Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies

L'objectif général de cette procédure est de surveiller le chimérisme dans le cadre de la greffe de cellules souches. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la greffe, telles que l'attecchage de la greffe de cellules souches hématopoïétiques chez les patients atteints de syndromes hémoglobinopathiques. Le principal avantage de cette méthode réside dans le fait qu'elle combine le tri cellulaire par cytométrie en flux, le dosage basé sur les informations de colonne et l'analyse subséquente des répétitions courtes pour évaluer la prolifération et la différenciation des progéniteurs dans le compartiment érythroïde.

L'implication de cette technique s'étend au traitement du rejet du greffon car elle peut aider à identifier les patients susceptibles de rechute de la maladie et à initier des stratégies immunomodulatrices ultérieures. De plus, elle peut également être appliquée à des études cliniques futures, à la recherche sur les cellules souches et à la conception d'essais thérapeutiques cutanés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le processus est difficile à apprendre et doit être réalisé par du personnel formé.

La démonstration de cette procédure sera effectuée par Elisabeth Hoflehner, technicienne dans mon laboratoire. Pour commencer, préparez une suspension monocellulaire de l'échantillon de moelle osseuse destiné à la coloration des lipides. Pour ce faire, placez un tamis cellulaire contenant la moelle osseuse et vissez-le au-dessus d'un tube de centrifugation.

Utilisez le piston de la seringue pour forcer les morceaux de tissu à travers la maille. Pour recueillir tout le matériel, rincez avec quelques millilitres de tampon de suspension. Ajoutez trois millilitres de milieu de gradient dans un tube de centrifugation et déposez délicatement la suspension de cellules individuelles par-dessus.

Centrifuger le tube à 550 G à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes, avec une accélération réglée à neuf et une décélération à zéro. Retirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes à l’aide de la pipette, en veillant à ne pas perturber la couche de cellules mononucléées située à l’interface. Transférer cette couche de cellules mononucléées dans un tube de centrifugation.

Ensuite, lavez les cellules avec 10 millilitres de tampon de suspension. Centrifugez le tube à 250 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans deux millilitres de milieu complet d'Isokov modifié de Dulbecco, à l'aide d'une pipette.

Pour déterminer la concentration cellulaire à l’aide d’un hématimètre, placer 95 microlitres de colorant au bleu de trypan 2 % dans une plaque de 96 puits. Ajouter cinq microlitres de suspension cellulaire, bien mélanger et incuber brièvement à température ambiante. Remplir l’hématimètre et l’observer au microscope.

Ne compter que les cellules viables colorées. Ensuite, centrifuger la suspension cellulaire à 250 ×g à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour bloquer le récepteur FC, utiliser 2,5 microgrammes de blocage par 100 microlitres.

Incuber sur glace de 10 à 15 minutes. Ajouter le mélange d'anticorps monoclonaux préalablement titrés approprié au volume utilisé pour colorer les cellules. Incuber à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant 20 minutes.

Lavez les cellules avec trois millilitres de tampon de marquage, puis centrifugez. Après avoir ajusté la concentration cellulaire, transférez la suspension cellulaire dans un tube standard pour cytométrie en flux en pipetant à travers un filtre cellulaire de 70 microlitres afin d'éliminer les agrégats. Ensuite, configurez et optimisez le trieur cellulaire et le logiciel selon les instructions du fabricant.

Configurer un modèle incluant un tracé bivarié pour afficher la diffusion directe (FSC) et la diffusion latérale (SSC). Pour placer la population cellulaire d'intérêt à l'échelle, faire passer les cellules sur le trieur et ajuster les paramètres FSC et SSC. Commencer par enregistrer les données du tube témoin négatif, puis enregistrer les données de chaque tube témoin de compensation marqué individuellement et calculer la compensation.

Ensuite, placez les échantillons expérimentaux sur un graphique en nuage de points bivarié FSC, SSC afin d'inclure à la fois les cellules lymphocytaires et les cellules myéloïdes. En comparant les différents signaux de FSC, excluez les doubles et les agrégats. Puis visualisez les cellules uniques exprimant CD45 et CD36 sur un graphique en nuage de points bivarié.

Les événements positifs pour CD45 représentent les leucocytes et leurs progéniteurs. Les événements négatifs pour CD45 et positifs pour CD36 représentent les progéniteurs érythroïdes. Pour définir les cellules positives pour CD36 et positives pour CD45, utilisez des outils de délimitation des populations (gating) puis visualisez les événements positifs pour CD45 et un autre diagramme en points affichant les paramètres CD34 et SSC.

