coller sur la vitre.</li>
	<li>Milieu N5T versez doucement dans le fond en verre plat par décantation la bouteille moyenne jusqu'à ce que le dispositif PDMS est complètement trempé dans le milieu et sceller le plat avec le film de paraffine. 
	Remarque : Le dispositif PDMS peut être recyclé, mais les dispositifs qui sont trop vieux sont facilement enlevés le fond du verre. En outre, le périphérique peut flotter si elle n’est pas complètement dégazé dans étape 2.5 ou le milieu est coulé trop vite.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> figure 2 : Schéma procédure de préparation de l’échantillon. 
Ce flux schématique correspond aux étapes 3,5 à 4,1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
 4. décomposée Imaging <ol><li>Placer le plat de fond en verre qui a été préparé à l’étape 3.9 sur un microscope inversé et sélectionner les ovules convenables de se concentrer sur. 
	NOTE : Parce que les ovules varient dans le stade, la position et la direction, ovules adaptés devraient être trouvées en vérifiant leur fluorescence marqueur.</li>
	<li>Commencer le live d’image selon le fabricant &#39; s directives du système microscope. 
	Remarque : Les paramètres et le microscope appareils sont diverses, et ainsi, les utilisateurs doivent choisir les paramètres appropriés qui conviennent à l’objectif de l’expérience. À titre d’exemple, les paramètres utilisés dans ce manuscrit sont énumérés au tableau 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>équipement/réglage</td> de la <td>Figure 3 (A) et 1 de vidéos supplémentaires et 4</td> <td> Figure 3 (B) et 2 vidéo supplémentaire</td> <td>Supplemental vidéo 3</td></tr> <tr><td>Microscope</td> <td>à balayage laser microscope (A1R MP) inversé</td> <td>tourne disque confocal microscope inversé (CSU-W1)</td> <td> caisson inversé système de microscope confocal avec une chambre d’incubation stable (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>TI : Sapphire laser à impulsions femtosecondes</td> <td>488 nm et 561 nm laser LD</td> <td>488 nm et 561 nm laser LD</td></tr> <tr><td>O bjectif lentille</td> <td>40 X objectif à immersion dans l’eau (NA = 1.15) avec le milieu d’immersion</td> <td>60 X objectif d’immersion de l’huile silicone (NA = 1,30), monté sur un lecteur de focus Piezo</td> <td>40 X objectif (NA = 0,95)</td></tr> <tr><td>Detect ou</td> <td>externes non-descanned PMT GaAsP détecteur</td> <td>caméra EMCCD</td> <td>caméra EMCCD</td></tr> <tr><td>miroir dichroïque</td> <td>DM495 et DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>filtre</td> < td > passe-bande filtres ; 534/30 nm et 578/105 nm</td> <td>filtres passe-bande ; 520/35 nm et 593/46 nm</td> <td>filtres passe-bande ; 520/50 nm et 617/73 nm</td></tr> <tr><td>tranche le long de l’axe z</td> <td>z 31 - cheminées avec des intervalles de 1 µm</td> <td>inter 17 z-piles avec 3 µm Vals</td> <td>7 z-piles avec des intervalles de 5 µm</td></tr> <tr><td>intervalle de temps</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> tableau 1 : les Systèmes de microscope et paramètres utilisés dans ce manuscrit. 
Les microscopes et les paramètres sont diverses, et ainsi, chaque utilisateur doit choisir le système adéquat pour l’expérience.
<ol start="3"> <li>Vérifier la séquence d’images acquises et le convertir au format film générales, tels que .avi ou .mov pour présentation. 
	Remarque : Si le logiciel de microscope ne peut pas sortie les images comme un format de film, il est possible d’enregistrer les images sous .tif et puis ouvrez-les dans ImageJ, un programme open source inspiré par les NIH Image, changer le type de fichier. ImageJ est disponible à : https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ peut également être utilisé pour faire un Z-sTuck film, tels que la projection de l’intensité maximale, tel que décrit au : https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce manuscrit présente un simple in vitro ovule culture protocole qui est efficace pour une utilisation dans l’imagerie de cellules vivantes du développement des zygotes et des embryons.
La conception de l’appareil PDMS peut être nécessaire d’optimisation en fonction du stade de l’embryon. Le premier appareil développé était un tableau de microcage pour régler l’orientation et de fixer la position des ovules9, et ensuite un dispositif de micropillar a été constr...

