Name: Greffe de la tumeur dans un modèle murin de xénogreffe de lymphome du manteau homme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez comment établir un modèle de xénogreffe murin pour le lymphome du manteau afin d'étudier les effets thérapeutiques in vivo sur des cellules dérivées de patients.

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Ce travail a été soutenu par la Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr Dubois Ferrière Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 et 2914-02-2012 et Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 et 310030-153456.

Les échantillons de sang humain ont été utilisés conformément aux procédures approuvées par l’éthique locale et les comités de l’expérimentation humaine de l’hôpital universitaire de Genève.
Procédures d’animaux ont été effectuées conformément à l’institutionnel éthique Comité of Animal Care à Genève (Suisse) et l’Office vétérinaire Cantonal (numéro d’autorisation : GE/26/15).
1. préparation des cellules mononucléaires de sang périphérique primaire (PBMC) par séparation Gradient de densité
Remarque : 3 à 5 mL de sang périphérique provenaient de patients qui présentent des MCL dans une phase leucémique. Le diagnostic a été établi selon les critères de diagnostique pour la cytométrie en flux (CD5 +, CD23−, CD200 +, population monoclonale de lymphocytes B) et par la suite confirmé par la présence de la translocation chromosomique t(11;14) et la surexpression de la cycline D1. Dans tous les cas, les cellules B monoclonales constituaient à > 90 % de la population totale des cellules B. Les cellules restantes étaient principalement des monocytes et des lymphocytes T.
<ol><li>Diluer 5 mL (1:1) de l’échantillon de sang MCL avec 5 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Figure 1 a).</li>
	<li>Inverser les médias de gradient de densité (Table des matières) plusieurs fois avant de l’utiliser afin d’assurer un mélange complet.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de média gradient de densité dans un tube à centrifuger 15 mL à l’aide d’un aspirateur de pipette.</li>
	<li>La couche doucement l’échantillon de sang dilué sur les médias de gradient de densité dans le tube à centrifuger 15 mL à l’aide d’un aspirateur (le sang à rapport de médias de gradient de densité devrait être de 2:1, par exemple, 10 mL de sang à 5 mL de média gradient de densité). Il faut pour pas mélanger les deux calques (Figure 1 b, C).</li>
	<li>Centrifuger l’échantillon à 400 g pendant 40 minutes à température ambiante avec les freins de la centrifugeuse est éteint.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, aspirez doucement la couche intermédiaire (anneau blanchâtre et mince marqué d’une flèche (Figure 1, E As EventArgs)) contenant les cellules mononucléaires et transférez-les dans un tube propre.</li>
	<li>Lavage des cellules mononucléaires<ol>
<li>Estimer le volume de la suspension cellulaire transféré et y ajouter 3 volumes de stérile 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA).</li>
		<li>La composition de la suspension de pipetage et descendre plusieurs fois.</li>
		<li>Centrifuger la suspension à 400-500 g pendant 10-15 min à température ambiante.</li>
		<li>Jeter le surnageant pour obtenir le culot cellulaire et répéter l’étape de lavage.</li>
		<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le volume souhaité, par exemple, 1 ou 2 mL de PBS.</li>
		<li>Compter le nombre de cellules par un compteur de cellules automatisées ou manuellement à l’aide d’un hémocytomètre (chambre de Neubauer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. l’enrichissement des cellules B par sélection négative de lymphocytes B
<ol><li>Diluer les cellules à une concentration finale de 50 x 106 cellules/mL dans du PBS.</li>
	<li>Transférer les cellules dans un tube polystyrène fond rond de 5 mL. Ajouter 100 µL d’anticorps cocktail de la trousse d’enrichissement de lymphocytes B à 2 mL de suspension cellulaire et mélanger doucement en pipettant également, haut et bas (Figure 2-1).</li>
	<li>Incuber les cellules à température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Brièvement vortex les particules magnétiques fourni dans le kit de l’enrichissement de lymphocytes B pour 30 s (Figure 2-2). Ajouter 150 µL des particules magnétiques à 2 mL de l’échantillon.</li>
	<li>Incuber l’échantillon pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Porter le volume de l’échantillon à 2,5 mL avec 1 x PBS contenant 2 % de sérum de veau foetal (FCS) et de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM. Placer le tube dans l’aimant et incuber le tube pendant 3-5 min (Figure 2-3).</li>
	<li>Ramasser l’aimant avec le tube en place et, d’autre part, dans un mouvement continu, décanter le tube pour que la suspension cellulaire enrichi est recueillie dans un nouveau tube (Figure 2-4). Compter les cellules par un compteur de cellules automatisées ou manuellement à l’aide d’un hémocytomètre pour obtenir le rendement total des cellules B. Remarque : En général, le rendement est environ 105 B cellules/mL pour la normale des cellules de B et 5-50 x 106 cellules/mL pour MCL.</li>
	<li>Confirmant la pureté de l’enrichissement des cellules B<ol>
<li>Prendre ~ 50 000 cellules et incuber les cellules avec des anticorps anti-CD19/CD20 (01:20 dilution) et les anticorps anti-CD45 couplés à des fluorochromes différents (01:10 dilution) à température ambiante pendant 15 à 30 min.</li>
		<li>Laver avec 1 mL de 1 x PBS + 1 % de BSA, centrifuger les cellules à 400-500 g pendant 5 min et remettre en suspension les cellules de ~ 200 µL de PBS.</li>
		<li>Acquérir les échantillons de cellules par cytométrie en flux et analyser pour la pureté des cellules B. La pureté est la plupart du temps > 90 % par cette méthode (Figure 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. développement de la modèle de xénogreffe de souris
<ol><li>Suspendre environ 40 à 60 x 106 cellules pour 150-200 µL de PBS 1 x (volume nécessaire d’injecter par souris).</li>
	<li>Injecter 150 µL de la suspension cellulaire par voie intraveineuse (i.v.) dans chaque veine de queue de 6-7 semaine vieux NOD scid gamma (NSG) des souris immunodéficientes quel que soit le sexe (Figure 4 a).</li>
	<li>Laissez les souris développer le lymphome humain pendant environ 10 semaines. Remarque : Les cellules de lymphome humain primitif prennent beaucoup plus de temps pour développer des tumeurs par rapport aux lignées de cellules de lymphome humain (environ 3 semaines).</li>
	<li>Quand les animaux commencent à montrer des symptômes d’une maladie mortelle comme la perte de poids, cheveux ébouriffé, diminution de l’activité, paralysie des membres postérieurs, etc., sacrifier les souris en CO2 asphyxie suivie par ponction cardiaque coeur d’obtenir le sang.</li>
	<li>Recueillir différents organes comme la moelle osseuse, rate et le foie en disséquant les souris et recueillir le sang périphérique de prélever le sang du coeur au moment du sacrifice pour l’analyse de prise de greffe tumorale (Figure 4 b -F).</li>
</ol>4. chimérisme analyse des cellules de tumeur implanté dans différents organes
<ol><li>Après avoir recueilli les différents organes, les traiter par rupture mécanique pour générer des suspensions de cellules unique après la lyse des globules rouges (RBC) avec 200 µL de 1 x tampon de potassium chlorure d’ammonium pour le sang et la moelle osseuse, 500 µL de rate et 2 mL pour du foie .</li>
	<li>Compter et tacher les cellules à l’aide d’anticorps spécifiques de cellules B humaines, c'est-à-dire, anti-CD19, anti-CD20 et anti-CD45. NOTE : Souris NSG manquent de cellules B et donc pour l’analyse, les cellules sont colorées avec des marqueurs de cellules de B humaines spécifiques.</li>
	<li>Analyser les cellules dérivées de chaque organe par cytométrie de blocage sur les cellules B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>Quantifier les cellules tumorales implantée dans différents organes provenant de souris MCL injecté basés sur les cellules fermées comme indiqué dans l’étape 4.3 (Figure 4). Remarque : Consultez la Table des matières pour plus de détails.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Les essais cliniques sont possibles pour les médicaments qui sont à un stade avancé de développement, mais ne peut pas être utilisés pour la découverte de médicaments. Efforts visant à développer les animaux receveurs pour la xénotransplantation de cellules humaines afin de tester des médicaments de stade précoce ont longtemps été poursuivi. Nous présentons ici un modèle animal qui évite le rejet du greffon humain et peut établir un modèle pour les maladies humaines, comme le MCL. À l’heure actuelle, c’est un modèle de x...

