Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l'étude des neurones dans les tranches de cerveau
31 juillet 2017
Ce protocole décrit comment mener des expériences automatiques de fixation de patch guidées par image à l'aide d'un système récemment développé pour un équipement d'électrophysiologie standard in vitro .
L’objectif global de cette technologie est d’utiliser la vision par ordinateur pour détecter automatiquement les cellules fluorescentes et effectuer un patch clamp automatisé de ces cellules dans des tranches de cerveau aiguës. Cette méthode peut aider à surmonter les principales difficultés dans le domaine de l’électrophysiologie du patch clamp, telles que l’identification, le ciblage et le patch clamp de cellules marquées par fluorescence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut détecter automatiquement les pipettes patch, les cellules fluorescentes et intégrer les étapes avec un patch clamp automatique.
Cette innovation augmente considérablement le débit expérimental. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie ou au diagnostic des troubles neurologiques, car la pince de patch automatique guidée par l’image à haut débit peut être utilisée pour des dépistages pharmacologiques dans des préparations neuronales plus physiologiques. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres préparations in vitro, telles que les cultures d’organites neuronaux, ou les cultures en tranches, dissocient les neurones ainsi que toutes les cellules non neuronales.
Pour commencer cette procédure, allumez l’amplificateur, le contrôleur de microscope et le contrôleur de manipulateur. Ensuite, exécutez Autopatcher IG avec python à partir d’un terminal de ligne de commande en modifiant d’abord le répertoire où Autopatcher IG est installé. Ensuite, tapez Python Autopatcher_IG.
PYW dans le terminal de ligne de commande et appuyez sur la touche Entrée. Après cela, remplissez toute la pipette en verre avec la solution interne et chargez-la sur l’étage de tête. Déplacez la pointe de la pipette vers le champ visuel du microscope et faites-la apparaître.
Si le pavé numérique est utilisé pour déplacer les manipulateurs dans la platine du microscope, mettez à jour les coordonnées en appuyant sur la touche Z du clavier. L’étalonnage primaire convertit l’angle et la distance de mouvement du manipulateur en système de coordonnées du microscope. Le manipulateur se déplace dans trois directions avec une distance prédéfinie et le logiciel détecte les coordonnées de la pointe du pipette dans le champ visuel du microscope.
Cliquez sur le bouton de démarrage de l’étalonnage sur l’interface graphique principale de l’unité correspondante sur laquelle la pipette est chargée. Par la suite, enregistrez l’étalonnage en cliquant sur Enregistrer l’étalonnage en bas de l’interface graphique principale. Cet étalonnage primaire ne doit être effectué qu’une seule fois, à moins que l’organisation physique du banc ne soit modifiée.
Dans cette étape, placez une tranche de cerveau au centre de la chambre d’enregistrement. Stabilisez la tranche de cerveau à l’aide d’une prise de tranche ou d’une harpe. Pour détecter la cellule fluorescente, trouvez la zone d’intérêt sous le grossissement de quatre fois.
Ensuite, déplacez la platine du microscope en activant le mode clic pour déplacer et cliquez sur le centre de la zone d’intérêt. Vous pouvez également utiliser le clavier pour déplacer la platine du microscope. Ensuite, passez à l’objectif à fort grossissement et ajustez la mise au point en déplaçant le microscope dans l’axe Z à l’aide de RF sur le clavier.
Le logiciel dirige le microscope et la caméra pour prendre une série d’images à différentes profondeurs. Ensuite, ces images sont soumises à un traitement de vision par ordinateur pour trouver des cellules marquées par fluorescence. Le résultat final est une liste de coordonnées de cellule détectées.
Cliquez sur le bouton Détecter la cellule sur l’unité zéro de la colonne principale de l’interface graphique. Si la source lumineuse LED ou laser de la configuration ne peut pas être contrôlée par le signal TTL, allumez manuellement la LED ou le laser. Éteignez la LED ou le laser si nécessaire.
Une liste de coordonnées de cellule apparaîtra dans l’interface graphique des positions de la mémoire. Supprimez les cellules indésirables de la liste en cliquant sur le bouton X à côté des coordonnées. Sinon, si les cellules cibles ne sont pas marquées par fluorescence, cliquez sur le mode souris dans l’interface graphique principale.
Ensuite, cliquez sur la cellule qui vous intéresse, un point jaune avec un numéro apparaîtra sur la cellule et les coordonnées de la cellule apparaîtront dans l’interface graphique des positions de mémoire. Pour effectuer un étalonnage secondaire afin de détecter les coordonnées de décalage de la pipette, remplissez 1/3 d’une pipette en verre avec une solution interne. Ensuite, chargez la pipette sur le porte-pipette fixé à la tête.
À faible grossissement, utilisez un et deux sur le clavier pour basculer entre l’unité un et l’unité deux. Ensuite, amenez la pipette dans le champ visuel et ajustez la mise au point à l’aide du clavier. Ensuite, chargez l’étalonnage principal en cliquant sur l’étalonnage de la charge.
