Name: Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Découvrez la formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon. Cette méthode permet de produire des granulés pour la modélisation de maladies et le dépistage de médicaments.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du projet de R &amp; D en matière de technologie de la santé de Corée, Ministère de la santé, du bien-être et de la famille, République de Corée (HI16C2177).

Ce protocole a été approuvé par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université catholique de Corée (KC12TISI0861). Les CBMC utilisés pour la reprogrammation ont été obtenus directement de la banque de sang de cordon de l&#39;hôpital St. Mary&#39;s de Seoul. 1. Différenciation chondrogénique des iPSC <ol><li> Production CBMC-iPSC <ol><li> Générer des CBMC-hiPSC en utilisant le protocole montré dans nos travaux antérieurs 23 . </li><li> Recueillir les globules sanguins dans un tube conique de 15 ml et les compter en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Préparer 3 x 10 5 cellules et centrifuger pendant 5 min à 515 xg et RT. Jeter le surnageant par aspiration et ré-endiguer les cellules dans 0,5 ml de milieu sanguin. </li><li> Transférer les cellules dans un puits d&#39;une plaque non-revêtue à 24 puits et ajouter le mélange de virus Sendai, en suivant les recommandations du fabricant. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 30 min à 1.150 xg et 30 ° C. </li><li> En arrièreEr centrifugation, incuber les cellules pendant une nuit (O / N) à 37 ° C dans 5% de CO 2 . </li><li> Le lendemain, transférez les cellules transduites vers un puits revêtu de matrice. Centrifuger la plaque à 1 150 xg pendant 30 min à 30 ° C. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant, ajouter 1 mL de milieu iPSC et maintenir les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO 2 . </li><li> Maintenir les cellules attachées à 37 ° C et 5% de CO 2 . Changez le support tous les jours, en le remplaçant par un support iPSC frais. NOTE: Les colonies apparaîtront au jour 14-21 après la transduction. </li></ol></li><li> Génération EB <ol><li> Maintenir les hiPSC à 37 ° C et 5% de CO 2 . Changez le milieu tous les jours, en le remplaçant par du Essential Essential 8 (E8) moyen. </li><li> Préparez 2 x 10 6 hiPSC dans un plat 100 mm en revêtement de vitronectine en milieu E8. </li><li> Retirer le milieu E8 du plat de culture et laver avec une solution salée tamponnée au phosphate stérile (PBS). </li><li> Ajouter 1Ml d&#39;acide éthylènediaminetétracétique 1 mM (EDTA) et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 min. </li><li> Récoltez les cellules avec 3 ml de milieu E8 et transférez-les à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 xg à température ambiante (RT) pendant 2 min. </li><li> Aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire et ré-endiguer les cellules dans 5 ml de milieu E8. </li><li> Comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre et préparez 2 x 10 6 cellules pour chaque boîte de Petri de 100 mm. Remettre en suspension les cellules préparées dans un mélange de 10 ml de milieu E8 et EB (1: 1) avec un inhibiteur de la kinase associée au rho 10 μM (ROCK). </li><li> Incuber les cellules O / N pour l&#39;agrégation à 37 ° C et 5% de CO 2 . </li><li> Le lendemain, récoltez les EB agrégées par pipettage. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 1 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension les EB dans 10 ml de milieu E8 frais. </li><li> Agrandir les EB générés pendant 5 jours, effectuer des changements quotidiens avec fresH E8 moyen. Pour une maturation supplémentaire, changer le milieu de culture en milieu E7. Maintenir les EB à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 jours supplémentaires, en effectuant des modifications quotidiennes moyennes avec du moyen E7 frais. REMARQUE: Le support E7 est E8 moyen sans FGF2. </li></ol></li><li> Induction des cellules de décrochage des EB <ol><li> Ajouter 6 ml de gélatine à 1% dans un plat 100 mm et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 min. </li><li> Retirez la gélatine et