Ensuite, utilisez les outils de sélection pour définir les cellules positives pour CD34 ou les progéniteurs de leucocytes ainsi que les cellules à forte diffusion latérale (SSC) ou les cellules myéloïdes à divers stades de différenciation. Après cela, sélectionnez les fenêtres de tri pour la collecte dans des tubes externes. Enfin, poursuivez le tri cellulaire à quatre degrés Celsius jusqu'à l'obtention du nombre souhaité de cellules.

Effectuez une dilution des cellules en ajoutant du milieu IMDM complet supplémenté en érythropoïétine recombinante humaine ou EPO. Transférez 300 microlitres des cellules diluées dans trois millilitres de milieu H4434 et incubez sous agitation à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, répartissez dans trois boîtes de 35 millimètres un millilitre de suspension cellulaire chacune.

Placer deux des boîtes de culture avec une troisième remplie d'eau dans une plaque de 100 millimètres. Cultiver ces cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 14 jours. Utiliser un microscope inversé avec un grossissement de 40x et la boîte de culture marquée d'une grille de comptage pour évaluer les colonies selon leur morphologie.

Classer les unités formant colonies ou UFC en cellules progénitrices multipotentes, cellules progénitrices monocytes granulocytes, unités formant des érythrocytes en rafales et cellules formant des colonies érythroïdes. Pour commencer, récupérer les cellules à partir de la télécopie ou de la plaque d'essai UFC selon le protocole décrit dans le texte et procéder à l'extraction de l'ADN. Après centrifugation des cellules, utiliser un instrument automatisé d'isolement d'ADN sanguin pour isoler les acides nucléiques à partir du culot.

Mesurez la concentration d'ADN à l'aide d'un fluoromètre. Préparez les échantillons conformément aux instructions du fabricant, puis placez l'échantillon dans la chambre de mesure du fluoromètre. Ajoutez l'ADN dilué à un mélange contenant la polymérase ADN, le jeu d'amorces et le mélange de réaction afin de préparer une réaction de PCR conformément au mode d'emploi.

Inclure l'ADN pré-greffe du donneur et du receveur, ainsi que de l'eau sans nucléase, comme témoin négatif, et 9947A comme témoin positif. Pour analyser les résultats de la PCR, ajouter 10 microlitres d'échantillons d'ADN dénaturés dans les puits d'une plaque de réaction à 96 puits. Sceller la plaque, effectuer une brève centrifugation, puis placer la plaque sur de la glace.

Les progéniteurs mégacaryocytaires érythroïdes ont été triés comme une population positive pour CD36 et négative pour l'antigène CD45. De plus, les cellules positives pour CT45 et positives pour CD34 sont identifiées comme des précurseurs lymphoïdes myéloïdes, et les cellules positives pour CD45, présentant un signal SSC élevé, comme des cellules myéloïdes matures. La pureté des cellules progénitrices érythroïdes après tri était supérieure à 85 %, et la pureté des cellules myéloïdes était supérieure à 95 %. Les cellules de la moelle osseuse séparées à l’aide de billes magnétiques spécifiques pour CD34 ont été cultivées pendant 14 jours.

Certaines de ces cellules semblent proliférer, se différencier et former des colonies. Une stimulation avec différentes concentrations d'EPO a augmenté la formation de colonies érythroïdes nettement rouges. Une analyse PCR des répétitions courtes en tandem ou STR spécifiques de l'ADN du receveur et du donneur permet de détecter le chimérisme dans les cellules.

Cette méthode a permis de déterminer avec succès la quantité d'ADN du donneur par rapport à celle du receveur dans les cellules obtenues par tri cellulaire de cellules de la moelle osseuse, ainsi que dans les cellules issues du test clonogénique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement. Lorsqu'on entreprend cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'elle doit être standardisée et réalisée par du personnel adéquatement formé.

Après cette procédure, les cellules progénitrices érythroïdes résiduelles d'origine donneur peuvent être analysées plus avant afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que l'avantage sélectif des cellules souches érythroïdes corrigées génétiquement. Depuis son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la greffe de cellules souches d'explorer la prolifération et la différenciation des progéniteurs dans le compartiment érythroïde. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de surveiller l'attecement après une greffe de cellules souches chez les patients atteints d'hémoglobinopathies.