Le plan de base du corps d’un organisme se développe à partir un zygote unicellulaire. Dans la plupart des usines fleurissantes, division zygotique génère une apicale et un baso-cellulaire, qui se développent dans les pousses et des racines, respectivement1. Par conséquent, il est important de comprendre comment le corps de la plante est formé au cours de l’embryogenèse, mais il n’a pas été un outil efficace d’observer directement la dynamique de vie zygotes et des embryons parce qu’ils développent profondément dans la fleur. Chez plusieurs espèces de monocotylédones, telles que le maïs et le riz, une méthode de fécondation in vitro a été établie2,3. Dans cette méthode, isolé des spermatozoïdes et ovules sont soudés électriquement ou chimiquement, et la cellule générée peut évoluer vers une plante fertile. Cependant, chez les plantes dicotylédones, il n’y a aucune méthode de fécondation in vitro qui peut produire des embryons correcte, sans doute en raison de l’état non synchronisé le cycle cellulaire des gamètes mâles et femelles4,5. En outre, le tissu qui entoure l’embryon (endosperme) joue un rôle important dans le développement embryonnaire6.
Dans une espèce de dicotylédones modèle, Arabidopsis, une méthode de culture in vitro a été développée en se concentrant sur l’ovule entier, qui contient l’embryon et l’endosperme7. Ce système a été utilisé avec succès pour analyser les effets de divers réactifs chimiques sur l’embryogenèse, mais il n’est pas adapté pour Time-lapse imagerie parce qu’il a un faible taux de survie. Par conséquent, un système d’élevage de l’ovule roman in vitro a été développé afin de commencer dès le stade du zygote et de produire des plantes fertiles à un ratio élevé8. Après divers essais, on a trouvé ce moyen de Nitsch et tréhalose a considérablement amélioré le taux de survie des ovules8. En outre, parce que l’ovule se développe comme il se développe et donc souvent s’éloigne du champ d’observation du microscope, un dispositif PDMS a été développé pour corriger l’ovule dans la moyenne de9. Le dispositif PDMS a permis l’imagerie à long terme pour les 3-4 jours, qui est suffisant pour suivre le développement d’un zygote à un embryon de coeur-scène. En utilisant cette méthode, il devient possible de visualiser la dynamique de la polarisation du zygote et de l’embryon le patterning, non seulement dans des conditions normales, mais également en présence d’inhibiteurs chimiques ou dans divers milieux mutant8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Figure 1 : Schéma des marqueurs fluorescents spécifiques permettant de visualiser des Zygotes et des embryons dans l’Ovule. L’Arabidopsis zygote se développe en embryon dans l’ovule, qui est généré à l’intérieur de la fleur. Dans ce système de culture in vitro , le zygote et les embryons sont observés par le biais de l’ovule, et il est donc important d’utiliser des marqueurs fluorescents spécifiques qui ne sont pas exprimées dans d’autres tissus de l’ovule. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch mélange de sels de base</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>tréhalose dihydraté</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg' solution vitaminique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>Plat à fond en verre de 35 mm</td><td>Matsunami Plat</td> de culture <td>en verre D111300</td><td></td></tr><tr><td>de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &times ; 26 mm verre diapositive</td><td>Matsunami Glass</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &times ; verre diapositive 18 mm</td><td>Matsunami Aiguille</td><td>C018181</td><td></td>en verre</tr><tr><td>(calibre 0,40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Immersion medium Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>Il s’agit d’un équipement personnalisé, et donc le numéro de catalogue n’est pas disponible.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Electrique</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du zygote polarisation et structuration d’embryon chez arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Dans la plupart des usines fleurissantes, le zygote et les embryons sont cachés profondément dans les tissus de la mère, et donc il a longtemps été un mystère de comment ils se développent dynamiquement ; par exemple, comment le zygote se polarise à établir l’axe du corps et comment l’embryon spécifie divers destins cellulaires au cours de la formation des organes. Ce manuscrit décrit une méthode in vitro ovule culture pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes du développement des zygotes et des embryons d’Arabidopsis thaliana. Le milieu de culture optimisé permet de zygotes ou jeunes embryons d’évoluer vers des plantes fertiles. En le combinant avec un dispositif de tableau de micropillar de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), l’ovule se tient dans le milieu liquide dans la même position. Cette fixation est cruciale d’observer l’ovule même sous un microscope pour plusieurs jours de la division zygotique à la fin du stade embryonnaire. L’imagerie de cellules vivantes qui en résulte peut être utilisé pour surveiller la dynamique en temps réel de la polarisation du zygote, tels que la migration nucléaire et réarrangement du cytosquelette et aussi le calendrier de la division cellulaire et la spécification sort des cellules au cours de la structuration de l’embryon. En outre, ce système de culture ovule peut être combiné avec des traitements d’inhibiteur pour analyser les effets de divers facteurs sur le développement de l’embryon et avec les manipulations optiques telles que des perturbations de laser d’examiner le rôle de la communication de cellule-cellule.

