Reprogrammation du liquide amniotique primaire et cellules de Membrane de pluripotence dans des Conditions sans Xeno

L’objectif global de cette procédure est de dériver efficacement des cellules souches pluripotentes induites au moyen d’une reprogrammation épisomale à partir de deux types différents de cellules souches fœtales. Cette méthode peut aider à fournir une source de cellules souches pluripotentes pour l’ingénierie tissulaire, la modélisation de maladies, la recherche fondamentale ou les études longitudinales. Le principal avantage de cette technique est que la reprogrammation et la maturation des iPSC se produisent dans des conditions chimiquement définies tout en étant disponibles tôt pour des thérapies potentielles à base de cellules pédiatriques.

Steven McClellan, le chercheur principal, et moi-même ferons la démonstration de cette procédure. Procurez-vous des placentas dès que possible après la naissance. Coupez un segment de neuf centimètres carrés de l’amnion et lavez-le dans un tube à centrifuger de 50 millimètres avec 30 millilitres de PBS complété par une solution antibiotique et antimycosique.

Retirez les caillots sanguins des membranes, puis utilisez une paire de scalpels fins pour hacher les membranes en petits morceaux dans une boîte de culture tissulaire stérile de 10 centimètres. Utilisez les lames de scalpel pour transférer la masse de tissu membranaire hachée dans un tube de dissociation tissulaire contenant 4,7 millilitres de milieu RPMI-1640. Incorporer les enzymes de dissociation.

Montez le tube sur le dissociateur tissulaire et exécutez le programme h_tumor_01. Ensuite, incubez le tube à 37 degrés Celsius sur une plate-forme à bascule pendant 30 minutes. Diluez davantage la suspension avec 35 millilitres de RPMI-1640 et appliquez sur une crépine de 70 microns placée sur un tube de centrifugation de 50 millilitres.

Centrifuger pendant cinq minutes à 200 fois g à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de RPMI-1640 et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensemencez les cellules en grappes de cellules à une densité d’environ 10 000 cellules par centimètre carré dans des flacons de culture tissulaire avec un milieu AFMC fraîchement préparé complété par une solution antibiotique et antimycosique.

Récoltez du liquide amniotique à faible nombre de passage et des cellules souches membranaires pour la reprogrammation à partir d’un flacon T75 en ajoutant deux millilitres d’enzyme de détachement cellulaire à la feuille cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq à huit minutes. Après une centrifugation à 200 fois g pendant 45 minutes, remettre la pastille en suspension dans un millilitre de PBS et bien mélanger pour éliminer les composants sériques.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez ensuite la densité cellulaire à 100 000 cellules par millilitre de PBS, et maintenant quadrilatères dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Placez les tubes de microcentrifugation dans des tubes en polystyrène de cinq millilitres pour permettre la centrifugation dans un gouvernail pivotant régulier, et centrifugez à 200 fois g pendant quatre minutes à température ambiante.

Après l’essorage, retournez les tubes et jetez le surnageant dans un conteneur à déchets, puis effectuez une étape de centrifugation supplémentaire à 200 fois g pendant trois minutes. Après l’essorage, utilisez une pipette de 200 microlitres pour aspirer soigneusement le liquide restant des tubes. Placez les pointes de transfection, le tube, le tampon de resuspension et le tampon électrolytique dans l’armoire de culture tissulaire.

Rapprochez l’appareil de transfection afin que sa station de tube puisse être placée directement dans l’armoire. Remplissez un tube de transfection avec trois millilitres de tampon électrolytique et montez le tube dans la station en le poussant à fond à l’intérieur de la fente. Prélever des aliquotes préalablement préparées de solution plasmidique de reprogrammation hors du stockage à moins 80 degrés Celsius et les laisser décongeler à température ambiante dans l’armoire de culture.

Réglez les paramètres de transfection sur l’appareil pour qu’il délivre une impulsion de 40 millisecondes à 950 volts. Remettre en suspension le granulé contenant 100 000 cellules dans 10 microlitres de tampon de remise en suspension. En travaillant rapidement, ajoutez 1/10 de la solution plasmidique de reprogrammation aux cellules remises en suspension.