séchez complètement le plat pendant 2-3 h avant utilisation. </li><li> Transférer les EB à un tube conique de 50 ml. Permettre aux EB de s&#39;installer au bas du tube conique. Retirer le surnageant sans déranger les EB. </li><li> Remettre en suspension les EB dans 10 mL de milieu de Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS). Transférer les EB sur le plat en gelée et 100 mm. Ajouter 10 μM ROCK inhibiteur. </li><li> Incuber et maintenir les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 7 jours. Change le thèmeTous les deux jours sans addition d&#39;inhibiteur de ROCK. </li></ol></li><li> Formation de culot chromatographique <ol><li> Aspirer le milieu de culture du plat et laver les cellules trois fois avec du PBS. </li><li> Appliquer 1 mL d&#39;EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 min. </li><li> Récoltez les cellules en utilisant 5 mL de DMEM avec 20% de FBS et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 mL. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 2 min à 250 xg et RT. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 10 mL de DMEM avec 20% de FBS. </li><li> Filtrer et jeter les grappes cellulaires en utilisant une crépine cellulaire de 40 μm et récolter les cellules individuelles. Comptez les cellules individuelles à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 2 min à 250 xg et RT. Retirer le surnageant et semer 3 x 10 5 cellules par pellet dans un tube conique de 15 ml avec 300 μL de milieu de différenciation chondrogénique (MDP). </li><li> Pour la formation de pastilles, centrifuger les cellules pendant 5 min à680 xg et RT. REMARQUE: Les granulés sont maintenus dans des tubes coniques de 15 mL lors de la différenciation des pastilles chondrogéniques. </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2 . </li><li> Changez le MDP tous les 2-3 jours. Dans les 3 jours, les granulés présenteront des morphologies sphéroïdales aplaties. Maintenir les pastilles pendant 21 jours à 37 ° C et 5% de CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. Caractérisation des granulés chondrogéniques par coloration <ol><li> Incorporation chondrogénique <ol><li> Avant d&#39;incorporer, préparer et faire fondre la paraffine à 58 ° C. </li><li> Fixer les pastilles dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4% pendant 2 h à la température ambiante dans un tube de 1,5 ml. Attention: le paraformaldéhyde est très toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l&#39;exposition et éviter l&#39;inhalation tout en la préparant. </li><li> Placez une couche de gaze sur la cassette et transférez les pastilles fixes à l&#39;aide d&#39;une pipette. Couvrir la pastille en pliantÉgentez et fermez le couvercle de la cassette. </li><li> Initier la déshydratation dans 100 ml d&#39;éthanol à 70% (EtOH) deux fois, 10 min chacun. Déhydrate les pastilles à travers des lavages séquentiels de 10 minutes dans 80% et 95% d&#39;EtOH. </li><li> Transférer les pastilles à 100% d&#39;EtOH pendant 10 min. Répétez trois fois avec de l&#39;EtOH frais. </li><li> Pour &quot;nettoyer&quot;, échanger la solution pour un mélange 100 mL, 1: 1 d&#39;EtOH et de xylene, suivi d&#39;un mélange 1: 2 d&#39;EtOH et de xylène pendant 10 minutes chacun. Effacer l&#39;EtOH restant en incubant les pastilles deux fois dans 100% de xylene, 10 min chacun. </li><li> Pour l&#39;infiltration de paraffine, incuber les pastilles dans des mélanges de xylène et de paraffine séquentiels. Effectuer l&#39;ensemble du processus d&#39;infiltration de paraffine à 58 ° C. Incuber les pastilles dans 100 ml d&#39;un mélange 2: 1 de xylène et de paraffine pendant 30 minutes. </li><li> Échangez la solution pour 100 ml d&#39;un mélange 1: 1 de xylène et de paraffine et incuberez pendant 30 min. </li><li> Échangez la solution pour 100 ml d&#39;un mélange 1: 2 de xylène et de paraffine et incuberez pendant 30 min. </li><li> Pour l&#39;infiltration finale, transférer les pastilles au premier bain de 100% de paraffine et incuber pendant 2 h. </li><li> Transférer les pastilles au deuxième bain de 100% de paraffine et incuber O / N à 58 ° C. </li><li> Le lendemain, transférez