Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

L’objectif global de la fabrication de microcryogels macroporeux élastiques 3D à l’aide de la cryogélation est de faciliter la thérapie régénérative injectable et le criblage de médicaments in vitro à haut débit. Cette vidéo présente les protocoles permettant de fabriquer des microtissus 3D polyvalents et de les appliquer à la thérapie régénérative et au criblage de médicaments. La technique de thérapie régénérative améliore la rétention des cellules souches, la survie et les fonctions thérapeutiques après l’injection dans un site de plaie.

Le dépistage des drogues est également amélioré en raison de sa facilité d’utilisation et de son potentiel de dépistage à haut débit. En général, les personnes qui découvrent la culture 3D ont du mal à cause des protocoles compliqués. Cette technique simplifie la culture 3D et offre aux chercheurs un meilleur contrôle des microtissus 3D résultants.

Zhou Lyu, Liu Wei, Li Yaquian et You Zhifeng, quatre étudiants diplômés de notre laboratoire, aideront à la démonstration de ces procédures. Lavez les puces du réseau de micropochoirs en PMMA avec de l’eau déminéralisée pour éliminer les débris restants de la gravure laser. Ensuite, séchez les puces du réseau de micropochoirs à 60 degrés Celsius.

Ensuite, traitez les copeaux séchés dans un nettoyeur plasma par groupes de quatre. Tout d’abord, faites fonctionner la pompe à vide pendant deux minutes. Ensuite, utilisez 18 watts de puissance RF pendant trois minutes pour augmenter l’hydrophilie des puces.

Maintenant, préparez un millilitre de solution de précurseur de gélatine pour cinq chips. Dissoudre la gélatine dans un bain-marie à 60 degrés Celsius et incuber la solution sur de la glace pendant cinq minutes. Une fois légèrement refroidi mais toujours liquide, mélangez soigneusement le glutaraldéhyde dans la solution de précurseur de gélatine jusqu’à une concentration finale de 0,3 % de glutaraldéhyde.

Maintenant, pipetez 200 microlitres de solution préparée sur la surface supérieure de chaque puce. Répartissez la solution uniformément sur les copeaux à l’aide d’une tige de verre pliée. Ensuite, transférez immédiatement les puces de réseau chargées de solution dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius pendant 16 heures pour la cryogélation.

Le lendemain, refroidissez un lyophilisateur à moins 40 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Ensuite, chargez les puces du réseau et lyophilisez-les pendant deux heures sous vide. La glace se sublimera dans ces conditions, et les copeaux seront alors prêts à l’emploi.

Commencez par récolter des microcryogels individuels à partir des puces. Commencez par superposer la puce du réseau de microcryogel fabriquée sur le réseau de broches d’éjection PDMS fabriqué. Alignez chaque microcryogel à l’aide d’une goupille d’éjection.

Appuyez ensuite sur la puce du réseau de microcryogels dans le réseau pour déplacer les microcryogels de leurs puits. Maintenant, récoltez les microcryogels éjectés dans un bain d’eau et collectez-les à l’aide d’une passoire cellulaire. Utilisez une passoire pour collecter tous les microcryogels d’une seule puce.

Ensuite, lavez les microcryogels avec du borohydrure de sodium sur de la glace. Laissez tremper les résidus d’aldéhyde non réticulés pendant environ 20 minutes. Ensuite, jetez le borohydrure de sodium et lavez les microcryogels avec cinq millilitres d’eau déminéralisée pendant 15 minutes.

Effectuez un total de trois à cinq lavages à l’eau avant de continuer. Après avoir retiré les microcryogels du dernier lavage à l’eau, utilisez une pince à épiler pour les transférer de la crépine cellulaire dans une boîte de Pétri de 35 millimètres. Chaque collection de microcryogels constitue un cluster.

Maintenant, ajoutez 50 à 70 microlitres d’eau déminéralisée à chaque grappe de microcryogels et couvrez le plat. Ensuite, tapotez doucement le plat pour niveler les microcryogels empilés. Ensuite, congelez les microcryogels à moins 20 degrés Celsius pendant quatre à 16 heures.

Plus tard, lyophilisez-les pendant deux heures comme précédemment. L’étape suivante consiste à fabriquer les microtissus en 3D. Tout d’abord, stérilisez les microcryogels.

