Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l'étude des neurones dans les tranches de cerveau
July 31st, 2017
Ce protocole décrit comment mener des expériences automatiques de fixation de patch guidées par image à l'aide d'un système récemment développé pour un équipement d'électrophysiologie standard in vitro .
L’objectif global de cette technologie est d’utiliser la vision par ordinateur pour détecter automatiquement les cellules fluorescentes et effectuer un patch clamp automatisé de ces cellules dans des tranches de cerveau aiguës. Cette méthode peut aider à surmonter les principales difficultés dans le domaine de l’électrophysiologie du patch clamp, telles que l’identification, le ciblage et le patch clamp de cellules marquées par fluorescence. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut détecter automatiquement les pipettes patch, les cellules fluorescentes et intégrer les étapes avec un patch clamp automatique.
Cette innovation augmente considérablement le débit expérimental. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie ou au diagnostic des troubles neurologiques, car la pince de patch automatique guidée par l’image à haut débit peut être utilisée pour des dépistages pharmacologiques dans des préparations neuronales plus physiologiques. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres préparations in vitro, telles que les cultures d’organites neuronaux, ou les cultures en tranches, dissocient les neurones ainsi que toutes les cellules non neuronales.
Pour commencer cette procédure, allumez l’amplificateur, le contrôleur de microscope et le contrôleur de manipulateur. Ensuite, exécutez Autopatcher IG avec python à partir d’un terminal de ligne de commande en modifiant d’abord le répertoire où Autopatcher IG est installé. Ensuite, tapez Python Autopatcher_IG.
PYW dans le terminal de ligne de commande et appuyez sur la touche Entrée. Après cela, remplissez toute la pipette en verre avec la solution interne et chargez-la sur l’étage de tête. Déplacez la pointe de la pipette vers le champ visuel du microscope et faites-la apparaître.
Si le pavé numérique est utilisé pour déplacer les manipulateurs dans la platine du microscope, mettez à jour les coordonnées en appuyant sur la touche Z du clavier. L’étalonnage primaire convertit l’angle et la distance de mouvement du manipulateur en système de coordonnées du microscope. Le manipulateur se déplace dans trois directions avec une distance prédéfinie et le logiciel détecte les coordonnées de la pointe du pipette dans le champ visuel du microscope.
Cliquez sur le bouton de démarrage de l’étalonnage sur l’interface graphique principale de l’unité correspondante sur laquelle la pipette est chargée. Par la suite, enregistrez l’étalonnage en cliquant sur Enregistrer l’étalonnage en bas de l’interface graphique principale. Cet étalonnage primaire ne doit être effectué qu’une seule fois, à moins que l’organisation physique du banc ne soit modifiée.
Dans cette étape, placez une tranche de cerveau au centre de la chambre d’enregistrement. Stabilisez la tranche de cerveau à l’aide d’une prise de tranche ou d’une harpe. Pour détecter la cellule fluorescente, trouvez la zone d’intérêt sous le grossissement de quatre fois.
Ensuite, déplacez la platine du microscope en activant le mode clic pour déplacer et cliquez sur le centre de la zone d’intérêt. Vous pouvez également utiliser le clavier pour déplacer la platine du microscope. Ensuite, passez à l’objectif à fort grossissement et ajustez la mise au point en déplaçant le microscope dans l’axe Z à l’aide de RF sur le clavier.
Le logiciel dirige le microscope et la caméra pour prendre une série d’images à différentes profondeurs. Ensuite, ces images sont soumises à un traitement de vision par ordinateur pour trouver des cellules marquées par fluorescence. Le résultat final est une liste de coordonnées de cellule détectées.
Cliquez sur le bouton Détecter la cellule sur l’unité zéro de la colonne principale de l’interface graphique. Si la source lumineuse LED ou laser de la configuration ne peut pas être contrôlée par le signal TTL, allumez manuellement la LED ou le laser. Éteignez la LED ou le laser si nécessaire.
Une liste de coordonnées de cellule apparaîtra dans l’interface graphique des positions de la mémoire. Supprimez les cellules indésirables de la liste en cliquant sur le bouton X à côté des coordonnées. Sinon, si les cellules cibles ne sont pas marquées par fluorescence, cliquez sur le mode souris dans l’interface graphique principale.
Ensuite, cliquez sur la cellule qui vous intéresse, un point jaune avec un numéro apparaîtra sur la cellule et les coordonnées de la cellule apparaîtront dans l’interface graphique des positions de mémoire. Pour effectuer un étalonnage secondaire afin de détecter les coordonnées de décalage de la pipette, remplissez 1/3 d’une pipette en verre avec une solution interne. Ensuite, chargez la pipette sur le porte-pipette fixé à la tête.
À faible grossissement, utilisez un et deux sur le clavier pour basculer entre l’unité un et l’unité deux. Ensuite, amenez la pipette dans le champ visuel et ajustez la mise au point à l’aide du clavier. Ensuite, chargez l’étalonnage principal en cliquant sur l’étalonnage de la charge.
