Name: Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez comment induire des crises épileptiques électroconvulsives chez le rat et fractionner l'hippocampe pour analyser les modifications des protéines postsynaptiques. Cette méthode permet d'étudier la neuroplasticité et les mécanismes synaptiques.

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Les auteurs remercient Dr Eric C. Bolton pour ce qui nous permet d’utiliser sa centrifugeuse pour fractionnement et Dr. Graham H. Diering dans le laboratoire du Dr Richard L. Huganir Université de John Hopkins, pour nous avoir fourni le protocole à petite échelle pour le fractionnement de la PSD.

Toutes les procédures expérimentales, y compris les sujets animaux ont été approuvés par le soin des animaux institutionnels et Comité de l’urbanisme à l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign.
1. Comment entretenir une colonie de rats
<ol><li>Se reproduisent les rats Sprague-Dawley (voir la Table des matières) et les maintenir dans des conditions standards avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et l’accès à la nourriture et l’eau ad libitum.</li>
	<li>Sevrer les ratons à jour après la naissance (P) 28 et les loger dans des groupes de 2 à 4 mâle ou femelle de même portée.</li>
	<li>Marquer les queues de rats mâles avec un marqueur noir permanent non toxique pour l’identification.</li>
	<li>Peser les rats mâles 3 fois par semaine et consigner leurs bodyweights.</li>
</ol>2. Elaboration d’une Machine ECS
<ol><li>À 07:30, désinfecter le banc dans la salle de préparation animale et placer une machine ECS (générateur d’impulsions) sur le banc.</li>
	<li>Place un rat mâle individuel pesant 200-250 g dans une cage propre et vide avec un couvercle. Répéter cela pour tous les rats mâles à traiter avec l’induction de l’ECS. Laissez les rats s’habituer pendant 30 min.</li>
	<li>Alors que les rats sont habituant dans leurs cages, réglez un générateur d’impulsions pour l’induction de l’ECS à la fréquence de 100 pulsations/s, une largeur d’impulsion de 0,5 ms, une durée de choc de 0,5 s et un courant de 55 mA (Figure 1A).</li>
	<li>Préparer le générateur d’impulsions en appuyant sur le bouton « RESET » et veiller à ce que le bouton « Prêt » est allumé. Assurez-vous que les clips d’oreilles ne sont pas attachés à un générateur d’impulsions et puis appuyez sur le bouton « Choc » pendant quelques secondes. Remarque : À ce stade, le générateur d’impulsions est prêt pour l’induction de l’ECS.</li>
	<li>Branchez les clips d’oreille dans le générateur d’impulsions.</li>
</ol>3. induction d’ECS aiguë
Remarque : Voir Figure 1B, panneau supérieur.
<ol><li>Mouiller les clips d’oreille avec du sérum physiologique stérile et s’assurer qu’ils sont saturés.</li>
	<li>Mouiller les oreilles d’un rat avec du sérum physiologique stérile en les enveloppant dans de la gaze imbibée d’une solution saline. Une fois qu’ils sont mouillés, retirez la gaze.</li>
	<li>Attacher un clip par oreille, position au-delà de la bande principale de cartilage.</li>
	<li>Confirmer sur la machine de l’ECS qu’une véritable boucle est établie ; Si ce n’est pas le cas, un message d’erreur ou d’une lecture de « 1 » s’affiche sur l’ordinateur.</li>
	<li>Porter un gant épais, non métalliques. Tout en tenant le rat doucement dans une main gantée, appuyez sur le bouton « Choc » pendant quelques secondes puis relâcher lentement la poignée sur le rat pour observer la saisie. Pour le simulacre « aucune saisie » (NS) contrôlent, gérer le rat identiquement mais ne livrent pas le courant.</li>
	<li>Déconnecter les clips d’oreilles comme clonus commence et enregistrer le comportement de saisie selon une version révisée de la Racine échelle22 qui comprend des « mouvements de la bouche et du visage » (étape 1), « tête hochant la tête » (étape 2), « clonus membre antérieur » (étape 3), « élevage avec clonus membres antérieurs » (étape 4) et « élevage et tombant avec clonus membres antérieurs » (étape 5). La saisie doit durer environ 10 s ; enregistrer la durée de la saisie à l’aide d’une minuterie.</li>
	<li>Fin de saisie, revenir sa cage chez le rat. Surveiller le rat pendant 5 min pour s’assurer de la récupération du rat dans les saisies. Conservez-la séparément logés dans la cage et la cage de retour à la salle de réveil.</li>
	<li>Répétez l’induction d’ECS sur le rat prochaine.</li>