doucement les pastilles à un moule à l&#39;aide d&#39;une pince. Ajouter de la paraffine au moule du distributeur de paraffine. Solidifier la paraffine pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Coupez les sections à 7 μm et transférez les sections sur la glissière. Laissez les diapositives sécher pendant la nuit et rangez les diapositives à la température ambiante jusqu&#39;à ce qu&#39;elles soient prêtes à l&#39;emploi. </li></ol></li><li> Préparation de la diapositive <ol><li> Déparaffiner les diapositives en les déplaçant à travers 100 mL de 100%, 90%, 80% et 70% d&#39;EtOH séquentiellement pendant 5 min chacun. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l&#39;eau du robinet pendant 5 min. </li></ol></li><li> Coloration bleue Alcian <ol><li> Incuber les glissières dans 50 ml d&#39;une solution de bleu alice à 1% pendant 30 minutes. NE PASE: Le bleu Alcian est dilué dans une solution à 3% d&#39;acide acétique. Ajuster le pH à 2,5 en utilisant de l&#39;acide acétique. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l&#39;eau du robinet pendant 2 min. </li><li> Rincer les lames dans de l&#39;eau déminéralisée (DW) et contraster avec une solution nucléaire rapide et rouge pendant 2 min. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et rincer à l&#39;eau du robinet pendant 1 min. </li><li> 2.3.5) Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l&#39;étape 2.6. </li></ol></li><li> Teinture de bleu de toluidine <ol><li> Incuber des lames dans 50 ml de solution de bleu de toluidine pendant 4 min. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l&#39;eau du robinet pendant 5 min. </li><li> Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l&#39;étape 2.6. </li></ol></li><li> Coloration immunohistochimique <ol><li> Incuber les diapositives dans 3% de H 2 O 2 pendant 15 minutes pour le blocage de peroxydase endogène. </li><li> Appliquer 200 μl d&#39;anticorps primaire (anti-COL1A1 et -COL2A1) dilué 1: 100 en tris-bu(TBS) contenant 1% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 5% de sérum de chèvre normal (NGS) aux lames et incuber à O / N à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, placez les diapositives dans un pot en verre et lavez-les avec 50 ml de TBS contenant 0,1% de polysorbate 20 (TBST) trois fois pendant 5 min chacun. </li><li> Appliquer 200 μl d&#39;anticorps secondaire (anticorps IgG anti-lapin de chèvre, dilué 1: 200 dans du TBS contenant 1% de BSA et 5% de NGS) aux diapositives et incuber à TA pendant 40 min. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et lavez-les trois fois avec 50 mL, 5 minutes chacune. </li><li> Pour l&#39;amplification du signal, appliquer une solution de streptavidine conjugue HRP aux lames et incuber pendant 10 min. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et lavez-les trois fois avec 50 mL, 5 minutes chacune. </li><li> Mélanger la solution de substrat DAB-peroxydase, appliquer 200 μL de solution à chaque diapositive et incuber pendant 1 min. </li><li> Placez les glissières dans un pot en verre et rincez avec de l&#39;eau du robinet pendant 5 min. </li><li> CounterstainAvec l&#39;hématoxyline de Mayer pendant 1 min. </li><li> Lavez les diapositives avec DW. </li><li> Procédez pour déshydrater et montez les diapositives à l&#39;étape 2.6. </li></ol></li><li> Déshydratation et montage <ol><li> Déshydratez les diapositives en les déplaçant séquentiellement dans 100 mL de 70%, 80%, 90% et 100% d&#39;EtOH, 30 s chacun. </li><li> Trempez les diapositives en deux changements de xylène pendant 1 min chacun. </li><li> Ajoutez 50 μL de solution de montage aux lamelles et placez les diapositives sur le dessus. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole a généré avec succès des hiPSC à partir de CBMC. Nous avons reprogrammé les CBMC aux hiPSC en utilisant un vecteur viral Sendai contenant des facteurs Yamanaka 24 . Trois cas ont été utilisés en différenciation, et toutes les expériences ont généré avec succès des granulés chondrogéniques avec ce protocole. De nombreuses études ont rapporté des protocoles pour la différenciation des hiPSC en chondrocytes 25 , 26 , ...

