Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

L’objectif global de cette méthode basée sur l’imagerie est de localiser quantitativement une protéine de Golgi à une résolution nanométrique. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’étude de l’appareil de Golgi, telles que l’organisation de ce dernier et son fonctionnement. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle utilise un microscope optique conventionnel et des outils logiciels.

Pour commencer, cultivez les cellules HeLa dans un flasque de T25 dans du DMEM complété avec 10 % de FBS et incubez la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence, aspirez le milieu de culture et ajoutez un millilitre de trypsine EDTA à 25 % dans la fiole. Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant deux minutes.

Retirez les cellules de l’incubateur et ajoutez un millilitre de substrat complet pour délicatement les cellules de la paroi de la fiole. Transférez les cellules détachées dans un tube de centrifugation stérile et faites tourner le tube à 500 g pendant deux minutes pour pelleter les cellules. Après avoir aspiré le surnageant, utilisez un millilitre de milieu complet pour suspendre la pellete cellulaire.

Retirez le milieu du puits d’une plaque à 24 puits contenant un couvercle en verre stérilisé et semez environ 100 000 cellules dans le puits. Utilisez un médium complet pour augmenter le volume du puits à 5 millilitres. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Lorsque les cellules ont atteint 80 % de confluence, utilisez 80 nanogrammes de GalT-mCherry et 320 nanogrammes d’ADN plasmidique TPST1-EGFP ainsi que du réactif de transfection pour transfecter les cellules selon le protocole du fabricant. Après avoir incubé les cellules pendant quatre à six heures, changez le milieu et remettez les cellules dans l’incubateur pendant 12 heures. Aspirez le milieu dans le puits et ajoutez 5 millilitres de 33 micromoules contenant un milieu complet contenant du Nocodazole, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant trois heures.

Après avoir nettoyé les glissants de couvercle en verre selon le protocole textuel, utilisez une fois le PBS contenant 1 microgramme par microlitre de BSA pour diluer 110 nanomètres de billes fluorescentes multicolores multicolores 80 fois. Faites brièvement un vortex sur le tube pour disperser les agrégats de billes. À l’aide d’une pointe de pipette, étalez 60 microlitres de billes diluées sur une barbe de couverture propre.

Dans le noir, placez la gaine de couverture dans un plat de 35 millimètres et recouvertez-la de papier aluminium. Séchez la couche de couvercle dans le noir dans un dessiccateur relié à une pompe à vide. Ensuite, utilisez 50 microlitres de médium de montage pour fixer la couvre sur une lame en verre.

Des engourdes de couverture correctement propres sont essentielles pour éliminer les débris fluorescents. Pour imager des billes multicolores dans les canaux vert, rouge et rouge lointain, au début de la séance d’imagerie, acquiert des piles 3D d’images, en prenant trois sections au-dessus et en dessous du meilleur plan focal. Sauvegardez les piles sous forme de fichiers TIFF.

Pour imager les mini-piles de Golgi, utilisez TPST1-EGFP et GalT-mCherry transfectés dans des lames marquées fluorescentement afin de trouver des cellules exprimant TPST1-EGFP et un GalT-mCherry de faible ou moyen niveau. Acquérez des piles d’images 3D comme cela vient de le démontrer. Pour analyser les images, ouvrez l’image J, choisissez Fichier, Image, Ouvrir, pour ouvrir un ensemble d’images perlées composées de trois fichiers TIFF.

Choisissez Image, Stacks, Z Project, pour faire une moyenne de trois sections consécutives autour de la section la mieux focalisée dans le canal rouge. Saisissez le numéro de section de la tranche de départ et de la tranche d’arrêt et, parmi les options de type de projection, sélectionnez l’intensité moyenne. Dessinez des ROI en arrière-plan sans perles dans l’image.

Ensuite, dans Analyser, définir des mesures, ne vérifiez que la valeur grise moyenne et l’écart-type ou SD. Exécuter, analyser, mesurer, pour obtenir l’intensité moyenne de fond et l’écart-type. Choisissez Processus, Mathématiques, Soustraitr, pour soustraire l’image avec les valeurs correspondantes de l’intensité moyenne de fond plus six fois l’écart-type. Ensuite, saisissez la valeur calculée correspondant à ce canal.