	<li>Surveiller les rats pendant tout le reste de la journée et au moins une fois le matin et une fois dans l’après-midi le lendemain jusqu'à ce qu’ils sont euthanasiés pour des expériences. Remarque : La méthode d’induction de ECS pourrait conduire à des signes cliniques comme un effet secondaire accessoire, qui requiert l’attention. Par exemple, le protocole d’induction ECS pouvait induire des crises qui durent plus de 15 s et cause détresse inutiles aux rats. Dans ce cas, terminez la saisie à l’aide de diazépam (10 mg/kg, i.p.) ou pentobarbital (25 à 30 mg/kg, i.p.). Si les rats développent une détresse respiratoire ou des anomalies comportementales sévères après la cessation de la saisie, les euthanasier par inhalation de dioxyde de carbone suivie par décapitation.</li>
</ol>4. induction d’ECS chronique
Remarque : Voir la Figure 1B, panneau inférieur.
<ol><li>Induire un ECS par jour dans le même temps le matin comme décrit aux étapes 1-3, ci-dessus, pendant sept jours consécutifs.</li>
	<li>Surveiller les rats deux fois le lendemain, ils sont retournés à leur domicile des cages.</li>
</ol>5. homogénéisation et fractionnement de l’hippocampe de Rat
Remarque : Voir la Figure 2.
<ol><li>Préparer un tampon d’homogénéisation fraîches (Solution A) qui contient saccharose de 320 mM, 1 mM EDTA, pyrophosphate de sodium 5 mM, 10 millimètres HEPES pH 7,4, 200 acide okadaïque nM et les inhibiteurs de la protéase. Filtre-stériliser le tampon à l’aide de filtres avec une porosité de 0,22 µm pour filtration sous vide et placez-le sur la glace.</li>
	<li>À un moment donné point suite ECS aiguë ou chronique ECS (Figure 1), euthanasier le rat de CO2 par inhalation pendant 5-10 min, suivie par la décapitation à l’aide d’une guillotine.</li>
	<li>Enlever le cerveau et disséquer l’hippocampe sur la plaque métallique placé sur la glace, comme décrit plus haut23,24.</li>
	<li>Placer deux hippocampe d’un rat sur une culture de tissu de 30 mm plat et les émincer en petits morceaux à l’aide de ciseaux.</li>
	<li>Transférer l’hippocampe hachées dans un homogénéisateur de verre manuel à l’aide d’une pipette 1 mL et ajouter 1 mL de tampon d’homogénéisation glacee (Solution A, point 5.1). Insérez un pilon rond dans un homogénéisateur de verre. L’homogénéisateur de verre est sur la glace, doucement et régulièrement caresser monte et descend sur le pilon 10 à 15 fois pendant 1 min, jusqu'à disparaissent des petits morceaux de tissu hippocampique.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL à l’aide d’une pipette 1 mL et centrifuger l’homogénat à 800 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer le surnageant post-nucléaire (S1 fraction) de la pastille contenant du tissu insoluble et noyaux (fraction P1). Transférer 50 µL et 950 µL de la fraction de S1 à deux tubes de microcentrifuge distinct, nouveau 1,7 mL à l’aide d’une pipette 1 mL et stocker ces tubes sur la glace. Sauver le culot de fraction P1 sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger la fraction de la S1 (950 µL) pendant 10 min à 13 800 x g et 4 ° C pour séparer le surnageant (fraction S2), enrichi avec des protéines cytosoliques soluble, et le culot (fraction P2), enrichie avec des protéines membranaires, y compris les protéines synaptosomes. Transfert de la fraction de S2 à un nouveau microcentrifuge de 1,7 mL à l’aide d’une pipette 1 mL et placez-le sur la glace.</li>
	<li>Resuspendre le culot (fraction P2) dans 498 µL d’eau purifiée glacée à l’aide d’une pipette 1 mL. Ajouter 2 µL de 1 M HEPES (pH 7,4) à l’aide d’une pipette de 20 µL d’obtenir une concentration finale de 4 mM HEPES (pH 7,4). Incuber à 4 ° C avec agitation pendant 30 min. magasin la fraction P2 remises en suspension sur la glace.</li>
	<li>Déterminer la concentration de protéine des fractions S1, S2 et P2 à l’aide d’un test de BCA. Ajouter 50 mM HEPES (pH 7,4) à chacune des fractions à obtenir une concentration de 1 mg/mL et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation, ou traiter la fraction P2 pour isoler le PSD.</li>
</ol>6. isolation du PSD de la Fraction membranaire brute des protéines (P2)
<ol><li>Centrifuger la fraction P2 (500 µL) pendant 20 min à 25 000 x g et 4 ° C pour séparer le surnageant lysé (fraction LS2) et le culot lysé (fraction LP1). La fraction LS2 de transfert dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,7 mL à l’aide d’une pipette 1 mL et placez-le sur la glace.</li>
	<li>Resuspendre le culot de LP1 dans 250 µL de 50 mM HEPES (pH 7,4) mélangé avec 250 µL de 1 % de détergent en 1 x tampon PBS à l’aide d’une pipette de 1 mL. Incuber à 4 ° C, avec une agitation modérée pendant 15 minutes.</li>
