Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d'un muscle squelettique réticulé pour l'immunoprécipitation de la chromatine

L'objectif général de cette procédure expérimentale est de permettre la préparation de noyaux de haute qualité à partir de muscles squelettiques réticulés, qui peuvent ensuite être utilisés pour des études de immunoprécipitation de chromatine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine musculaire et circadien, notamment des études génomiques utilisant des tissus et cellules musculaires dans un contexte circadien ou autre sensible au temps. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une réticulation immédiate des échantillons et que la procédure basée sur la filtration peut être réalisée de façon fiable pour isoler des noyaux de haute qualité avec une contamination minimale par les myofibrilles.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le muscle squelettique, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, tels que les muscles cardiaques et lisses. Peser et hacher le muscle squelettique des membres postérieurs isolé de souris mâles C57 black six âgées d'environ 20 semaines dans du tampon salin phosphate froid, comme décrit précédemment. Placer le tissu musculaire squelettique haché dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PBS placé sur de la glace.

Ensuite, centrifugez l'échantillon à 300 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez soigneusement le surnageant de PBS par aspiration. Estimez le volume du culot dans chaque tube de 50 millilitres en utilisant des tubes de référence contenant un, deux, trois et quatre millilitres d'eau.

Ajouter sept volumes de paraformaldéhyde à 1 % dans du PBS glacé et homogénéiser les échantillons sur glace à l’aide d’un homogénéisateur à sonde. Ensuite, réaliser la réticulation de l’échantillon en incubant à température ambiante pendant 10 minutes. Arrêter la réaction de réticulation par l’ajout de glycine à une concentration finale de 0,125 M, suivie d’une incubation de cinq minutes à température ambiante.

Après centrifugation de l'échantillon à 3 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, éliminer le surnageant par aspiration. Rincer le culot en le resuspendant dans 10 millilitres de tampon de base froid contenant des inhibiteurs de protéases fraîchement ajoutés. Centrifuger à nouveau l'échantillon et retirer soigneusement le surnageant par aspiration.

Ensuite, resuspendre le culot dans six millilitres de tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéases ajoutés fraîchement. Transférer l'échantillon dans un homogénéisateur Dounce de 15 millilitres pré-refroidi et incuber 10 minutes sur glace. Effectuer l'homogénéisation Dounce de chaque échantillon sur glace avec 15 mouvements lents à l’aide d’un pilon lâche, suivis de 15 mouvements avec un pilon serré, afin de libérer les noyaux.

Les étapes de filtration suivantes sont essentielles à l'isolement de noyaux de haute qualité. Filtrer l'homogénat à l'aide d'un tamis cellulaire et rincer avec quatre millilitres de tampon de lyse. Puis centrifuger les échantillons à 1 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Resuspendre le culot dans cinq millilitres de tampon de base froid et effectuer 10 homogénéisations avec un pilon ajusté pour libérer les noyaux. Filtrer ensuite la suspension à travers un tamis cellulaire et rincer le tube avec deux millilitres de tampon de base, puis filtrer à nouveau. Répéter la filtration à l’aide de tamis cellulaire dont la taille des pores diminue progressivement.

Enfin, centrifuger à 1 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 500 microlitres de tampon de base avant de centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant et conserver le culot à moins 80 degrés Celsius.

Décongeler les échantillons dans 500 microlitres de tampon de lyse SDS et resuspendre par pipetage doux. Transférer la suspension d'ADN nucléaire dans un flacon en verre placé sur de la glace. Le choix de la plateforme et des conditions de sonication est crucial pour la préparation de la chromatine à partir de noyaux isolés.

Faites fonctionner la sonication avec des impulsions focalisées d'énergie acoustique ultrasonique provenant d'un transducteur en forme de disque en utilisant les paramètres décrits dans le protocole écrit. Transférez la chromatine soniquée dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifugez à 12 000 ×g pendant 15 minutes et transférez le surnageant dans un nouveau tube.

