Capture interactine d'ARNm à partir de protoplastes végétaux

L’objectif global de cette capture optimisée de l’interactome de l’ARNm est d’isoler et d’identifier un protéome lié à l’ARNm à partir de cellules végétales. Cette méthode est appliquée aux protoplastes du mésophile des feuilles d’arabidopsis thaliana, un type de cellule utilisé comme outil polyvalent dans divers essais cellulaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des implants de régulation génique post-transcriptionnelle, telles que la découverte et la compréhension du rôle des messagers végétaux des protéines de liaison à l’ARN.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler et d’identifier un messager végétal sur un protéome lié directement à partir de l’environnement physiologique. Ainsi, cette méthode peut fournir un aperçu de la protéine liée à l’ARN messager des protoplastes de mésophile de la feuille d’aribidopsis. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes comme les protoplastes ou les tissus d’autres plantes.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué qu’elle avait été appliquée avec succès à des lignées cellulaires de levures et de mammifères. Isoler les protoplastes du mésophile de la feuille d’arabidopsis pour deux échantillons différents, comme décrit dans le protocole textuel. Conservez l’échantillon témoin qui ne sera pas réticulé aux UV ou l’échantillon non CL sur de la glace.

Transférez la suspension de protoplaste à réticuler, ou l’échantillon CL, dans une grande boîte de Pétri. Ajoutez 30 millilitres de solution MMG glacée dans la boîte pour couvrir la surface et étalez les cellules par pipetage doux. Couvrez la boîte de Pétri d’une feuille d’aluminium lorsqu’elle est transportée vers l’appareil de réticulation UV.

Placez immédiatement la boîte de Pétri ouverte dans un appareil de réticulation UV. Assurez-vous que la distance entre la parabole et la lampe UV est de huit centimètres, puis irradiez l’échantillon pendant une minute. Après cela, aliquote rapidement la suspension de protoplaste de la boîte de Pétri dans deux nouveaux tubes à fond rond de 50 millilitres.

Lavez le fond du plat avec cinq millilitres supplémentaires de la solution glacée de MMG pour recueillir le reste des protoplastes. Répartissez la suspension entre les deux tubes. Ensuite, centrifugez les tubes d’échantillon non-CL et les deux tubes d’échantillon CL à 100 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, remettez le tube contenant la pastille non CL sur de la glace. Ajoutez 10 millilitres de solution glacée de MMG dans chaque tube d’échantillon CL et secouez doucement les tubes pour remettre les granulés en suspension. Après avoir combiné les deux échantillons dans un tube à fond rond de 50 millilitres, centrifugez à 100 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, conservez la pastille sur de la glace. Ajoutez ensuite neuf millilitres de tampon de liaison à la lyse glacée à la pastille cellulaire de chaque échantillon. Lyser les protoplastes en pipetant de haut en bas une vingtaine de fois, jusqu’à ce que la solution soit d’une couleur vert clair homogène.

Pour l’homogénéisation, passez le lysat de protoplaste deux fois dans une seringue en verre de 50 millilitres avec une aiguille étroite, puis incubez le lysat sur de la glace pendant dix minutes. Congelez les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu’à trois semaines. Après avoir décongelé le tube avec du lysat de protoplaste congelé à température ambiante, conservez le tube sur de la glace.

Aliquote 1,8 millilitre de billes magnétiques oligo-d(T) dans six nouveaux tubes à centrifuger à fond rond de deux millilitres placés sur de la glace. Lavez la suspension des billes dans chaque tube avec 600 microlitres de tampon de liaison de lyse en pipetant brièvement de haut en bas et faites pivoter doucement les billes sur un rotateur pendant deux minutes. Gardez les perles sur de la glace.

Ensuite, placez les six tubes contenant les billes dans un support magnétique pendant au moins trois minutes pour laisser suffisamment de temps pour la capture magnétique complète. Lorsque les billes sont complètement capturées, la suspension devient claire. Ensuite, jetez le surnageant des six tubes et aliquotez-y immédiatement neuf millilitres de lysat de protoplaste.

Mélangez les billes avec le lysat par pipetage jusqu’à ce que la suspension apparaisse brune et homogène. Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure avec une rotation douce. Après l’incubation, remettez les tubes dans le support magnétique pendant trois minutes.

Lorsque toutes les billes sont capturées sur le côté des tubes, recueillir le surnageant contenant le lysat de protoplaste dans six nouveaux tubes à centrifuger à fond rond de deux millilitres. Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de tampon de lavage glacé à chaque tube contenant des billes et remettez les billes en suspension par pipetage. Après une rotation douce pendant une minute, replacez les tubes dans le support magnétique pendant trois minutes.

Jetez le surnageant et répétez cette étape de lavage une fois. À l’aide de 1,5 millilitre de tampon de lavage glacé deux, répétez deux fois la même procédure de lavage. Si les ARNm ont été efficacement isolés du lysat de protoplaste, il devrait y avoir un halo visible autour de la pastille de bille dans l’échantillon de CL.