	<li>Centrifuger l’extrait concentré de LP1 durant 3 h à 25 000 x g et 4 ° C pour séparer le surnageant (fraction non-PSD) de la pastille (fraction PSD). Retirez le surnageant dans un tube de microcentrifuge de 1,7 mL et Resuspendre le culot PSD dans 100 µL de 50 mM HEPES (pH 7,4) à l’aide d’une pipette de 200 µL.</li>
	<li>Déterminer la concentration de la protéine de la LS2, non-PSD et fractions PSD à un dosage BCA. Ajouter 50 mM HEPES (pH 7,4) à chacune des fractions à obtenir une concentration de 1 mg/mL et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation. Remarque : Toutes les solutions utilisées dans les étapes 5-6 (c.-à-d., Solution A un tampon HEPES et tampon PBS) convient à l’eau purifiée exempte de particules et de contaminants ioniques et organiques.</li>
</ol>7. Western Blot
<ol><li>Décongeler chaque fraction de protéine sur la glace. Transférer 12 µL de chacune des fractions (S2, P2 et PSD à 1 mg/mL) dans un nouveau tube de microcentrifuge de 1,7 mL à l’aide d’une pipette 20 µL.</li>
	<li>Ajouter 3 µL de tampon de SDS x 5 et incuber à 75 ° C pendant 30 min dans un bain d’eau. Laisser refroidir les échantillons à température ambiante (RT).</li>
	<li>Charger 10 µL de l’échantillon de protéine dans chaque puits du gel 4-20 % dégradé peigne 15 puits SDS-polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE) à l’aide d’une pipette 20 µL. Exécutez le gel dans l’appareil de SDS-PAGE et à 80-100 V en tampon (25 mM Tris, glycine de 190 mM et le SDS 0,1 % ; pH 8,3). Remarque : Chaque gel devrait contenir des échantillons de protéine de NS rats et rats ECS à des moments différents après ECS aiguë ou chronique.</li>
	<li>Transfert des protéines de la SDS-PAGE de gel sur une membrane de polyvinyle difluoride (PVDF) dans l’appareil de transfert à 25-30 V (60 mA) pendant 9 à 12 h dans le tampon de transfert (25 mM Tris, glycine de 190 mM et 20 % de méthanol ; pH 8,3).</li>
	<li>Retirer la membrane PVDF de l’appareil de transfert et le laver dans une solution saline tamponnée Tris (SCT) pendant 5 min sur un rotateur multi-usages à température ambiante.</li>
	<li>Bloquer la membrane dans le lait 5 % et 0,1 % Tween-20 au SCT pour 1 h. Incuber il en anticorps primaires (tableau 1) dans le tampon de lavage (lait 1 % et 0,1 % Tween-20 au SCT) durant la nuit sur un rotateur polyvalent à 4 ° C (voir la Table des matières pour les dilutions).</li>
	<li>Laver la membrane 4 fois pendant 10 min chaque dans le tampon de lavage et puis incuber il avec la peroxydase de raifort (HRP)-conjugués Anticorps secondaires au lavage de tampon pendant 1 heure sur un agitateur multi-usages à température ambiante.</li>
	<li>Laver la membrane 4 fois pour chaque 10 min dans le tampon de lavage, puis avec le SCT pendant 5 min.</li>
	<li>Incuber la membrane avec le substrat chemifluorescence améliorée pendant 1 min, puis exposez-le à la radiographie. Développer le film exposé avec un processeur de film.</li>
</ol>8. quantification des transferts Western
<ol><li>Scan du Western blot au format TIFF et enregistrer ce fichier sur l’ordinateur.</li>
	<li>Ouvrir le fichier Western blot dans le programme de ImageJ comme une image en niveaux de gris, sous « Fichier », « Ouvrir l’image, » flèche droite « gris ».</li>
	<li>Choisissez l’outil Sélection rectangulaire dans la barre d’outils ImageJ et dessinez un rectangle qui couvre une bande unique tache occidentale d’une protéine d’intérêt.</li>
	<li>Sous « Analyze », appuyez sur « Mesure » pour obtenir la superficie et la densité moyenne d’un groupe sélectionné.</li>
	<li>Déplacer le rectangle à une zone d’arrière-plan sans changer sa taille et sa forme. Répétez l’étape 8,4 à la superficie et la densité moyenne du fond.</li>
	<li>Soustraire la valeur de la densité moyenne d’une bande de fond de celle d’une bande de Western blot, donne la densité de bande soustraite à l’arrière-plan de la protéine d’intérêt.</li>
	<li>Répétez les étapes 8.2-8,6 pour toutes les bandes Western blot d’intérêt.</li>
	<li>Diviser la densité de la bande de fond-soustrait de la protéine d’intérêt par la densité de la bande de fond-soustrait du produit d’un gène de ménage, tels que le α-tubuline ; Cette étape donne la valeur normalisée de la protéine d’intérêt.</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous décrivons ici une méthode d’induction ECS chez les rats qui provoque la stimulation globale de l’activité neuronale dans leur hippocampe. ECS est un modèle animal de la thérapie par électrochocs, qui est cliniquement utilisé pour traiter les troubles dépressifs réfractaires de drogue chez les humains1,2,3. Malgré l’utilisation de la thérapie par électrochocs pour traiter la dépression grave, le mécanisme sous-jacent précis ...

