PCR de fusion haute résolution pour le complément du récepteur 1 Polymorphisme de longueur Le génotypage: un outil novateur pour l'évaluation de la sensibilité des gènes de la maladie d'Alzheimer

L’objectif global de cette méthode est de génotyper les polymorphismes de longueur du récepteur 1 du complément pour les utiliser dans l’évaluation de la susceptibilité à des maladies, telles que la maladie d’Alzheimer, afin de mieux comprendre le rôle des isoformes CR1 dans la pathogenèse de la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas d’échantillons de sang frais et qu’elle est plus facile, moins chère, plus rapide et donc applicable à des populations plus larges.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons reconnu les défis liés à la réalisation des Western blots en ce qui concerne le temps nécessaire et la nécessité d’échantillons de sang frais. Pipeter 20 microlitres de protéinase K dans le fond d’un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’échantillon dans le tube.

Ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse à l’échantillon. Mélanger par vortex pulsé pendant 15 secondes. Après le mélange, incuber à 56 degrés Celsius pendant 10 minutes au bain-marie.

Centrifugez brièvement le tube de 1,5 millilitre pour retirer les gouttes de l’intérieur du couvercle. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’éthanol à l’échantillon. Mélangez à nouveau par vortex pulsé pendant 15 secondes avant de centrifuger brièvement le tube comme précédemment.

Ensuite, appliquez soigneusement le mélange sur la colonne à membrane dans un tube de collecte de deux millilitres. Sans mouiller le bord, fermez le capuchon et centrifugez à 6 000 fois G pendant une minute. Placez la colonne à membrane dans un tube de prélèvement propre de deux millilitres et jetez le tube contenant le filtrat.

Ouvrez soigneusement la colonne à membrane et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage sans mouiller le bord. Fermez le capuchon et centrifugez à 6 000 fois G pendant une minute. Ensuite, placez la colonne à membrane dans un tube de collecte propre de deux millilitres et jetez le tube contenant le filtrat.

Après avoir soigneusement ouvert la colonne à membrane, ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage deux sans mouiller le bord. Fermez le capuchon et centrifugez à 20 000 fois G pendant trois minutes. Ensuite, placez la colonne à membrane dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et centrifugez à nouveau.

Après la centrifugation, placez la colonne à membrane dans un tube propre de 1,5 millilitre et jetez le tube de collecte contenant le filtrat. Ouvrez délicatement la colonne à membrane et ajoutez 200 microlitres d’eau distillée. Incuber la colonne à température ambiante pendant cinq minutes avant de centrifuger à 6 000 fois G pendant une minute.

Pour réaliser le protocole HRM-PCR, diluez d’abord les échantillons d’ADN dans des tubes de 1,5 millilitre avec de l’eau à une concentration de 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, diluez les solutions d’amorçage décongelées dans des tubes de 1,5 millilitre avec de l’eau à la même concentration de six micromolaires. Décongelez les solutions de kits HRM-PCR et mélangez soigneusement par vortex pour assurer la récupération de tout le contenu.

Faites tourner brièvement les trois flacons contenant un mélange enzymatique avec un colorant de liaison à l’ADN, du chlorure de magnésium et de l’eau dans une microcentrifugeuse avant de les ouvrir. Dans un tube de 1,5 millilitre à température ambiante, utilisez les composants pour préparer le mélange PCR pour une réaction de 120 microlitres comme décrit dans le protocole de texte. Mélanger soigneusement par vortex.

Il est essentiel que vous travailliez avec attention et application conformément aux bonnes pratiques en biologie moléculaire. Pipette 19 microlitres du mélange PCR dans chaque puits d’une plaque multi-puits blanche. Ajoutez un microlitre de matrice d’ADN ajustée en fonction de la concentration, puis scellez la plaque multipuits blanche avec une feuille d’étanchéité.

Centrifuger la plaque multipuits blanche pendant une minute à 1 500 fois G dans une centrifugeuse à godets oscillants standard contenant un rotor pour plaques multipuits avec des adaptateurs appropriés. Chargez la plaque multipuits blanche dans l’instrument HRM-PCR. Démarrez le programme HRM-PCR avec les conditions de PCR trouvées dans le protocole texte.

Après la réaction HRM-PCR, effectuez une analyse HRM pour déterminer le polymorphisme de longueur CR1 comme décrit dans le protocole texte. Les courbes de fusion ont été analysées à l’aide du logiciel après la fusion à haute résolution des amplicons dérivés de la PCR à partir de l’ADN génomique de sujets présentant différentes isoformes de CR1. Les résultats sont des courbes qui discriminent les sujets en fonction de leurs phénotypes d’expression allotypiques de CR1.

Comme le montrent les deux modes de présentation, les courbes de fusion normalisées et décalées et le tracé des différences normalisées et décalées en température, les profils de courbes sont répartis selon l’étoile CR1 trois, l’étoile CR1 un groupe, l’étoile CR1 un, le groupe étoile CR1 deux, l’étoile CR1 un groupe, l’étoile CR1 groupe deux et l’étoile CR1 deux, CR1 étoile quatre groupe. Ces courbes correspondent aux allèles de polymorphisme de longueur CR1. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de génotyper facilement le polymorphisme de longueur CR1 selon des courbes parfaites obtenues par HRM-PCR.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison du besoin d’échantillons de référence de génotypes de longueur CR1 déjà connus. Lorsqu’elle est maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser la même concentration pour chaque échantillon d’ADN.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage conique de l’ADN peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la découverte d’un nouveau SNP privé connu. Après ce développement, cette technique ouvre la voie à des recherches dans le domaine de la génétique des populations pour explorer la pression sélective des pathogènes dans le polymorphisme de longueur CR1. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la susceptibilité à la pathogenèse de la maladie d’Alzheimer, elle peut également être appliquée à d’autres études de maladies telles que le lupus érythémateux disséminé et le paludisme.