Enfin, répétez la procédure de lavage une fois avec 1,5 millilitre de tampon glacé à faible teneur en sel. Après le lavage, ajoutez 500 microlitres de tampon d’élution dans chaque tube et remettez doucement les billes en suspension par pipetage. Incuber à 50 degrés Celsius pendant trois minutes pour libérer l’ARN à queue poly-A.

Remettez doucement les billes en suspension à l’aide d’un pipetage et replacez les tubes dans le support magnétique à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférez et combinez les éluants des six tubes dans un tube à fond conique de 15 millilitres placé sur de la glace. Cela donnera environ trois millimètres de l’éluant.

La qualité et la quantité d’ARN peuvent être déterminées immédiatement à l’aide d’un spectrophotomètre. Préparez les billes d’oligo-d(T) à réutiliser en les lavant deux fois avec un millilitre de tampon d’élution glacé. Après cela, lavez-les avec un millilitre de tampon de liaison de lyse glacé pour ajuster la concentration de sel à 500 millimolaires.

Utilisez ces billes d’oligo-d(T) lavées pour répéter les procédures de liaison, de lavage et d’élution pendant deux tours supplémentaires. Cela épuisera les ARN à queue poly-A du lysat de protoplaste et produira un total de neuf millimètres d’éluant pour chaque échantillon. Les billes peuvent être stockées et utilisées pour une autre expérience jusqu’à un maximum de trois fois.

Pour tester la qualité de l’ARN, digérez les protéines réticulées par UV avec une solution de protéinase K conformément au protocole de texte. Ensuite, purifiez l’ARN à l’aide du kit de purification de l’ARN pour éliminer tous les contaminants résiduels. Après purification, les échantillons sont prêts pour le test de qualité de l’ARN à l’aide de la qRT-PCR.

Commencez par traiter huit millilitres de chaque échantillon avec 100 unités de cocktail d’ARNase contenant de l’ARNase A et de l’ARNase T1. Après un bref vortex, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pour se concentrer, les protéines de liaison à l’ARNm, ou mRBP, filtrent les échantillons à l’aide d’unités de filtration centrifuges. Chaque échantillon donnera 75 microlitres avec deux microgrammes de protéines.

Pour un stockage à long terme, congelez les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Pour faire fonctionner un gel SDS-page, mélangez 25 microlitres de chaque échantillon concentré avec 15 microlitres de colorant de chargement 2X et chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez les échantillons dans un marqueur protéique sur un gel de page SDS avec un gel d’empilement de cinq pour cent et un gel de résolution de douze pour cent.

Ensuite, lavez le gel deux fois avec de l’eau ultra-pure pendant cinq minutes par lavage. Utilisez un kit de coloration à l’argent commercial pour colorer le gel. Si le nombre suffisant de protoplastes de départ a été utilisé, les bandes protéiques apparaîtront dans les cinq minutes.

Pour tester davantage les mRBP, purifiez les peptides à partir d’un deuxième gel de page 1D, comme expliqué dans le protocole de texte. Ces peptides purifiés peuvent maintenant être analysés par chromatographie liquide nanophasée en phase inverse, spectrométrie de masse et protéomique qualitative et quantitative. Après la capture de billes d’oligo-d(T), la qRT-PCR a démontré des niveaux significativement plus élevés d’ARNm de référence de polyubiquitine 10 par rapport à l’ARNr 18S.

Étant donné que les billes d’oligo-d(T) ne se lient qu’à l’ARN à queue poly-A, cela suggère que les ARNm sont enrichis dans l’éluant. La capture des mRBP par des billes d’oligo-d(T) est évaluée plus en détail par un gel SDS-page teinté à l’argent. Le gel présente une quantité de protéines significativement plus élevée dans l’échantillon de CL réticulé par UV par rapport à l’échantillon non CL réticulé.

La durée de l’irradiation UV peut influencer l’efficacité de la réticulation. Ce gel SDS-page teinté d’argent confirme qu’une ou trois minutes d’irradiation UV sont la condition optimale, avec les intensités de bande les plus fortes. Au total, 325 protéines ont été identifiées par analyse protéomique quantitative.

225 de ces protéines étaient inférieures au seuil de signification en raison de la faible abondance de peptides présents pour chaque protéine, avec une grande variabilité des intensités peptidiques. Cependant, comme ils n’ont tous été détectés qualitativement que dans des échantillons CL, ils ont tous été considérés comme des résultats positifs. Ces 325 protéines ont ensuite été classées en trois catégories, les protéines ribosomiques, les RBP principales et les RBP candidates.

Les RBP candidats n’ont pas de domaines de liaison à l’ARN conventionnels et la plupart de leurs rôles n’ont pas été validés, ce qui suggère de nouvelles fonctions possibles dans la régulation de l’ARN. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une semaine si elle est effectuée de manière appropriée. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des voies de régulation moléculaire chez les plantes pour explorer le protéome lié à l’ARN messager à l’échelle du génome dans les cellules et les tissus des dicotylédones et des monocotylédones.