La thérapie par électrochocs a été utilisée pour traiter les patients atteints de troubles dépressifs majeurs, y compris le sévère dépression résistante aux médicaments, dépression bipolaire, maladies de Parkinson et la schizophrénie1,2. Dans cette thérapie, saisie est généré par des stimulus électrique livré à la tête des patients anesthésiés par l’intermédiaire d’epicranial électrodes1,2,3. L’administration répétée d’ECS a été cliniquement bénéfique pour les troubles dépressifs résistants aux médicaments1,2,3. Cependant, le mécanisme exact qui sous-tendent l’efficacité à long terme de l’effet antidépresseur chez l’homme est resté insaisissable. ECS est un modèle animal de la thérapie par électrochocs et est employé couramment pour examiner son mécanisme thérapeutique. Chez les rongeurs, les ECS aiguë et chronique traitement ECS promouvoir la neurogenèse adulte dans l’hippocampe et réorganiser le réseau neuronal4,5, qui sont susceptibles de contribuer à l’amélioration de la flexibilité cognitive. En outre, une élévation globale de l’activité cérébrale par ECS modifie l’abondance des relevés de notes, comme un cerveau dérivé facteur neurotrophique6et plusieurs protéines dont métabotropiques du glutamate récepteurs 17 et la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) type glutamate récepteurs sous-unités7. Ces changements sont impliqués dans la médiation de modification à long terme du nombre de synapses, structure et force dans l’hippocampe7,8,9.
Dans les modèles ECS, stimulation électrique est livrée aux rongeurs stereotaxically implanté des électrodes, électrodes cornéens ou d’électrodes de l’oreille pour évoquer les crises tonico-cloniques généralisées10,11. L’implantation stéréotaxique d’électrodes implique une chirurgie du cerveau et nécessite beaucoup de temps pour améliorer des compétences chirurgicales pour minimiser les blessures de l’expérimentateur. Moins envahissants électrodes cornéens pourraient causer la sécheresse et à l’abrasion cornéenne et nécessitent une anesthésie. L’utilisation d’électrodes clip oreille permet de contourner ces limitations car il peuvent être utilisés sur les rongeurs sans chirurgie ou anesthésie et causer des blessures minimes. En effet, nous avons constaté qu’actuel des rats livré à éveillé par clip oreille électrodes fiable induit 4-5e étape tonico-cloniques modifie les protéines synaptiques dans leur hippocampe10.
Pour examiner l’abondance induite par l’ECS de protéines synaptiques dans les régions spécifiques du cerveau des rongeurs, il est important de choisir les méthodes expérimentales les plus adaptées pour leur détection et la quantification. Fractionnement subcellulaire du cerveau permet l’isolement brut des protéines cytosoliques solubles ; protéines de la membrane ; protéines d’organelle-limites ; et même des protéines dans des structures subcellulaires spéciaux, tels que le PSD12,13,14. Le PSD est un domaine subcellulaire dense et bien organisé dans les neurones, dans lequel les protéines synaptiques sont fortement concentrés à et près de la membrane postsynaptique12,13,15. L’isolement de la PSD est utile pour l’étude des protéines synaptiques enrichi à la PSD, depuis les changements dynamiques dans l’abondance et la fonction des récepteurs du glutamate postsynaptique, échafaudage protéines et protéines de transduction de signal dans le PSD12 , 15 , 16 , 17 sont en corrélation avec la plasticité synaptique et la synaptopathy observée dans plusieurs troubles neurologiques17,18. Une méthode de fractionnement subcellulaire précédente utilisée pour purifier le PSD a impliqué l’isolement de la fraction insoluble dans le détergent de la fraction membranaire brute du cerveau par la centrifugation différentielle des gradients de sucrose14, 19. la principale difficulté avec cette méthode traditionnelle est qu’elle requiert de grandes quantités de rongeurs brains14,19. Préparation des rongeurs de 10-20 pour isoler la fraction PSD par traitement exige une vaste coût et temps investi et n’est pas réalisable si il existe de nombreux traitements.
Pour relever ce défi, nous avons adapté une méthode plus simple directement isole la fraction PSD, sans saccharose centrifugation en gradient de20,21et a révisé pour être applicables à l’isolement du PSD de l’hippocampe du rat seul cerveau. Notre méthode de fractionnement PSD petit rendements sur 30 à 50 µg de protéines PSD de 2 hippocampe, suffisante pour une utilisation dans plusieurs essais biochimiques, y compris l’immunoprécipitation et éponger occidental. Éponger occidental démontre le succès de notre méthode pour isoler le PSD en révélant l’enrichissement de la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD-95) et de l’exclusion du marqueur présynaptique synaptophysine et protéines cytoplasmiques solubles α-tubuline. Notre induction ECS et les méthodes de fractionnement PSD à petite échelle sont facilement adaptables à d’autres régions du cerveau de rongeurs et offrent un moyen relativement simple et fiable pour évaluer les effets des contraceptifs d’urgence sur l’expression des protéines de la PSD.