Montez la pointe de transfection sur la pipette de transfection. Ensuite, aspirez la suspension cellulaire dans l’embout de transfection en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Insérez la pipette de transfection dans le tube de transfection.

Et appuyez sur le bouton de démarrage sur l’écran de l’appareil de transfection. Attendez le message à l’écran indiquant la réussite de la transfection. Retirez ensuite immédiatement la pipette du tube.

Expulsez la suspension dans un puits des plaques cibles à six puits. Mélangez le milieu d’un puits voisin et répartissez la suspension uniformément dans les deux puits. Répétez la transfection pour chaque tube de microcentrifugation avec des cellules.

Commencez par ajouter 30 microlitres d’EDTA de 0,5 millimolaire et de PBS à cinq tubes PCR. Chargez ensuite une pointe sur une pipette de 10 microlitres réglée sur deux microlitres. Tenez la pointe de la pipette à un angle au bord de la colonie et grattez soigneusement et progressivement toute la colonie de la surface.

Aspirez immédiatement toute la colonie dans la pointe de la pipette et transférez-la dans l’un des tubes PCR préparés avec de l’EDTA. Après avoir répété le processus avec quatre autres colonies, incubez à température ambiante pendant quatre à six minutes. À l’aide d’une pointe de pipette plus grande, pipetez doucement chaque suspension cellulaire de haut en bas afin de décomposer la colonie en petits amas.

Évitez de créer une suspension à cellule unique. Ensuite, plaquez la suspension directement dans le puits cible d’une plaque recombinante à 24 puits recouverte de vitronectine. Après avoir répété le processus pour les colonies restantes, incubez pendant trois à six jours.

Après quatre à six jours, lorsque les colonies ont grandi et sont devenues compactes, lavez les feuilles cellulaires avec 300 microlitres d’EDTA de 0,5 millimolaire et aspirez immédiatement. Ajoutez ensuite 300 microlitres supplémentaires et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir aspiré l’EDTA, réglez une pipette d’un millilitre à sa capacité, montez-la sur une pointe d’alésage d’un millilitre de large et aspirez le milieu E8 à partir du puits cible d’une plaque à six puits recouverte de vitronectine.

Versez un jet du milieu dans un puits de la plaque source pour laver la culture iPSC. Transférez ensuite la suspension dans le puits cible, et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour briser les colonies en amas de 20 à 40 cellules. Après avoir plaqué toutes les cellules, assurez-vous que les amas sont répartis uniformément en balançant et en secouant doucement la plaque.

Remettez ensuite la plaque dans l’incubateur pour l’adhésion des amas et la croissance des colonies. Le liquide amniotique et les cellules souches membranaires, qui représentent les cellules sources pour la reprogrammation, présentent une morphologie mésenchymateuse typique, allongée et en phase brillante. Les cellules acquièrent des propriétés épithéliales après avoir subi la transition mésenchymateuse à épithéliale, ce qui conduit à la formation de colonies avec des cellules ressemblant à des pavés.

Ces colonies prolifèrent et créent des masses cellulaires irrégulières de cellules MET. Aux derniers stades de la reprogrammation, des colonies de cellules entièrement reprogrammées émergent, des cellules individuellement discernables avec des bords bien définis. Ces cellules entièrement reprogrammées côtoient les colonies MET qui sont plus nombreuses.

Un clone mature isolé entièrement reprogrammé est montré ici. Après la dérivation et la maturation des iPSC, elles peuvent être soumises à une caractérisation détaillée et diriger la différenciation en une variété de types de cellules. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains qui n’ont pas été testés pour la présence d’agents pathogènes peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que l’équipement de protection individuelle et le travail dans l’enceinte de biosécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire la pluripotence dans les cellules souches fœtales, des réactifs et du matériel à utiliser, et de la façon de cultiver régulièrement des cellules souches pluripotentes.