Grâce à ce système de culture ovule, cette méthode peut suivre la dynamique de la vie de polarisation du zygote et de structuration de l’embryon. Il s’agit d’une réalisation parce qu’auparavant il n’y avait aucune technique pour visualiser le comportement en temps réel le zygote et de l’embryon, qui sont cachés profondément dans les tissus de la mère. Figure 3 a et supplémentaire 1 vidéo montrent que les microtubules (MTs) dans le zygote jeun...

Ce manuscrit décrit une in vitro ovule méthode de culture qui permet l’imagerie de cellules vivantes des Arabidopsis zygotes et des embryons. Cette méthode est utilisée pour visualiser la dynamique intracellulaire au cours de la polarisation du zygote et la spécification des cellules sort dans le développement des embryons.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

L'objectif général de cette procédure est de permettre l'imagerie en temps réel de zygotes et d'embryons d'Arabidopsis afin de visualiser la dynamique de leur embryogenèse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement végétal concernant la manière dont l'asymétrie du zygote et la morphologie de l'embryon sont générées. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons suivre en direct la dynamique de la polarisation du zygote et du façonnement de l'embryon.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la préparation avec le dispositif de micropiliers et les ovules est difficile à expliquer par le texte seul. Pour préparer le dispositif en array de micropiliers en PDMS, coupez d'abord le dispositif afin qu'il s'adapte à une boîte de culture de 35 millimètres à fond en verre, puis stérilisez les faces supérieure et inférieure du dispositif par une exposition de 15 minutes aux rayons UV par face. Une fois toutes les faces stérilisées, transférez le dispositif en PDMS dans une nouvelle boîte de culture de 35 millimètres et ajoutez cinq à sept millilitres de milieu frais N5T dans la boîte, jusqu'à ce que le dispositif soit complètement immergé.Ensuite, placer la boîte dans une chambre à vide et réduire la pression en laissant l'appareil sous vide jusqu'à ce que tout l'air contenu dans l'appareil ait été remplacé par le milieu. Une fois que l'appareil a été dégazé, utiliser des pinces à embouts carrés pour tamponner l'appareil sur un morceau de papier essuie-tout afin d'éliminer tout excès de milieu sur les côtés et la partie inférieure. Puis placer l'appareil sur une lame de verre de 76 par 26 millimètres et le recouvrir d'un couvercle de boîte de culture de 35 millimètres pour maintenir l'appareil hydraté.Avant de commencer la dissection, stérilisez une aiguille de calibre 0,40 millimètre et une pince fine avec de l'éthanol à 70 pour cent. Ensuite, examinez l'inflorescence de la plante afin de sélectionner les siliques appropriées pour l'expérience. Les siliques d'environ cinq millimètres contiennent des zygotes, tandis que les siliques de huit à dix millimètres renferment de jeunes embryons globulaires.À l’aide de pinces, transférez trois à quatre siliques d’intérêt sur un morceau de ruban adhésif double face fixé sur une lame de verre de 76 par 26 millimètres. Placez ensuite la lame sous un microscope stéréo et utilisez l’aiguille et les pinces pour ouvrir les parois de l’ovaire. Transférez les siliques ouvertes sur le réseau de micropiliers du dispositif en PDMS et libérez les ovules dans le milieu.Ensuite, placez un coverslip de 18 sur 18 millimètres sur le dispositif pour enfoncer les ovules dans les espaces du réseau de micropiliers. Une fois les ovules en place, utilisez des pinces ou les doigts pour retirer horizontalement le coverslip du dispositif afin d'éliminer tout excès de milieu, puis placez le dispositif à l'envers dans une nouvelle boîte de 35 millimètres à fond en verre. Utilisez la pointe des pinces carrées pour appuyer légèrement sur le dispositif afin de le fixer au fond de la boîte, puis versez du milieu N5T frais dans la boîte jusqu'à ce que le dispositif soit complètement immergé.Ensuite, sceller la boîte avec du parafilm. Pour l'imagerie en laps de temps des ovules, transférer la boîte sur la platine d'un microscope inversé et utiliser la fluorescence du marqueur pour sélectionner les ovules à imager. Une fois les ovules optimaux localisés, commencer l'imagerie en direct des échantillons conformément aux recommandations du fabricant.Ce système de culture d'ovules permet de suivre les dynamiques vivantes de la polarisation du zygote et du modelage de l'embryon. Par exemple, ici, l'accumulation de microtubules sous forme d'un anneau transversal, suivie de leur organisation en un fuseau, peut être observée. Les cellules embryonnaires se divisent ensuite de manière quadrillée pour former une structure globulaire présentant une symétrie radiale.Toutefois, le traitement des ovules en culture avec un inhibiteur de la polymérisation de l'actine entrave la migration des noyaux polaires, entraînant une division plus symétrique du zygote et suggérant un rôle des filaments d'actine dans la polarisation du zygote. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, une disruption par laser peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le rôle de la communication cellule à cellule dans le modelage de l'embryon.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'observer les événements serrés durant l'embryogenèse.