<table><tbody><tr><td>Rat Spargue-Dawley</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS fournit</td></tr><tr><td>un générateur d’impulsions</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italie</td><td>57800</td><td>ECS fournit</td></tr> le <tr><td>système de purification d’eau MilliQ</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Fournitures de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Fournitures</td></tr> <tr><td>de fractionnement subcellulaireNa4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368 Alimentations</td> de <td>fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Alimentations de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Alimentations de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Acide okadaïque</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Alimentations de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Stop</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Alimentations de fractionnement subcellulaires</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Alimentations de fractionnement subcellulaires</td></tr><tr><td>EMD Millipore, Sterito Filtres stériles pour bouteilles sous vide,</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Fournitures de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>, Ciseaux Iris,</td><td>WPI (World Precision Instruments)</td><td>500216-G</td><td>Alimentation de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 30 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Alimentation de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Homogénéisateur en verre et un pilon en téflon</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Alimentation de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,7 mL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp ;</td><td>C2170 (1001002)Alimentations</td> <td>de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall Legend XT/XF&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Fournitures de fractionnement subcellulaire</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot fournit</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot fournit</td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td></td>#4561086S <td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Running Tampon</td><td>Fabriqué en laboratoire</td><td></td>, <td>Western blot fournit.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cellule d’électrophorse verticale Mini-PROTEAN Tetra pour gels MiniPrecast, 4 gels</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot fournit</td></tr><tr><td>une membrane en difluorure de polyvinyle (PVDF)&nbsp ;</td>Tampon de transfert de <td>fournitures de transfert Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western</td></tr><tr><td>Fabriqué</td><td>en laboratoire</td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td> Western <td>blot supplies</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Dodecyl sulfate</td><td>de sodium SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Methanol&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot fournit le</td></tr><tr>détergent<td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>pour l’isolation PSD</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&nbsp ;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Lait écrémé instantané en poudre</td><td>d’un excellent rapport qualité-prix</td><td></td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>rotateur polyvalent.</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot fournit le</td></tr><tr><td>film d’autoradiographie Hyblot CL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&nbsp ;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot fournit</td></tr><tr><td>un substrat de chimifluorescence amélioré&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot fournit</td></tr><tr><td>un processeur de film Konica SRX-101A</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot fournit</td></tr><tr><td>Nom de l’anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>Dilution de l’anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, température de réaction = 4 &deg ; C, Espèce hôte = Signalisation</td></tr><tr><td>cellulaire</td> de<td>la synaptophysine</td> de lapin<td>#4329</td><td>Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 &deg ; C, Espèce hôte =</td></tr><tr><td>Alpha-Tubulin</td><td>de lapin Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 &deg ; C, Espèce hôte = Souris</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 &deg ; C, Espèce hôte =</td></tr><tr><td>Souris GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 &deg ; C, Espèce hôte = Lapin</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Dilution des anticorps = 1:200 - 500, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 &deg ; C, Espèce hôte =</td></tr><tr><td>Peroxidas de souris AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>Dilution des anticorps = 1:2 000-5 000, temps = 1 h, température de réaction = RT, espèce hôte = Peroxidas d’âne</td></tr><tr><td>AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>Dilution des anticorps = 1:2 000-5 000, temps = 1 h, température de réaction = RT, espèce hôte = âne</td></tr></tbody></table>

