Imagerie de cellules vivantes des cellules fongiques d’enquêter sur les Modes d’entrée et de la localisation sous-cellulaire des défensines plante antifongique

Plante défensines jouent un rôle important dans la défense de la plante contre les agents pathogènes. Pour une utilisation efficace de ces peptides antifungal agents antifongiques, comprendre leurs modes d’action (PA) est critique. Ici, une méthode d’imagerie de cellules vivantes est décrite afin d’étudier les aspects essentiels du ministère de l’agriculture de ces peptides.

L’objectif global de cette méthode d’imagerie de cellules vivantes est d’étudier des aspects critiques des mécanismes d’action des défensines végétales antifongiques dans les cellules fongiques. Avec l’avènement des techniques avancées de microscopie confocale, l’imagerie des cellules vivantes est devenue un outil puissant pour étudier les modes d’action des défensines végétales antifongiques. En utilisant cette technologie, nous présentons ici une méthode pour aider à répondre à une question clé dans la compréhension des modes d’action des défensines végétales antifongiques.

Nous nous concentrons sur la façon dont ces peptides sont internalisés dans les cellules fongiques et sur la façon dont ces peptides sont localisés dans les organites cellulaires ou diffusés dans le cytoplasme. Pour faire une suspension conidiale de la souche PH-1 de Fusarium graminearum, mettez d’abord en place des cultures de la souche sur des plaques contenant un milieu complet. Cultivez-les à 28 degrés Celsius pendant cinq jours.

Pour produire des conidies, inoculez quatre bouchons de 10 millimètres de diamètre de la culture de cinq jours dans 50 millilitres de milieu de carboxyméthylcellulose. Cultivez ces bouchons pendant quatre à sept jours à 28 degrés Celsius sur un agitateur rotatif réglé à 180 tr/min. Lorsque les cultures ont une couleur rouge, les conidies se sont formées.

Pour recueillir les conidies en suspension, vortex la culture liquide et filtrez un millilitre de celle-ci à travers deux couches de matériau filtrant, dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Centrifugez la suspension pendant deux minutes et jetez le surnageant. Ensuite, lavez la pastille avec un millilitre d’eau stérile et répétez la centrifugation.

Ensuite, remettez le granulé en suspension dans un millilitre de 2x SFM. Ensuite, comptez les conidies à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la densité de la suspension à 100 000 conidies par millilitre. Pour fabriquer une suspension conidiale de Neurospora crassa, transférez les conidies des cultures mères dans un tube oblique contenant un milieu gélosé de Vogel, et incubez les tubes à température ambiante sous une lumière constante pendant cinq jours.

Après cinq jours, transférez une petite quantité de culture en croissance, à l’aide d’une boucle d’inoculation, dans un tube de microcentrifugation contenant deux millilitres de milieu liquide de Vogel. Assurez-vous de mélanger les conidies hors de la boucle. Ensuite, filtrez la suspension, centrifugez-la et remettez en suspension la pastille de conidies dans le milieu de Vogel sans étape de lavage.

Enfin, ajustez la suspension finale à 100 000 conidies par millilitre. Pour préparer les germes pour la microscopie confocale, pipetez 50 microlitres de suspension de conidies dans une boîte de culture de 35 millimètres, et laissez les conidies germer pendant trois à six heures à température ambiante. Pour la microscopie confocale, pipetez 50 microlitres de suspension conidiale dans un micropuits de 10 millimètres d’une boîte à fond de verre.

Ensuite, à la concentration inhibitrice minimale prédéterminée, ajoutez 50 microlitres de défensines marquées par fluorescence à la suspension et incubez les conidies avec les défensines marquées pendant 2,5 heures à température ambiante. Après l’incubation, ajoutez deux microlitres de colorant sélectif membranaire FM4-64, pour une concentration finale de cinq micromolaires. Ensuite, incubez la culture pendant 30 minutes à température ambiante avant d’examiner les conidies.

Pour configurer le microscope confocal, sélectionnez le laser à lumière blanche. Utilisez les lasers de 488 nanomètres et de 550 nanomètres pour exciter les défensines marquées à la rhodamine et le colorant FM4-64, respectivement. Réglez ces lasers sur une intensité de 1 %Ensuite, réglez les longueurs d’onde de détection sur 580 à 700 nanomètres pour la défensine marquée à la rhodamine et de 690 à 800 nanomètres pour le colorant FM4-64.

Maintenant, collectez les images. Pour l’imagerie en accéléré, ajoutez 50 microlitres de suspension conidique dans une parabole à micropuits à fond de verre. Ensuite, montez la parabole à micropuits sur le microscope et trouvez les cellules à faible puissance.

Ensuite, passez à un objectif à huile 100x, 1,44. Pour observer les défensines marquées par DyLight550, réglez la ligne laser sur 550 nanomètres pour l’excitation et de 560 à 600 nanomètres pour la détection. Ensuite, réglez le mode de balayage sur xyzt.

Ensuite, réglez la position Z, le zoom, la fréquence de capture d’image, etc., selon vos besoins. Maintenant, à la suspension conidiale, ajoutez 50 microlitres de défensines marquées au fluorophore à la concentration inhibitrice minimale de trois micromolaires, et ajoutez deux microlitres de colorant sélectif membranaire FM4-64 pour une concentration finale de cinq micromolaires. Ensuite, recentrez l’optique si nécessaire.

Avant de prendre des images, placez de petits morceaux de papier filtre humide dans la parabole pour éviter l’évaporation. Ensuite, procédez à la capture d’une image toutes les 3,5 minutes pendant 2,5 heures. L’imagerie de cellules vivantes a été réalisée pour suivre et comparer l’internalisation et la localisation subcellulaire de deux défensines de Medicago truncatula.

La défensine quatre marquée à la rhodamine synthétisée chimiquement a été trafiquée différemment chez Neurospora crassa et Fusarium graminearum. FM4-64 a marqué les membranes plasmiques des deux champignons. Cependant, chez Fusarium, la défensine quatre est diffusée dans le cytoplasme.

Alors que, chez Neurospora, il est transporté vers les corps vésiculaires. À titre de comparaison, la défensine cinq a été visualisée à l’aide d’un marquage DyLight550 chez Neurospora crassa, ainsi que d’un marquage de la membrane plasmique par FM4-64. L’imagerie en accéléré montre que cette défensine pénètre dans les cellules en 30 à 40 minutes et se diffuse ensuite dans le cytoplasme.

Cela diffère du trafic de la défensine quatre, qui pénètre dans les cellules et reste piégée dans les corps vésiculaires même après trois heures. En résumé, l’imagerie des cellules vivantes est un outil puissant pour accroître notre compréhension des modes d’action des différences entre les plantes antifongiques. Avec d’autres colorants fluorescents et marqueurs cellulaires essentiels, il a la possibilité d’être modifié pour d’autres peptides antimicrobiens.

En fin de compte, cette technique peut aider à développer de nouvelles stratégies d’utilisation des peptides antimicrobiens comme agent antifongique dans l’agriculture et la médecine.