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Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

L’objectif est d’illustrer que la légumineuse modèle Medicago truncatula peut être facilement utilisée pour étudier la régulation de l’embryogenèse précoce des plantes en complément du modèle Arabidopsis non légumineuse. La morphologie des gousses est liée aux stades de l’embryogenèse zygotique et un protocole de collecte d’embryons par culture tissulaire est également fourni.

Protocoles pour l&#39;obtention Zygotic et embryons somatiques pour l&#39;étude de la réglementation de développement précoce de l&#39;embryon dans la légumineuse modèle<em&gt; Medicago truncatula</em

Ce protocole décrit une méthode permettant d’observer l’embryogenèse chez Arabidopsis via clairance ovule, suivie par l’inspection de la formation embryonnaire sous un microscope.

Une méthode de caractérisation de l’embryogenèse chez Arabidopsis

Nous démontrons une méthode pour déterminer la fertilisation réussie ou échouée sur la base de la morphologie nucléaire de sperme dans la double fertilisation d'Arabidopsis utilisant un microscope d'épifluorescence.

Évaluation de l'état de fertilisation par la recherche de la morphologie nucléaire du sperme dans la double fécondation de l'arabidopsise

Ici, nous décrivons une amélioration de la méthode semi-in vitro (SIV) pour observer le guidage et la réception du tube pollinique chez Arabidopsis thaliana, ce qui augmente la réceptivité des ovules. La méthode SIV cum septum à haut débit peut être couplée à des lignées marqueurs gamétophytes et à des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller le processus dynamique de fécondation.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

Le mouvement des chromosomes au cours de la prophase méiotique est un phénomène mal compris qui est fondamental pour la formation des spores. Ce protocole décrit une méthode pour acquérir, analyser et quantifier les mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique chez les méiocytes mâles d’Arabidopsis thaliana .

Caractérisation par imagerie en direct des mouvements du centromère au cours de la prophase méiotique mâle chez Arabidopsis thaliana

Cet article décrit une méthodologie in vivo et in vitro pour caractériser les progéniteurs de sédimentation thymique par l’analyse de la cinétique de génération, du phénotype et du nombre de leur descendance de lymphocytes T.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Découvrez la culture in vitro d'ovules pour l'imagerie en cellules vivantes de la polarisation du zygote et du développement embryonnaire chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode permet de suivre les dynamiques cellulaires en temps réel.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana (Vidéo) | JoVE Journal

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

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