par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced changes in densité postsynaptique protéines

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs, le traitement le plus efficace pour la dépression sévère. ECS provoque des crises tonico-cloniques généralisées avec faible taux de mortalité et de la mort neuronale et est un modèle répandu aux médicaments anti-épileptiques écran. Nous décrivons ici une méthode d’induction de ECS dans lequel un courant 55-mA brève est livré pendant 0,5 s mâle rats poids via des électrodes clip oreille de 200-250 g. Cette stimulation bilatérale produite étape 4-5 crises cloniques qui a duré environ 10 s. Après la cessation des ECS aiguë ou chronique, la plupart des rats récupérés pour être distinguée sur le plan comportemental de simulacre de rats « aucune saisie ». Parce que ECS augmente globalement l’activité cérébrale, il a également servi à examiner des altérations liées à l’activité des protéines synaptiques et leurs effets sur la force synaptique en utilisant plusieurs méthodes. En particulier, fractionnement subcellulaire de la densité postsynaptique (PSD) en combinaison avec le Western Blot permet la détermination quantitative de l’abondance des protéines synaptiques à cette structure synaptique spécialisée. Contrairement à une méthode de fractionnement précédent nécessitant une grande quantité de rongeurs cerveaux, nous décrivons ici une méthode de fractionnement à petite échelle afin d’isoler le PSD de l’hippocampe du rat seul, sans la centrifugation en gradient de saccharose. En utilisant cette méthode, nous montrons que la fraction PSD isolée contienne des protéines de la membrane postsynaptique, notamment PSD95, GluN2B et GluA2. Marqueur présynaptique synaptophysine et tubuline α des protéines cytoplasmiques solubles ont été exclues de la fraction PSD, ce qui démontre la réussite de l’isolement PSD. En outre, ECS chronique a diminué l’expression de la GluN2B dans le PSD, indiquant que notre méthode de fractionnement PSD à petite échelle peut être appliqué afin de détecter les changements dans les protéines PSD hippocampe de rat seul après traitements génétiques, pharmacologiques ou mécaniques .

À l’aide de la procédure détaillée présentée ici, un choc électrique (55 mA, 100 impulsions/s pendant 0,5 s) livrés par clip oreille électrodes induits non récurrente stade 4-5 tonico-cloniques chez les rats (Figure 1A-B). Un total de 8 des rats a reçu aiguë induction ECS et affiche 4-5e étape tonico-cloniques. Les saisies a duré environ 10 s et tous les rats récupérés dans les 1-2 min de la cessation de la saisie. Les rats SHAM « aucune sais...

Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs pour dépression sévère. ECS dans le monde stimule l’activité dans l’hippocampe, conduisant à la synaptogénèse et la plasticité synaptique. Nous décrivons ici les méthodes pour l’induction de ECS chez les rats et pour fractionnement subcellulaire de leur hippocampe pour examiner les changements induits par saisie en protéines synaptiques.

Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

L'objectif général de l'induction de crises électroconvulsives et de la fractionnation subséquente à petite échelle de l'hippocampe est d'induire une activité épileptique généralisée dans le cerveau du rat et d'examiner les altérations des protéines induites par les crises dans la densité postsynaptique de l'hippocampe. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant les processus neuronaux de l'épilepsie, telles que les protéines synaptiques régulées dans des régions cérébrales spécifiques lors d'une crise, et si cette régulation peut contribuer à la neuroplasticité. Le principal avantage de ce protocole d'induction de crises électroconvulsives est qu'il permet d'induire de manière fiable une activation cérébrale généralisée à faible dose sans mort neuronale.La démonstration de la procédure sera réalisée par moi-même et Han Gil Jeong du laboratoire du Dr Hee Jung Chung. Pour commencer cette procédure, placez un rat mâle dans une cage propre et vide munie d'un couvercle. Laissez le rat s'habituer pendant 30 minutes, puis configurez le générateur d'impulsions pour l'induction de la SEC.Préparez le générateur d'impulsions en appuyant sur le bouton de réinitialisation et assurez-vous que le bouton « prêt » est allumé. Vérifiez que les pinces auriculaires ne sont pas branchées au générateur d'impulsions. Ensuite, appuyez sur le bouton de choc pendant quelques secondes, puis branchez les pinces auriculaires sur le générateur d'impulsions.À cette étape, humidifiez les pinces auriculaires avec du sérum physiologique stérile et assurez-vous qu'elles sont complètement saturées. Ensuite, humidifiez les oreilles du rat avec du sérum physiologique en les enveloppant dans une gaze imbibée de sérum physiologique. Une fois les oreilles humides, retirez la gaze.Attacher les pinces aux oreilles, une pince par oreille, en les positionnant au-delà de la bande principale de cartilage. Appuyer sur le bouton de choc pendant quelques secondes et observer la crise. Pour le traitement factice, sans crise, traiter le rat de la même manière, mais ne pas délivrer de courant.Lorsque le clonus commence, débranchez les pinces d'oreille et enregistrez le comportement convulsif selon une échelle de Racine modifiée allant de un à cinq. Cela inclut le redressement avec clonus des quatre membres au stade quatre, et le redressement avec chute accompagné de clonus des quatre membres au stade cinq. La crise doit durer environ 10 secondes.Enregistrez la durée de la crise à l'aide d'un chronomètre. Après la fin de la crise, remettez le rat dans sa cage d'origine. Surveillez le rat pendant cinq minutes supplémentaires afin de vous assurer de sa récupération suite aux crises.Le maintenir logé individuellement dans la cage et replacer la cage dans la salle de récupération. Dans cette procédure, placer deux hippocampes provenant d'un même rat dans une boîte de culture tissulaire de 30 millimètres et les hacher en petits morceaux à l'aide de ciseaux. Ensuite, transférer les hippocampes hachés dans un homogénéisateur manuel en verre et ajouter un millilitre de tampon d'homogénéisation glacé.Ensuite, insérez un crayon rond dans un homogénéisateur en verre. Tout en maintenant l'homogénéisateur en verre sur de la glace, effectuez doucement et régulièrement des mouvements de va-et-vient sur le crayon, de 10 à 15 fois pendant une minute, jusqu'à ce que les petits morceaux de tissu hippocampique disparaissent. Puis, transférez l'homogénat dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL à l'aide d'une pipette de 1 mL et centrifugez l'homogénat à 800 ×g pendant 10 minutes à 4 °C pour séparer le surnageant post-nucléaire du culot contenant les tissus insolubles et les noyaux.Ensuite, transférez 50 microlitres et 950 microlitres de la fraction S1 dans deux nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,7 millilitre distincts et conservez ces tubes sur de la glace. Conservez également le culot de la fraction P1 sur de la glace. Par la suite, centrifugez la fraction S1 de 950 microlitres pendant 10 minutes à 13 800 × g et à 4 degrés Celsius afin de séparer le surnageant enrichi en protéines solubles cytosoliques du culot enrichi en protéines liées aux membranes, incluant les protéines synaptosomales.Transférez la fraction S2 dans un nouveau microcentrifugeur de 1,7 millilitre et conservez-la sur de la glace. Ensuite, resuspendez le culot de la fraction P2 dans 498 microlitres d'eau purifiée glacée. Ajoutez deux microlitres de HEPES à une molaire afin d'obtenir une concentration finale de quatre millimolaire de HEPES.Incuber la suspension à quatre degrés Celsius avec agitation pendant 30 minutes. Après 30 minutes, conserver la fraction P2 resuspendue sur de la glace. À cette étape, centrifuger la fraction P2 pendant 20 minutes à 25 000 × g et à quatre degrés Celsius afin de séparer le surnageant lysé du culot lysé.Transférez la fraction LS2 dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 millilitre et conservez-la sur de la glace. Ensuite, resuspendez le culot LP1 dans 250 microlitres de heeps à 50 millimolaire, mélangés avec 250 microlitres de détergent à un pour cent et 1 X PBS. Incubez la suspension à quatre degrés Celsius avec agitation douce pendant 15 minutes.Ensuite, centrifuger le culot LP1 resuspendu pendant 3 heures à 25 000 ×g et à 4 degrés Celsius afin de séparer le surnageant, fraction non PSD, du culot, fraction PSD. Transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre et resuspendre le culot PSD dans 100 microlitres de 50 millimolaire de HEPES. Sur cette figure, les immunoblottings représentatifs montrent l'expression protéique de la sous-unité réceptrice NMDA GluN2B, du récepteur AMPA GluA2 et de STEP 61 dans les fractions S2, P2 et PSD provenant des hippocampes de rats témoins (sham), sans crise, et de rats ayant reçu une ECS aiguë.La protéine cytoplasmique soluble alpha-Tubuline est enrichie dans la fraction S2. La synaptophysine est une protéine des vésicules pré-synaptiques et est enrichie dans la fraction P2 des membranes brutes, mais pas dans la fraction PSD, tandis que la PSD-95 est enrichie à la fois dans les fractions P2 et PSD. Sont représentées ici la quantification de GluN2B et de GluA2 dans les fractions P2 et PSD à trois et 24 heures après un ECS aigu.L'expression de GluN2B et de GluA2 dans la fraction P2 a été normalisée à celle de l'alpha-Tubuline dans la fraction S2. Pour l'expression de GluN2B et de GluA2 dans la fraction PSD, la normalisation a été effectuée par rapport à PSD 95 dans la fraction PSD. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq à six heures si elle est effectuée correctement.Après avoir suivi cette procédure, une analyse automatisée de type spectrométrie de masse, fondée sur la composition protéique, peut être réalisée afin de répondre à des questions complémentaires, telles que quels autres protéines synaptiques sont modifiées par la SÉC. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des maladies neurologiques pour explorer les mécanismes sous-jacents aux dysfonctionnements synaptiques, dans le but d’étudier les modèles murins, les moteurs transgéniques des maladies neurologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire la SÉC chez les modèles murins, de réaliser l'homogénéisation et la fractionnement de la PSD à partir des hippocampes, ainsi que d'examiner les modifications des protéines synaptiques après la SÉC.