Basculez l’objectif du microscope sur un grossissement élevé et cliquez 40 fois sur l’interface graphique principale. Amenez la pointe de la pipette au centre. Ensuite, cliquez sur le bouton d’étalonnage secondaire sur l’interface graphique principale, sous l’unité utilisée.
Pour patcher une cellule cible, cliquez sur le bouton de contrôle de patch pour ouvrir l’interface graphique de contrôle de patch. Cliquez sur le bouton Aller à à côté de la cellule d’intérêt dans la liste de coordonnées de l’interface graphique de position de la mémoire. Ensuite, cliquez sur le bouton CTM de l’unité dans l’interface graphique principale pour activer le mouvement.
Cliquez sur la cellule qui vous intéresse pour déplacer la pointe de la pipette vers la cellule. En raison de la limitation mécanique du manipulateur, lors de déplacements à plus de 500 micromètres, il peut y avoir une légère erreur de positionnement. Pour éviter une erreur de positionnement mécanique importante, un étalonnage secondaire doit être effectué près de la cellule cible.
Ensuite, utilisez le bouton sélectionné par l’unité un pour basculer le signal d’entrée entre les deux unités. Cliquez sur le bouton de correctif dans l’interface graphique de contrôle de correctif. Le correctif automatique commencera et la pression et la résistance pourront être surveillées sur l’interface graphique de contrôle du patch.
L’algorithme de patching automatique surveille la résistance et contrôle la pression à travers une série de boucles logiques, pour former un gigaseal. Une fenêtre contextuelle informe de la formation d’un gigaseal. Le système utilise le changement de résistance pour reconnaître le contact avec la surface de la cellule.
Dans le cas où le contact cellule-surface n’est pas détecté à temps, utilisez le bouton suivant pour faire avancer l’étape de correctif tout en restant dans le même essai de correctif automatique. Manipulez le processus automatique à tout moment en cliquant sur les boutons respectifs de l’interface graphique de contrôle des correctifs. Ensuite, sélectionnez oui pour roder avec la combinaison de Zap et d’aspiration.
Vous pouvez également sélectionner non pour roder avec aspiration uniquement. Ensuite, enregistrez le journal des correctifs de l’expérience. Cette figure montre les emplacements sélectionnés chargés dans l’interface graphique de la séquence de commandes.
La colonne de gauche affiche la liste des coordonnées et la colonne de droite affiche la liste des commandes sous forme de signaux TTL pour chaque emplacement. Voici les captures d’écran lors de l’expérience d’application du médicament, correspondant aux trois emplacements sélectionnés. La solution de KCL a été mélangée à un colorant fluorescent rouge à des fins de visualisation.
La première unité était la pipette contenant KCL et la deuxième unité était la pipette de radouchage. Dans cette figure, les injections de courant de pas montrent un neurone de pointe régulier. Voici les traces d’enregistrement de la pince de tension provenant de l’application locale d’une solution de chlorure de potassium de 500 millimolaires à trois endroits.
La trace rouge avec courant entrant a été enregistrée lors de l’essai lorsque l’application de chlorure de potassium était proche de la cellule du patch. La flèche rouge indique le moment de l’application du chlorure de potassium. En utilisant cette méthode, il est possible d’effectuer un essai de patch clamp en quatre minutes sans formation approfondie par rapport au patching manuel.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’optogénétique, la chimiogénétique et les manipulations pharmacologiques, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions liées à votre projet de recherche. Après son développement, cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer des études à haut débit des récepteurs synaptiques et des canaux ioniques dans différentes préparations in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de patch clamp automatisées guidées par image.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode permettant de réaliser des expériences de patch-clamp guidées par imagerie automatique en utilisant une technologie avancée de vision par ordinateur. Cette approche améliore l'efficacité de l'identification et du ciblage de cellules marquées par fluorescence dans des tranches cérébrales aiguës.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Électrophysiologie
- Neurosciences
- Techniques d'imagerie
Contexte
- La microscopie en électrophysiologie par enregistrement en mode patch est essentielle pour l'étude de l'activité neuronale.
- L'identification et le ciblage de cellules spécifiques peuvent s'avérer difficiles.
- Les techniques automatisées peuvent améliorer le débit expérimental.
- Le marquage fluorescent facilite l'identification des cellules.
Objectif de l'étude
- Automatiser la détection des cellules fluorescentes pour les expériences de patch-clamp.
- Accroître l'efficacité des enregistrements électrophysiologiques.
- Faciliter les criblages pharmacologiques dans les préparations neuronales.
Méthodes utilisées
- Technologie de vision par ordinateur pour la détection des cellules.
- Dispositif automatisé de patch-clamp pour l'enregistrement.
- Intégration des processus de détection et d'enregistrement.
- Application à diverses préparations neuronales in vitro.