Basculez l’objectif du microscope sur un grossissement élevé et cliquez 40 fois sur l’interface graphique principale. Amenez la pointe de la pipette au centre. Ensuite, cliquez sur le bouton d’étalonnage secondaire sur l’interface graphique principale, sous l’unité utilisée.
Pour patcher une cellule cible, cliquez sur le bouton de contrôle de patch pour ouvrir l’interface graphique de contrôle de patch. Cliquez sur le bouton Aller à à côté de la cellule d’intérêt dans la liste de coordonnées de l’interface graphique de position de la mémoire. Ensuite, cliquez sur le bouton CTM de l’unité dans l’interface graphique principale pour activer le mouvement.
Cliquez sur la cellule qui vous intéresse pour déplacer la pointe de la pipette vers la cellule. En raison de la limitation mécanique du manipulateur, lors de déplacements à plus de 500 micromètres, il peut y avoir une légère erreur de positionnement. Pour éviter une erreur de positionnement mécanique importante, un étalonnage secondaire doit être effectué près de la cellule cible.
Ensuite, utilisez le bouton sélectionné par l’unité un pour basculer le signal d’entrée entre les deux unités. Cliquez sur le bouton de correctif dans l’interface graphique de contrôle de correctif. Le correctif automatique commencera et la pression et la résistance pourront être surveillées sur l’interface graphique de contrôle du patch.
L’algorithme de patching automatique surveille la résistance et contrôle la pression à travers une série de boucles logiques, pour former un gigaseal. Une fenêtre contextuelle informe de la formation d’un gigaseal. Le système utilise le changement de résistance pour reconnaître le contact avec la surface de la cellule.
Dans le cas où le contact cellule-surface n’est pas détecté à temps, utilisez le bouton suivant pour faire avancer l’étape de correctif tout en restant dans le même essai de correctif automatique. Manipulez le processus automatique à tout moment en cliquant sur les boutons respectifs de l’interface graphique de contrôle des correctifs. Ensuite, sélectionnez oui pour roder avec la combinaison de Zap et d’aspiration.
Vous pouvez également sélectionner non pour roder avec aspiration uniquement. Ensuite, enregistrez le journal des correctifs de l’expérience. Cette figure montre les emplacements sélectionnés chargés dans l’interface graphique de la séquence de commandes.
La colonne de gauche affiche la liste des coordonnées et la colonne de droite affiche la liste des commandes sous forme de signaux TTL pour chaque emplacement. Voici les captures d’écran lors de l’expérience d’application du médicament, correspondant aux trois emplacements sélectionnés. La solution de KCL a été mélangée à un colorant fluorescent rouge à des fins de visualisation.
La première unité était la pipette contenant KCL et la deuxième unité était la pipette de radouchage. Dans cette figure, les injections de courant de pas montrent un neurone de pointe régulier. Voici les traces d’enregistrement de la pince de tension provenant de l’application locale d’une solution de chlorure de potassium de 500 millimolaires à trois endroits.
La trace rouge avec courant entrant a été enregistrée lors de l’essai lorsque l’application de chlorure de potassium était proche de la cellule du patch. La flèche rouge indique le moment de l’application du chlorure de potassium. En utilisant cette méthode, il est possible d’effectuer un essai de patch clamp en quatre minutes sans formation approfondie par rapport au patching manuel.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’optogénétique, la chimiogénétique et les manipulations pharmacologiques, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions liées à votre projet de recherche. Après son développement, cette technique pourrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer des études à haut débit des récepteurs synaptiques et des canaux ioniques dans différentes préparations in vitro. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des expériences de patch clamp automatisées guidées par image.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode pour mener des expériences de patch-clamp guidées par image automatisées en utilisant une technologie avancée de vision par ordinateur. Cette approche améliore l'efficacité de l'identification et du ciblage des cellules marquées par fluorescence dans des tranches cérébrales aiguës.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Électrophysiologie
- Neuroscience
- Techniques d'imagerie
Contexte
- L'électrophysiologie par patch-clamp est cruciale pour l'étude de l'activité neuronale.
- L'identification et le ciblage de cellules spécifiques peuvent être difficiles.
- Les techniques automatisées peuvent améliorer le débit expérimental.
- Le marquage fluorescent aide à l'identification des cellules.
Objectif de l'étude
- Automatiser la détection des cellules fluorescentes pour les expériences de patch-clamp.
- Augmenter l'efficacité des enregistrements électrophysiologiques.
- Faciliter les criblages pharmacologiques dans les préparations neuronales.
Méthodes utilisées
- Technologie de vision par ordinateur pour la détection des cellules.
- Configuration automatisée de patch-clamp pour l'enregistrement.
- Intégration des processus de détection et d'enregistrement.
- Application à diverses préparations neuronales in vitro.
Résultats principaux
- Automatisation réussie de l'identification cellulaire et du patch-clamp.
- Augmentation du débit pour les expériences électrophysiologiques.
- Applications potentielles dans la recherche pharmacologique.
- Versatilité dans l'application à différents types de cellules.
Conclusions
- Cette technique améliore significativement l'efficacité expérimentale.
- Elle répond aux principaux défis des méthodes traditionnelles de patch-clamp.
- L'approche a des implications pour la recherche sur les troubles neurologiques.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