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Cette vidéo montre l’enregistrement électroencéphalographique (EEG) de crises d’épilepsie chez des rats induits par l’épilepsie. Un rat avec des électrodes implantées dans l’hippocampe ventral est connecté au système d’enregistrement EEG et placé dans une chambre en plexiglas. Le rat est autorisé à se déplacer librement pendant que l’activité cérébrale est enregistrée pour surveiller l’apparition de crises.

Enregistrement électroencéphalographique des crises d’épilepsie chez des rats induits par l’épilepsie

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Évaluation des niveaux de neurotransmetteurs excitateurs chez les rats induits par l’épilepsie chronique

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Induction d’une crise électroconvulsive aiguë dans un modèle de rat

Cette vidéo présente les procédures de préparation, d’enregistrement et d’analyse de source d’EEG à haute résolution sur des rats sous sédation avec un modèle préclinique particulier d’épilepsie focale dans des conditions non invasives.

Cerveau Imaging Source dans des modèles précliniques de Rat épilepsie focale utilisant haute résolution EEG Recordings

Ce protocole détaillé décrit le placement des électrodes stimulation transcrânienne sur l’OS temporal afin d’étudier les effets à court et à long terme de stimulation électrique transcranienne en se déplaçant librement des rats.

La Stimulation électrique chronique transcrânienne et Intracortical enregistrement chez le rat

Nous illustrons comment effectuer une modulation électrique et d’enregistrement de l’activité épileptiforme induite par la 4-aminopyridine dans des tranches de cerveau de rongeurs à l’aide de matrices de microélectrodes. Une chambre d’enregistrement personnalisé maintient le tissu viabilité tout au long des sessions expérimentales prolongées. Cartographie de l’électrode en direct et sélection des paires stimulants sont effectuées par une interface utilisateur graphique personnalisée.

Enregistrement et Modulation de l’activité épileptiforme dans des tranches de cerveau rongeur couplé aux baies de microélectrodes

Modèles de crise aiguë sont importantes pour étudier les mécanismes qui sous-tendent les manifestations épileptiformes. En outre, la capacité de générer des événements épileptiforme sur demande fournit une méthode très efficace pour étudier le déroulement exact des événements qui sous-tendent leur initiation. Nous décrivons ici les modèles de saisie corticale aiguë 4-aminopyridine établies dans la souris et de tissus humains.

Génération et sur demande d’Initiation dactivité Ictal aiguë de rongeurs et de tissus humains

Nous décrivons ici une méthode pour en vivo microdialyse analyser le communiqué de l’aspartate et du glutamate dans l’hippocampe ventral de rats épileptiques et non-épilepsie, en combinaison avec des enregistrements EEG. Les concentrations extracellulaires de l’aspartate et le glutamate peuvent être corrélées avec les différentes phases de la maladie.

Microdialyse d’acides aminés excitateurs durant les enregistrements EEG en se déplaçant librement des Rats

Le défi de la recherche sur l’épilepsie est de développer de nouveaux traitements pour les patients où la thérapie classique est insuffisante. En utilisant un nouveau protocole — avec l’aide d’un système implantables de délivrance de médicaments — nous sommes en mesure de contrôler les saisies chez les souris anesthésiées par l’administration électrophorétique du GABA dans la mise au point épileptique.

L’administration électrophorétique de l’acide γ-aminobutyrique (GABA) dans la mise au point épileptique prévient les crises de souris

Le protocole présenté décrit le transport et la préparation du tissu hippocampal humain réséqué dans le but ultime d’utiliser des tranches vitales du cerveau comme outil d’évaluation préclinique pour les substances antiépileptiques potentielles.

Préparation de tranches d’hippocampe humaine aiguë pour les enregistrements électrophysiologiques

Ce rapport décrit les méthodes permettant de générer un modèle d’épilepsie du lobe temporal basé sur l’allumage électrique de souris transgéniques VGAT-Cre. Les souris VGAT-Cre allumées peuvent être utiles pour déterminer les causes de l’épilepsie et pour dépister de nouvelles thérapies.

Préparation et implantation d’électrodes pour allumer électriquement des souris VGAT-Cre afin de générer un modèle pour l’épilepsie du lobe temporal

Découvrez comment induire des crises épileptiques électroconvulsives chez le rat et fractionner l'hippocampe pour analyser les modifications des protéines postsynaptiques. Cette méthode permet d'étudier la neuroplasticité et les mécanismes synaptiques.

Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines (Vidéo) | JoVE Journal

Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines

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