Résultats principaux
- Automatisation réussie de l'identification des cellules et du patch-clamp.
- Augmentation du débit pour les expériences d'électrophysiologie.
- Applications potentielles en recherche pharmacologique.
- Versatilité dans l'application à différents types cellulaires.
Conclusions
- Cette technique améliore considérablement l'efficacité expérimentale.
- Elle répond à des défis clés des méthodes traditionnelles de patch-clamp.
- Cette approche a des implications pour la recherche sur les troubles neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Le patch-clamp automatisé guidé par imagerie pallie les limitations de débit en électrophysiologie neuronale, permettant une validation fonctionnelle évolutive des cibles canaux ioniques et récepteurs synaptiques. Cette capacité soutient les flux de travail de découverte précoce en réduisant la variabilité technique et en augmentant la densité de données pour les campagnes d'identification de composés candidats. La méthode renforce la fiabilité prédictive dans la validation des cibles en fournissant des lectures électrophysiologiques quantitatives et reproductibles à partir de préparations neuronales physiologiquement pertinentes.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la mesure directe de l'excitabilité neuronale et des propriétés synaptiques dans des cellules marquées par fluorescence.
- Valeur opérationnelle : Réduit la dépendance vis-à-vis d'opérateurs experts, en standardisant l'exécution du patch clamp entre les utilisateurs et les sites.
- Valeur prédictive : Augmente le rendement de données par expérience, soutenant la rigueur statistique dans les études d'engagement ciblé et de mécanisme d'action.
Développement de tests et de criblages
- Prêt à l'essai : Génère des préparations neuronales standardisées adaptées aux campagnes de criblage pharmacologique et génétique en aval.
- Sortie quantitative : Fournit en temps réel des mesures de résistance et de pression permettant la détection automatisée de la formation du scellement et l'optimisation du processus.
- Extensibilité : Permet le ciblage multiplexé de plusieurs cellules par tranché, augmentant la densité expérimentale sans augmentation proportionnelle du temps opérateur.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Facilite l'étude des phénotypes neuronaux dans des tranches cérébrales aiguës, en préservant la connectivité neuronale native et le contexte physiopathologique.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre l'électrophysiologie de découverte et la validation préclinique en permettant des mesures cohérentes à travers différents modèles expérimentaux.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'évaluer directement les effets des composés sur la fonction des canaux ioniques et sur les patrons de décharge neuronale dans un tissu intact.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de biologie de la découverte en tant qu'étape de validation fonctionnelle suivant l'identification de la cible et précédant l'optimisation du composé candidat, fournissant une confirmation électrophysiologique de l'engagement de la cible dans des environnements neuronaux natifs.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses en enregistrant de manière automatisée et fidèle l'activité neuronale en réponse à des perturbations pharmacologiques ou génétiques.
- Criblage : Améliore la reproductibilité et le débit des tests, permettant une évaluation systématique de bibliothèques de composés sur l'excitabilité neuronale et la transmission synaptique.
- Analyse : Fournit des mesures électrophysiologiques quantitatives (par exemple, fréquence de décharge, résistance d'entrée, relations courant-tension) qui éclairent les relations structure-activité et la sélectivité des cibles.
- Recherche translationnelle : Préserve la pertinence physiologique en enregistrant l'activité des neurones dans des tranches cérébrales aiguës, conservant ainsi les profils d'expression natifs et les signaux du microenvironnement.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité d'électrophysiologie réutilisable, applicable à l'ensemble des programmes de découverte en neurosciences ciblant les canaux ioniques, les RCPG et les protéines synaptiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Améliore la confiance dans la validation des cibles grâce à une mesure directe et quantitative de la fonction neuronale dans des préparations physiologiquement pertinentes.
- Valeur opérationnelle : Accroît le débit expérimental et réduit la variabilité par l'automatisation de la détection des cellules, du ciblage et de l'exécution du patch.
- Valeur stratégique : Permet des décisions rapides d'aller/arrêt en générant des données fonctionnelles solides dès les premières étapes du processus de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des cibles ajustée au risque, sur la base d'une modulation électrophysiologique confirmée dans des circuits neuronaux pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en électrophysiologie, en intégration de la vision par ordinateur et en utilisation de micromanipulateurs pour la configuration du système et la résolution des problèmes.
- Dépend d'un marquage fluorescent stable, d'une préparation adéquate des pipettes de patch et d'un contrôle environnemental pour le maintien en bon état des tranches.
- Exige des protocoles logiciels standardisés et des procédures d'étalonnage afin d'assurer la reproductibilité entre les expériences et les utilisateurs.
- L'adaptation à des types cellulaires non neuronaux ou dissociés peut nécessiter des ajustements des algorithmes de détection et des paramètres de patch.
- Les limitations pratiques incluent les erreurs de positionnement mécanique sur de longues distances et la dépendance à des rapports signal-sur-bruit fluorescents optimaux pour une détection fiable des cellules.