Répétez la moyenne et la soustraction pour les piles d’images vertes et rouges lointaines en utilisant la même tranche de démarrage et d’arrêt et le même ROI en arrière-plan. Fusionnez les trois images traitées à l’aide d’Image, Couleur, Fusionnez les canaux, en sélectionnant le canal R en rouge, le canal G en vert et le canal B en bleu. Lancez le ROI Manager en choisissant Analyser, Outils, ROI Manager.

Dessinez des ROI carrés autour de perles individuelles. Ensuite, ajoutez le ROI au gestionnaire de ROI en appuyant sur T sur le clavier. Sous Analyser, Définir les mesures, vérifier uniquement le centre de masse.

Dans le gestionnaire de ROI, sélectionnez le canal R et cliquez sur Mesurer pour obtenir les coordonnées X et Y des centres des ROI dans la fenêtre des résultats. Copiez-collez les deux colonnes dans un tableur. Obtenez les coordonnées des centres de ROI pour les canaux G et B. Enregistrez le tableur comme beads.csv.

Dans l’image J, utilisez des plugins pour installer les deux macros, macro Golgi inspection ROI et macro pour sortir les données des trois canaux. Effacez la fenêtre ROI Manager et les résultats. Ouvrez un ensemble d’images mini-pile de Golgi composées de trois fichiers TIFF.

Générez des images soustraites en arrière-plan comme montré précédemment dans cette vidéo pour une utilisation ultérieure. Ensuite, duplique les images. Dans Processus, Calculatrice d’image, ajoutez les images de canal G, R et B soustraites en arrière-plan.

Pour l’image résultante sous Image, Ajuster, Seuil, sélectionnez Définir pour entrer un comme seuil le plus bas. Dans Analyser, Analyser les particules, saisi aussi la plage de taille pour le pixel de taille. Saisi 50 à l’infini, vérifie les exclus sur les arêtes, et ajoute au gestionnaire.

Ensuite, utilisez Image, Couleur, Fusionner les canaux pour fusionner les trois images soustraites d’arrière-plan générées précédemment en sélectionnant le canal R en rouge, le canal G en vert et le canal B en bleu. Ensuite, lance l’inspection macro macro ROI de Golgi en sélectionnant Plugins, Macro, Inspection ROI de Golgi. Il est important de sélectionner autant de ROI que possible qui contiennent des mini-piles de Golgi individuelles dans un ensemble d’images.

Sous Analyser, Définir les mesures, vérifier seulement la surface, la valeur grise moyenne et le centre de masse. Obtenez des données en lançant l’outil macro et en sortant les données de trois canaux. Copiez les coordonnées des centres dans un tableau dans l’ordre indiqué ici.

Ensuite, enregistrez le tableau Excel comme ministacks.csv. Procéder à la correction chromatique des centres et au calcul du quotient de localisation ou LQ selon le protocole textuel. Le microscope optique moderne de qualité recherche, équipé d’une lentille apochromatique simple, comme celui utilisé ici, présente un décalage chromatique minimal.

Cependant, un examen attentif de l’image multicolore de la perle le révèle cela. Les centres de fluorescence rouge sont définis comme les positions réelles des billes. Les décalages chromatiques relatifs de la fluorescence verte et rouge lointain peuvent être représentés par des vecteurs.

Le décalage chromatique dans le plan d’imagerie est illustré par les vecteurs vert et bleu pour chaque bille. Comme illustré ici, la correction du décalage chromatique réduit significativement ce décalage chromatique. Dans les cellules de mammifères, le complexe de Golgi est agrégé à la zone périnucléaire, ce qui n’est généralement pas résoluble sous un microscope optique conventionnel.

Après le traitement au Nocodazole, le complexe périnucléaire de Golgi disparaît et des dizaines de mini-piles de Golgi s’assemblent aux sites de sortie du réticulum endoplasmique à travers le cytoplasme. Un exemple d’image généré à partir de l’analyse d’image démontrée dans cette vidéo est présenté ici. En utilisant l’outil macro Golgi ROI Inspection, 40 mini-stacks Golgi sélectionnés étaient listés.

Après application des trois critères, 21 mini-stacks de Golgi ont été analysables pour le calcul des LQ de TPST1-EGFP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure après le marquage par fluorescence. Après son développement, cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs étudiant l’appareil de Golgi pour localiser quantitativement une protéine de Golgi dont la résolution équivaut à celle de la microscopie à immunoélectronscopie.