L&#39;utilisation de hiPSCs représente une nouvelle stratégie pour le dépistage de drogue et les études mécanistes de diverses maladies. Du point de vue de la régénération, les hiPSC sont également une source potentielle de remplacement des tissus endommagés qui ont une capacité de guérison limitée, comme le cartilage articulaire 1 , 2 . La régénération du cartilage articulaire natif a été un défi depuis plusieurs décennies. Le cartilage articulaire est un tissu doux et blanc qui recouvre la fin des os, les protégeant des frottements. Cependant, il a une capacité de régénération limitée lorsqu&#39;il est endommagé, ce qui rend l&#39;auto-réparation presque impossible. Par conséquent, la recherche axée sur la régénération du cartilage est en cours depuis plusieurs décennies. Auparavant, la différenciation in vitro dans la lignée chondrogénique était habituellement réalisée avec des BMSC ou des chondrocytes indigènes isolés de l&#39;articulation du genou 3 . Due tO leur potentiel de chondrogenic, BMSC et chondrocytes indigènes ont de nombreux mérites soutenant leur utilisation dans la chondrogénèse. Cependant, en raison de leur expansion limitée et de leur phénotype instable, ces cellules sont confrontées à plusieurs limitations dans la reconstruction des défauts du cartilage articulaire. Dans des conditions de culture in vitro , ces cellules ont tendance à perdre leurs propres caractéristiques après 3 à 4 passages, ce qui finit par affecter leurs capacités de différenciation 4 . En outre, dans le cas des chondrocytes indigènes, des dommages supplémentaires à l&#39;articulation du genou sont inévitables lors de l&#39;obtention de ces cellules. Contrairement aux BMSC ou aux chondrocytes indigènes, les hiPSC peuvent se développer indéfiniment in vitro . Avec les conditions de culture appropriées, les hiPSC ont un grand potentiel en tant que source de remplacement pour la différenciation chondrogénique. Cependant, il est difficile de modifier les caractéristiques intrinsèques des hiPSC 5 . En outre, il faut plusieurs essais in vitro compliqués.Ps pour diriger le sort des hiPSC vers un type de cellule spécifique. Malgré ces complications, l&#39;utilisation de hiPSC est toujours recommandée en raison de leur capacité d&#39;auto-renouvellement élevé et de leur capacité à se différencier en cellules ciblées, y compris les chondrocytes 6 . La différenciation chondrogénique est généralement effectuée avec des systèmes de culture tridimensionnels, tels que la culture de pastilles ou la culture de micromasses, en utilisant des cellules progénitrices de type MSC. Si vous utilisez le système HiPSC, le protocole pour générer des cellules progénitrices MSC diffère des protocoles existants. Certains groupes utilisent une culture monocouche de hiPSC pour convertir directement le phénotype en cellules MSC 7 . Cependant, la plupart des études utilisent les EB pour générer des cellules secondaires qui ressemblent aux MSC 8 , 9 , 10 , 11 . Différents types de facteurs de croissance sont utilisés pour induire ChondrogeNesis. Habituellement, les protéines de famille BMP et TGFβ sont utilisées, seules ou en combinaison. La différenciation a également été induite avec d&#39;autres facteurs, tels que GDF5, FGF2 et IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . On a montré que le TGFß1 stimule la chondrogénèse de manière dose-dépendante dans les MSC 16 . Par rapport à l&#39;autre isotype, le TGFβ3, le TGFß1 induit une chondrogénèse en augmentant la condensation de la cellule mésenchymateuse pré-cartilagineuse. Le TGFβ3 induit la chondrogénèse en augmentant significativement la prolifération des cellules mésenchymateuses 17 . Cependant, le TGFβ3 est utilisé plus fréquemment par les chercheurs que TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 améliore l&#39;expression de gènes liés aux composants de la matrice chondrogénique chez l&#39;hommeChondrocytes articulaires dans des conditions in vitro 20 . BMP2 augmente l&#39;expression de gènes critiques pour la formation de cartilage dans les MSC en combinaison avec des protéines TGFβ 21 . Il a également été démontré que BMP2 améliore de manière synergique l&#39;effet du TGFβ3 par les voies Smad et MAPK 22 . Dans cette étude, les CBMC-hiPSC ont été agrégés en EB en utilisant du milieu EB dans une boîte de Petri à faible fixation. Les cellules de dépassement ont été induites en fixant les EB à un plat revêtu de gélatine. La différenciation chondrogénique à l&#39;aide de cellules secondaires a été réalisée par culture de pastilles. Le traitement à la fois avec le BMP2 et le TGFß3 a condensé avec succès les cellules et a induit une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) pour la formation de granules chondrogéniques. Cette étude suggère un protocole de différenciation chondrogénique simple mais efficace utilisant CBMC-hiPSCs.