Ensuite, récoltez les cellules avec de la trypsine, quantifiez leur densité et mettez-les en suspension à huit millions de cellules par millilitre dans un milieu de croissance. Ensuite, pipetez 60 microlitres de suspension cellulaire sur chaque grappe de microcryogels. Conservez la vaisselle dans une chambre humidifiée et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant deux heures afin que les cellules soient absorbées par les gels.

Après l’incubation, ajoutez deux millilitres de milieu de culture dans chaque plat et continuez la culture en changeant de milieu tous les deux jours. Dans deux jours, des microtissus 3D se seront formés. Pour injecter les microtissus 3D dans une souris, transférez-les d’abord dans une pipette de cinq millilitres, puis chargez-les dans une passoire cellulaire pour filtrer le milieu de culture.

Ensuite, mettez en suspension les microtissus 3D dans une solution de gélatine à 15 %. Après avoir préparé l’animal à l’implantation, injectez par voie intramusculaire les microtissus à trois endroits du muscle gracilis. Chaque injection doit contenir 150 microcryogels dans 150 microlitres de solution.

Utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 23. Après avoir assemblé le réseau de microcryogel pour la culture cellulaire sur puce, placez-les soigneusement dans une chambre d’humidité préchauffée sans les mouiller. Ensuite, aliquote soigneusement trois microlitres de suspension cellulaire soigneusement mélangée directement sur chaque puits de microcryogel.

Laissez la pointe de la pipette toucher légèrement la surface du microcryogel avant d’expulser la solution. N’ensemencez pas les puits périphériques. Après avoir chargé les puits, ajoutez 10 microlitres de milieu sélectif dans chaque puits et ajoutez du milieu dans les puits périphériques pour ralentir l’évaporation à l’aide d’un distributeur de liquide à 96 canaux.

Ensuite, cultivez les puces dans la chambre d’humidité pendant 24 heures pour former des microtissus 3D. Le lendemain, à l’aide du distributeur de liquide à 96 canaux, ajoutez 10 microlitres de médicaments dans chaque puits selon un gradient de concentration quatre fois pour compléter l’addition des 384 puits, y compris les contrôles DMSO. Ensuite, continuez la culture pendant 24 heures.

Après 24 heures de traitement médicamenteux, ajoutez quatre microlitres de solution mère de résazurine dans chaque puits et incubez la plaque pendant deux heures, permettant aux cellules de métaboliser la résazurine. Pour tester le métabolisme cellulaire de la résazurine, utilisez un lecteur de plaques. Les microcryogels de gélatine récoltés avaient des formes et des tailles prédéfinies.

L’analyse par MEB a montré que les microcryogels contenaient des structures macroporeuses interconnectées avec des tailles de pores comprises entre 30 et 80 microns. L’injectabilité des microcryogels de gélatine a été évaluée quantitativement en les cultivant après l’injection. 1 000 par millilitre ont été injectés à six newtons de moins que la force cliniquement acceptable de 10 newtons.

Les cellules souches des microcryogels ont conservé une grande viabilité et une grande capacité de prolifération après l’injection pendant cinq jours de culture. À l’aide de ces cellules, le modèle d’ischémie des membres de la souris a été traité thérapeutiquement et l’état physiologique des membres ischémiques a été examiné 28 jours après l’opération. Le traitement des microtissus avec 100 000 cellules souches a amélioré le sauvetage des membres.

Seulement 25 % des souris ont présenté une amputation spontanée de l’orteil après 28 jours. Dans une autre application, le réseau de microtissus 3D a été utilisé pour les tests de médicaments à haut débit. Les cellules de carcinome hépatocellulaire ont été traitées avec de la doxorubicine et les cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules ont été traitées avec l’IMMLG-8439.

Dans les deux cas, la résistance aux médicaments a été augmentée par la culture 3D. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication de microcryogels microporeux 3D élastiques pour la culture 3D hors puce à l’aide d’une thérapie régénérative injectable ou de réseaux de culture cellulaire 3D sur puce pour le criblage de médicaments à haut débit in vitro. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie régénérative cellulaire et du criblage de médicaments, pour utiliser la culture cellulaire 3D, faisant ainsi progresser les deux domaines de recherche.

N’oubliez pas que travailler avec du glutaraldéhyde et du borohydrure de sodium peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de vêtements de protection appropriés et le travail sous une cagoule de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.