Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d'un muscle squelettique réticulé pour l'immunoprécipitation de la chromatine

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de permettre la préparation de noyaux de haute qualité à partir de muscles squelettiques réticulés, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études d’immunoprécipitation de la chromatine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine musculaire et circadien, telles que les études génomiques utilisant des tissus et des cellules musculaires dans un contexte circadien ou dans un autre contexte sensible au temps. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une réticulation immédiate des échantillons et que la procédure basée sur la filtration peut être menée de manière fiable pour isoler des noyaux de haute qualité avec une contamination minimale par les myofibrilles.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des muscles squelettiques, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les muscles cardiaques et lisses. Peser et émincer le muscle squelettique des membres postérieurs isolé de souris mâles C57 black six âgées d’environ 20 semaines dans une solution saline glacée tamponnée au phosphate, comme décrit précédemment. Placez le tissu musculaire squelettique haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PBS sur de la glace.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 300 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirer avec précaution le surnageant PBS par aspiration. Estimez le volume des granulés dans chaque tube de 50 millilitres en utilisant des tubes de référence avec un, deux, trois et quatre millilitres d’eau.

Ajoutez sept volumes de formaldéhyde à 1 % et de PBS glacés et homogénéisez les échantillons sur de la glace à l’aide d’un homogénéisateur de tissus de sonde. Ensuite, réticulez l’échantillon en l’incubant à température ambiante pendant 10 minutes. Éteindre la réaction de réticulation par l’ajout d’une molaire de glycine à une concentration finale de 0,125 molaire, suivie d’une incubation de cinq minutes à température ambiante.

Après avoir centrifugé l’échantillon à 3 000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, éliminer le surnageant par aspiration. Rincez la pastille en la remettant en suspension dans 10 millilitres de tampon de base glacé contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés. Centrifugez à nouveau l’échantillon et retirez soigneusement le surnageant par aspiration.

Ensuite, mettez la pastille en suspension dans six millilitres de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés. Transférez l’échantillon dans un homogénéisateur Dounce de 15 millilitres pré-refroidi et incubez pendant 10 minutes sur de la glace. Homogénéiser chaque échantillon sur de la glace en 15 coups lents à l’aide d’un pilon lâche suivis de 15 coups avec un pilon bien serré pour libérer les noyaux.

Les étapes de filtration suivantes sont la clé de l’isolation des noyaux de haute qualité. Filtrez l’homogénat à travers une crépine cellulaire et rincez avec quatre millilitres de tampon de lyse. Ensuite, centrifugez les échantillons à 1 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de tampon à base glacée et dénoncez 10 fois avec un pilon étanche pour libérer les noyaux. Filtrez ensuite la suspension à travers une passoire à cellules et rincez le tube avec deux millilitres de tampon de base et filtrez à nouveau. Répétez la filtration avec des filtres à cellules dont la taille des pores est progressivement réduite.

Enfin, centrifugez à 1 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de base avant de centrifuger à nouveau. Jetez le surnageant et conservez la pastille à moins 80 degrés Celsius.

Décongelez les échantillons dans 500 microlitres de tampon de lyse SDS et mettez-les en suspension avec un pipetage doux. Transférez la suspension d’ADN des noyaux dans un flacon en verre sur de la glace. Le choix de la bonne plate-forme et de la bonne condition de sonication est essentiel pour la préparation de la chromatine à partir de noyaux isolés.

Exécutez la sonication avec des rafales ciblées d’énergie acoustique ultrasonore à partir d’un transducteur en forme de disque en utilisant les paramètres décrits dans le protocole texte. Transférez la chromatine soniquée dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez à 12 000 fois g pendant 15 minutes et transférez le surnageant dans un nouveau tube.

Ensuite, transférez 50 microlitres de l’échantillon soniqué dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pour une réticulation inverse pendant la nuit à 65 degrés Celsius. La récolte des échantillons d’ADN est décrite dans la section suivante. Après l’évaluation de la sonication et de la quantification comme décrit dans le protocole de texte, aliquote la chromatine décongelée à environ 100 à 120 microgrammes par tube.

Diluez ensuite la chromatine de un à 10 avec un tampon d’immunoprécipitation. Ensuite, ajoutez 40 microlitres d’une suspension à 50 % de protéines pré-bloquées BSA, d’agarose HE ou de billes IgY et incubez sur un rotateur pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Après avoir centrifugé l’échantillon à 1 000 fois g pendant 10 minutes, transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes.

Ajoutez ensuite des anticorps à raison d’un microgramme d’anticorps pour 25 à 100 microgrammes d’ADN chromainien. Tournez doucement pendant la nuit à quatre degrés Celsius et environ 15 tr/min. Ajoutez ensuite 10 microlitres de protéines pré-bloquées BSA, d’HE, d’agarose ou de billes IgY et mélangez.

Faites pivoter la suspension de la perle dans la chambre froide pendant deux heures. Ensuite, lavez les billes avec un tampon RIPA suivi d’un tampon à haute teneur en sel, d’un tampon de chlorure de lithium et de Tris EDTA comme indiqué dans le protocole texte. Après le lavage, éluer l’ADN des billes en centrifugeant d’abord à 1 000 fois g pendant une minute et en retirant soigneusement le surnageant.

Remettez les billes en suspension avec 50 microlitres de tampon d’élution. Ensuite, incubez pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius. Après l’incubation, centrifuger à 12 000 fois g pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant et ajoutez encore 50 microlitres de tampon d’élution avant de centrifuger à nouveau à 12 000 fois g pendant cinq minutes. Le volume d’élution final sera de 100 microlitres. Pour inverser la réticulation et effectuer l’élution de l’ADN, incubez d’abord la chromatine éluée pendant la nuit à 65 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite un microlitre de RNase A avant d’incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Par la suite, incubez avec huit microlitres de protéase K de 10 milligrammes par millilitre pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius. Récoltez l’ADN à l’aide d’un kit de nettoyage PCR d’un volume d’élution de 50 microlitres selon le protocole du fabricant.

Enfin, analysez les profils par QPCR en temps réel comme décrit précédemment. La filtration séquentielle a permis d’éliminer efficacement les débris tissulaires. Des images représentatives d’échantillons après la filtration initiale et après la filtration en série sont présentées ici à des fins de comparaison.

Le déchiquetage progressif de la chromatine à travers 10 cycles de sonication est révélé par l’utilisation d’un gel d’agarose. 10 cycles de sonication avec la chromatine digérée ont donné un ADN d’environ 500 paires de bases. Ici, des résultats QPCR représentatifs pour les mâles B un chIP avec des échantillons de muscles squelettiques de souris collectés à ZT6 et ZT18 sont présentés.

L’analyse des éléments de localisation de Dbp sur le gène Dbp a révélé que, conformément aux résultats précédents, la liaison atteint des pics autour de ZT6. Une fois maîtrisée, la préparation des noyaux peut se faire en cinq à six heures si elle est effectuée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser les méthodes basées sur la filtration pour purifier les noyaux de haute qualité et l’ADN de la chromatine à partir de tissus musculaires réticulés.

Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de conserver les échantillons sur de la glace ou dans une chambre froide et de conserver les aliquotes des échantillons pour une vérification microscopique avant et après les étapes de filtration. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la muscle et de la génomique pour explorer la dynamique circadienne ou sensible au temps de l’interaction chromatine-protéine dans divers tissus musculaires. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que le séquençage chIP peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la recherche de modèles de liaison du facteur de transcription dans les tissus musculaires.