<table><tbody><tr><td>Plat Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Cornical Tube</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipette jetable</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette jetable</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 12 puits</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Description</td></tr><tr><td>E8 Matériaux moyens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (Conc. : 543 &mu ; g/mL)</td></tr><tr><td>Sodium Selenite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Moyen&nbsp ; (Conc. : 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Moyenne humaine Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 (Conc. : 10,7 &mu ; g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medium&nbsp ; (Conc. : 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (Conc. : 20 &mu ; g/mL)</td></tr><tr><td>TGF humain&bêta ; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (Conc. : 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medium&nbsp ; (Conc. : 64 &mu ; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Description</td></tr><tr><td>Quality Control Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Cover Glass</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Vecteur Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SSEA4 Anticorps</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4 Anticorps</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRA-1-60 Anticorps</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG (H+L) Anticorps</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Sonde moléculaire</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonde moléculaire</td> <td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti-décoloration Prolong gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Vecteur Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagène II</td><td>anticorps abcam&nbsp ;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Bleu Alcian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vert Rapide FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nucléaire rouge</td><td>américain mastertech</td><td>STNFR100</td><td></td></tr><tr><td>xylène</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline de Mayer</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Lame de verre, revêtue</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand kit de synthèse d’ADNc</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td> Description</td></tr><tr><td>Matériaux de différenciation chondrogéniques</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Composant du milieu chondrogénique (500 mL)</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. : 1 %)</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Composant du milieu chondrogène (Conc. : 64 &mu ; g/mL)&nbsp ;</td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. : 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. :100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Hman recombinant TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>Composant du milieu chondrogène (Conc. : 10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. : 1 %)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Composant du milieu chondrogène (Conc. : 1 %)</td></tr><tr><td>Dexaméthasone-Soluble dans l’eau&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. :10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. : 1 %)</td></tr><tr><td>Solution de pyruvate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>Composant du milieu chondrogénique (Conc. : 1 %)</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Milieu chondrogénique composant (40 &mu ; g/ml)</td></tr></tbody></table>

formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Le cartilage articulaire humain n&#39;a pas la capacité de se réparer. La dégénérescence du cartilage est donc traitée non par traitement curatif mais par des traitements conservateurs. Actuellement, des efforts sont déployés pour régénérer le cartilage endommagé avec des chondrocytes expansés ex vivo ou des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la viabilité et l&#39;instabilité restreintes de ces cellules limitent leur application dans la reconstruction du cartilage. Les cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme (hiPSC) ont reçu l&#39;attention scientifique comme nouvelle alternative pour les applications regénératives. Avec une capacité d&#39;auto-renouvellement illimitée et multipotence, les hiPSC ont été mis en évidence comme une nouvelle source de cellules de remplacement pour la réparation du cartilage. Cependant, l&#39;obtention d&#39;une quantité élevée de granulés chondrogéniques de haute qualité est un défi majeur pour leur application clinique. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules de descendance dérivées du corps embryoïde (EB) pour la différenciation chondrogénique. Une chondrogénèse réussie a été confirmée par PCR etD coloration avec bleu alcian, bleu de toluidine et anticorps contre les collagènes types I et II (COL1A1 et COL2A1, respectivement). Nous fournissons une méthode détaillée pour la différenciation des iPSC à base de cellules mononucléaires du sang du cordon de cordon (CBMC-hiPSC) en pastilles chondrogéniques.

Dans cette étude, nous avons généré des granulés chondrogéniques provenant de CBMC-hiPSC en induisant des cellules secondaires des EB. La différenciation chondrogénique a été induite par CBMC-hiPSC avec une forte pluripotence confirmée 11 . Un schéma simple de notre protocole est illustré à la figure 1A . Avant la différenciation, les colonies iPSC ont été développées ( figure 1B ). Les iPSC développés on...