Ensuite, transférez 50 microlitres de l'échantillon soniqué dans un nouveau tube de 1,5 millilitre pour une réversion des réticulations pendant la nuit à 65 degrés Celsius. La récupération des échantillons d'ADN est décrite dans la section suivante. Après évaluation de la sonication et de la quantification comme décrit dans le protocole textuel, aliquotez la chromatine décongelée à environ 100 à 120 microgrammes par tube.

Ensuite, diluez la chromatine au 1/10 avec du tampon d'immunoprécipitation. Ajoutez ensuite 40 microlitres d'une suspension à 50 % d'agarose HE protéine prébloquée à l'albumine sérique bovine ou de billes IgY et incubez pendant trois heures sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius. Après centrifugation de l'échantillon à 1 000 ×g pendant 10 minutes, transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes.

Ensuite, ajoutez des anticorps à raison d'un microgramme d'anticorps pour 25 à 100 microgrammes d'ADN chromatinien. Incubez en rotation douce toute la nuit à quatre degrés Celsius et environ 15 tr/min. Ajoutez ensuite 10 microlitres de protéine HE agarose ou de billes IgY prébloquées avec de l'albumine sérique de bovin (BSA) et mélangez.

Faites tourner la suspension de billes dans la chambre froide pendant deux heures. Ensuite, lavez les billes avec du tampon RIPA, suivi d’un tampon à haute teneur en sel, d’un tampon au chlorure de lithium et d’un tampon Tris EDTA, comme indiqué dans le protocole écrit. Après le lavage, éluerez l’ADN des billes en centrifugant d’abord à 1 000 ×g pendant une minute et en retirant soigneusement le surnageant.

Resuspendre les billes avec 50 microlitres de tampon d'élution. Incuber ensuite pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius. Après l'incubation, centrifuger à 12 000 ×g pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant et ajouter 50 microlitres supplémentaires de tampon d'élution avant de centrifuger à nouveau à 12 000 ×g pendant cinq minutes. Le volume final d'élution sera de 100 microlitres. Pour inverser la réticulation et effectuer l'élution de l'ADN, incuber d'abord la chromatine élutée toute la nuit à 65 degrés Celsius.

Ensuite, ajouter un microlitre de RNase A avant d'incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Puis, incuber avec huit microlitres de protéase K à 10 milligrammes par millilitre pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius. Récupérer l'ADN en utilisant un kit de purification PCR avec un volume d'élution de 50 microlitres, conformément au protocole du fabricant.

Enfin, analyser les profils par QPCR en temps réel comme décrit précédemment. La filtration séquentielle a efficacement éliminé les débris tissulaires. Des images représentatives d'échantillons après la filtration initiale et après filtration en série sont présentées ici à titre comparatif.

La dégradation progressive de la chromatine au cours de 10 cycles de sonication est révélée par l'électrophorèse sur gel d'agarose. Dix cycles de sonication avec la chromatine digérée ont produit de l'ADN d'environ 500 paires de bases. Ici, des résultats représentatifs de PCR quantitative pour des mâles B, après une immunoprécipitation de la chromatine (chIP), avec des échantillons de muscle squelettique de souris prélevés à ZT6 et ZT18, sont présentés.

L'analyse des éléments régulateurs de la localisation de Dbp sur le gène Dbp a révélé des pics de fixation cohérents avec les résultats antérieurs, observés vers ZT6. Une fois maîtrisée, la préparation des noyaux peut être réalisée en cinq à six heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser les méthodes basées sur la filtration pour purifier des noyaux et de l'ADN chromatinien de haute qualité à partir de tissu musculaire réticulé.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder les échantillons sur de la glace ou dans une chambre froide et de conserver des aliquotes d'échantillons pour un contrôle microscopique avant et après les étapes de filtration. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans les domaines de la musculature et de la génomique d'explorer les dynamiques circadiennes ou sensibles au temps des interactions chromatine-protéine dans divers tissus musculaires. À la suite de cette procédure, d'autres méthodes telles que le séquençage après immunoprécipitation de la chromatine (chIP) peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme rechercher des motifs de fixation des facteurs de transcription dans les tissus musculaires.