Imagerie haute résolution et ultra-résolution des cellules T à l'aide de madSTORM

L'objectif général de ce protocole d'imagerie est de visualiser plusieurs protéines dans un lymphocyte T activé, en utilisant la microscopie de localisation de molécules uniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'activation des lymphocytes T, telles que la distribution au niveau de la molécule unique des composants du récepteur des lymphocytes T ou des microagrégats. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une multiplexion plus importante que celle obtenue avec les méthodes actuelles de microscopie à solution supervisée.

Pour commencer, conjuguez directement les anticorps avec le colorant Alexa 647 à l’aide du kit de marquage d’anticorps Alexa 647, en suivant le protocole de marquage fourni par le fabricant. Faites centrifuger les anticorps marqués pendant cinq minutes à 20 800 × g. Après la centrifugation, récupérez le surnageant afin d’éliminer les anticorps agrégés. Ensuite, recouvrez les chambres à lamelle A12 avec 250 microlitres de poly-L-lysine à 0,1 % pendant 15 minutes.

Ensuite, aspirez la solution sans rincer et séchez les chambres à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Préparez une dilution de nanodiamants fluorescents de 100 nanomètres, ou FND, dans un PBS, testez plusieurs dilutions afin de garantir que suffisamment de FND seront visibles dans chaque champ. Vortexez les FND dilués pendant une minute.

Ensuite, soniquez le surnageant de FND pendant 30 secondes à puissance élevée. Incubez le surnageant de FND soniqué dans une chambre contenant un coverslip A12 revêtu de poly-l-lyzine pendant 30 minutes à température ambiante. Après avoir lavé la chambre cinq fois avec du PBS 1x, visualisez la chambre recouverte de FND en utilisant une excitation laser à 647 nanomètres sur le microscope turf.

Utilisez un objectif 100x offrant un champ de vision de 61 par 61 microns. Idéalement, quatre à dix FND individuels devraient être visibles dans le champ, compte tenu d'une dilution appropriée des FND, avec au moins un FND présent dans chaque quadrant du champ d'imagerie. Une fois la densité adéquate de FND atteinte, ajoutez 250 microlitres d'anticorps anti-CD3 à chaque puits.

Incuber la chambre pendant une heure à 37 degrés Celsius ou toute la nuit à 4 degrés Celsius. Après l'incubation, retirer la solution des puits et ajouter du PBS 1x pendant 30 secondes. Répéter cette étape de lavage cinq fois.

Faire centrifuger un millilitre de cellules T Jurkat à 800 × g pendant six minutes. Les cellules T Jurkat doivent idéalement être à une concentration de 0,5 à un million de cellules par millilitre avant la centrifugation. Résuspendre les cellules dans 300 microlitres de solution HBS 1x.

Dans l'intervalle, ajouter 150 microlitres de solution HBS 1x dans chaque puits de la chambre et incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, ajouter 50 microlitres des cellules T Jurkat re-suspendues dans chaque puits et incuber pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Puis, ajouter 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après trois lavages avec du PBS 1x, perméabiliser les cellules en ajoutant 250 microlitres de solution de Triton X 0,1 % pendant cinq minutes à température ambiante. Après trois autres lavages avec du PBS 1x, ajouter 250 microlitres de solution de gélatine de poisson à 1 % dans chaque puits pendant 30 minutes à température ambiante. Enfin, laver les cellules trois fois supplémentaires avec du PBS 1x.

Ajouter 200 microlitres d'anticorps marqué à une concentration de 0,1 à 0,5 microgramme par millilitre sur les cellules fixées pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé les cellules cinq fois avec du PBS 1x, ajouter un millilitre de tampon STORM et recouvrir la chambre d'un coverslip en verre afin de limiter l'exposition. Utiliser des pinces sur la platine du microscope pour maintenir la chambre avec le coverslip en place.

Cette étape est cruciale pour la multiplexion à grande échelle, car le même champ de vision doit être conservé après plusieurs cycles de lavage et d'incubation. En utilisant une faible puissance laser à 647 nanomètres en mode turf, localisez une cellule marquée présentant au moins trois FND dans le champ de vision. Augmentez la puissance laser à 647 nanomètres et acquérez les images.

Les paramètres typiques peuvent être trouvés dans le protocole écrit. Laver les cellules cinq fois avec du tampon salin au tris 1x ou du TBS 1x. Ensuite, ajouter un millilitre de tampon d'élution et incuber à température ambiante pendant une minute.

Répétez l'élution trois fois. Utilisez les conditions d'élution exactes et le nombre de rinçages d'élution nécessaires pour éliminer le signal, comme indiqué pour chaque anticorps. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 1 ml de TBS 1x et ajoutez un millilitre de PBS 1x.

Une exécution correcte de cette étape d'élution permettra d'éliminer l'anticorps précédemment fixé et d'obtenir une efficacité accrue lors de l'étiquetage par l'anticorps suivant. Il est important d'utiliser du TBS pour les lavages afin de minimiser la précipitation entre les étapes d'élution. Effectuez un blanchiment photo des cellules à l'aide d'un laser de 647 nanomètres à haute puissance, combiné à un laser de 405 nanomètres à deux à cinq milliwatts, afin d'activer par photoactivation les colorants Alexa 647 à l'état sombre.

Attendez que tout le signal résiduel de l'anticorps non élué soit photodégradé. Généralement, cela prend de deux à cinq secondes d'exposition au laser. Acquérez des images de l'échantillon, en utilisant les paramètres STORM après l'illusion et la photodégradation, afin de confirmer l'élimination du signal.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 minutes. Cette étape empêche la réversion des liaisons croisées des molécules fixées dans la cellule. Lavez les cellules trois fois avec du PBS 1x.

Répétez ces étapes pour l'étiquetage séquentiel de plusieurs cibles. Enfin, effectuez la correction de dérive et l'alignement des piles d'images multiplexes comme décrit dans le protocole textuel. La méthode séquentielle illusion et standing a été utilisée pour produire l'image multiplexe MET STORM de microamas et d'autres structures dans une cellule T Jurkat activée.

L'image finale MET STORM a été corrigée pour les dérives et l'alignement, à l'aide d'une correction fiduciale moyenne et de marqueurs fiduciaux FND. On voit ici des images de microscopie de localisation de molécules uniques d'un FND unique localisé dans 30 000 images, avant et après correction de la dérive par correction fiduciale moyenne. De même, voici des images de microscopie de localisation de molécules uniques d'une cellule T Jurkat activée marquée par un anticorps anti-SLP76 phosphorylé et des marqueurs futusiaux FND, avant et après correction de la dérive par correction futusiale moyenne.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser un imaging multiplexé en super-résolution des protéines dans un lymphocyte T activé, en utilisant la technique MET STORM. Une fois maîtrisée, cette méthode peut être effectuée en trois heures pour chaque cycle de multiplexage. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit de maintenir l'échantillon dans la même position sur la platine du microscope.

Cela peut être réalisé à l'aide de pinces de support. N'oubliez pas que le travail avec notre tampon STORM modifié peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'utilisation de respirateurs et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.