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l&#39;omble.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des pelotons chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites dérivées du sang de cordon. Grâce à ce protocole, nous pouvons produire une quantité relativement importante de pelotons chondrogéniques. Les pelotons chondrogéniques obtenus peuvent être utilisés pour des études ou la modélisation de maladies, le criblage de médicaments, et aider les chercheurs à progresser vers de nouvelles thérapies afin d'approfondir notre compréhension de la nature du cartilage.Le cartilage humain a une capacité limitée à se réparer. Par conséquent, la dégénérescence du cartilage doit être traitée par un traitement conservateur. Grâce à leur capacité illimitée à s'auto-renouveler et à leur pluripotence, les cellules souches induites humaines (iPSC) ont été mises en avant comme une nouvelle source de cellules de remplacement pour la réparation du cartilage.Le déroulement de la procédure sera assuré par Eugene Nam et Arie Alice Ream, étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer le protocole, recueillir les cellules sanguines dans un tube conique de 15 millilitres et les compter à l’aide d’un hémocytomètre. Préparer trois fois 10 à la puissance 5 cellules et centrifuger pendant cinq minutes à 515 ×g à température ambiante.Éliminer le surnageant par aspiration et resuspendre les cellules dans 0,5 millilitre de milieu pour cellules sanguines. Ensuite, transférer les cellules dans un puits d'une plaque 24 puits non revêtue et ajouter le mélange de virus Sendai selon les recommandations du fabricant. Centrifuger la plaque pendant 30 minutes à 1 150 × g et à 30 degrés Celsius.Après la centrifugation, incuber les cellules toute la nuit. Le jour suivant, transférer les cellules du transsudat vers un puits codé matriciel. Centrifuger la plaque.Après la centrifugation, retirez le surnageant, ajoutez un millilitre de milieu pour iPSC et maintenez les cellules. Changez le milieu quotidiennement et remplacez-le par du milieu pour iPSC frais. Maintenez les cellules souches pluripotentes induites humaines, ou HIPSCs.Changer le milieu quotidiennement en le remplaçant par du milieu essentiel huit, ou milieu E8. Préparer deux fois 10 à la puissance 6 HIPSCs dans un milieu E8 de 100 millilitres contenant de la vitronectine. Ensuite, retirer le milieu E8 de la boîte de culture et laver les cellules avec du chlorure de sodium tamponné au phosphate stérile, ou PBS.Ajouter un millilitre d’EDTA à une concentration de un millimolaire et incuber la boîte pendant deux minutes. Ensuite, récolter les cellules avec trois millilitres de milieu E8, puis les transférer dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 250 ×g à température ambiante pendant deux minutes.Aspirez le surnageant sans perturber le culot cellulaire, puis resuspendez les cellules dans cinq millilitres de milieu E8. Après avoir dénombré les cellules à l’aide d’un hématimètre, préparez deux fois 10 puissance 6 cellules pour chaque boîte de Pétri de 100 millimètres. Resuspendez les cellules préparées dans 10 millilitres d’un mélange un pour un de milieu E8 et de milieu EB, contenant 10 micromolaire d’inhibiteur de la kinase associée à Rho, ou inhibiteur ROCK.Incuber les cellules toute la nuit pour favoriser l'agrégation. Le jour suivant, récolter les embryocorps agrégés par pipetage. Éliminer le surnageant et resuspendre les embryocorps dans 10 millilitres de milieu E8 frais.Agrandissez les EB générés pendant cinq jours, en effectuant des changements quotidiens avec du milieu E8 frais. Pour une maturation supplémentaire, remplacez le milieu de culture par du milieu E7. Maintenez les EB à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq jours supplémentaires, en effectuant des changements quotidiens de milieu avec du milieu E7 frais.Ajoutez six millilitres de gélatine à 1 % dans une boîte de 100 millimètres et incubez la boîte pendant 30 minutes. Retirez la gélatine et faites sécher complètement cette boîte pendant deux à trois heures avant utilisation. Transférez les EB dans un tube conique de 50 millilitres.Laisser les corps embryonnaires (EB) se déposer au fond du tube conique. Retirer le surnageant sans perturber les EB. Ensuite, resuspendre les EB dans 10 millilitres de milieu modifié de Eagle (DMEM) préalablement réchauffé, ou DMEM, contenant 20 % de sérum bovin fœtal, ou FBS.Transférez les EB dans la boîte de 100 millimètres revêtue de gélatine. Ajoutez 10 micromolaire d'inhibiteur de ROCK. Incubez et maintenez les cellules pendant sept jours.Changer le milieu tous les deux jours sans ajouter d'inhibiteur de rock. Aspirer le milieu de culture de la boîte. Appliquer immédiatement un millilitre d'EDTA à un millimolaire sur la boîte et incuber les cellules pendant deux minutes.Ensuite, récoltez les cellules en utilisant cinq millilitres de DMEM contenant 20 % de FBS, puis transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifugez les cellules pendant deux minutes à 250 × g, à température ambiante. Éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 10 millilitres de DMEM contenant 20 % de FBS.Filtrez et éliminez les agrégats cellulaires à l’aide d’un tamis cellulaire de 40 micromètres, puis récoltez les cellules isolées. Comptez les cellules isolées à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez les cellules.Éliminer le surnageant et ensemencer trois fois 10 puissance 5 cellules par culot dans un tube conique de 15 millilitres avec 300 microlitres de milieu de différenciation chondrogénique, ou CDM. Pour la formation des culots, centrifuger les cellules, puis les incuber toute la nuit. En trois jours, les culots présenteront des morphologies sphéroïdales aplaties.Conserver les culots pendant 21 jours. Avant l'inclusion, préparer et faire fondre la paraffine à 58 degrés Celsius. Fixer les culots dans un millilitre de paraformaldéhyde à 4 % pendant deux heures à température ambiante dans un tube de 1,5 millilitre.Placer une couche de gaze dans la cassette et transférer les pastilles fixées à l’aide d’une pipette. Recouvrir la pastille en repliant la gaze et en fermant le couvercle de la cassette. Commencer la déshydratation dans 100 millilitres d’éthanol à 70 %.Déshydrater les culots par des lavages successifs avec de l'éthanol à 80 % et à 95 %. Transférer les culots dans de l'éthanol à 100 % pendant 10 minutes. Pour la clarification, remplacer la solution par un mélange éthanol-xylène (1:1) de 100 millilitres pendant 10 minutes.Ensuite, remplacer la solution un pour un par un mélange un pour deux d'éthanol et de xylène pendant 10 minutes. Éliminer l'éthanol résiduel en incubant les culots dans du xylène à 100 %. Pour l'infiltration de paraffine, incuber les culots dans des mélanges successifs de xylène et de paraffine.Réaliser l'ensemble du processus d'infiltration à la paraffine à 58 degrés Celsius. Incuber les pastilles dans 100 millilitres d'un mélange de xylène et de paraffine en proportion de deux pour un pendant 30 minutes. Ensuite, remplacer la solution par 100 millilitres d'un mélange de xylène et de paraffine en proportion un pour un et incuber pendant 30 minutes.Ensuite, remplacer la solution par 100 millilitres d'un mélange un à deux de xylène et de paraffine et incuber pendant 30 minutes. Pour l'infiltration finale, transférer les culots dans le premier bain de paraffine à 100 % et incuber le culot pendant deux heures. Transférer les culots dans le second bain de paraffine à 100 % et incuber toute la nuit à 58 degrés Celsius.Le lendemain, utilisez des pinces pour transférer délicatement les pastilles dans un moule. Ajoutez de la paraffine dans le moule à l’aide du distributeur de paraffine. Solidifiez la paraffine pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Sectionner les échantillons à sept micromètres et transférer les sections sur la lame. Laisser les lames sécher toute la nuit, puis les conserver à température ambiante jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à être utilisées. Avant la différenciation, les colonies de CIP ont été agrandies.Les iPSCs expansées ont été assemblées sous forme de corps embryonnaires (EB) pour initier la différenciation. Les EB générés ont été fixés sur des boîtes revêtues de gélatine afin d'induire des cellules en expansion. Après 21 jours de différenciation, de petits agrégats sphériques de type chondrogénique ont été obtenus et utilisés pour une caractérisation ultérieure.La qualité des pellets chondrogéniques a été évaluée histologiquement au jour 21, les pellets chondrogéniques de BMSC étant utilisés comme témoin positif. L'accumulation de protéines de la matrice extracellulaire sécrétées par les chondrocytes différenciés a été confirmée par la coloration au bleu d'Alcian et au bleu de Toluidine. Les pellets chondrogéniques issus des CDMC HIPSCs exprimaient une quantité plus élevée de COL2A1 que ceux dérivés des CBMSC HIPSCs.L'expression du collagène de type I, un marqueur du cartilage fibrotique, était plus faible dans les pelotons dérivés de CBMC HIPSC par rapport à l'expression de COL2A1. L'expression génique des protéines de la matrice extracellulaire cartilagineuse dans les pelotons chondrogéniques du jour 21 a été confirmée par PCR en temps réel. L'expression de l'aggrecane dans les pelotons dérivés de CBMC HIPSC était similaire à celle des pelotons dérivés de BMSC.Nous avons fourni une méthode détaillée pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dérivées de cellules mononucléées du sang de cordon en pelotons chondrogéniques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux mois si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de générer des pelotons chondrogéniques à partir d’iPSC.

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Research

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

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