Lymphocytes par nature jouent un rôle majeur dans la surveillance du système immunitaire, et traite des lymphocytes est une étape essentielle dans le montage de l’immunité spécifique de l’antigène1,2. Ce processus comprend la migration des lymphocytes naïfs T du thymus dans le flux de sang et de là vers les organes lymphoïdes secondaires, y compris les ganglions lymphatiques, rate ou plaques de Peyer où ils rencontrent les antigènes apparentés. Les lymphocytes B se différencient dans la moelle osseuse et migrent comme cellules naïves dans les follicules des organes lymphoïdes secondaires3. Certaines de ces cellules B lient à l’antigène avec leurs récepteurs et sont activées par les cellules T spécifiques. Prolifération et la différenciation de ces cellules B pousse les cellules naïves B non-activé, dans la zone du manteau du follicule. Les lymphocytes activés peuvent alors se différencier en mémoire B cellules qui patrouillent le corps, ou deviennent des immunoglobulines sécrétant des plasmocytes qui migrent de la moelle osseuse4.
MCL se produit lorsque les lymphocytes naïfs B dans la zone du manteau se transforment en une tumeur. Ces cellules de lymphome résident dans le micro-environnement des organes lymphoïdes et prolifèrent indépendamment de contrôle spécifique des lymphocytes T. Cependant, à un certain stade de densité ils échappent à ce créneau et circuler dans le sang à la recherche de niches dans d’autres organes. Compte tenu de la complexité des molécules d’adhésion et la promiscuité des chimiokines et leurs récepteurs, le mécanisme de ce cellulaire traite in vivo est mal compris et par conséquent freine la thérapie. Méthodes novatrices sont nécessaires pour bloquer efficacement ce processus de migration pour empêcher les cellules de lymphome B d’atteindre des micro-environnements nouvelles.
MCL est l’un des plus difficiles à traiter les tumeurs malignes de cellules B. Le développement d’un phénotype néoplasique du MCL est le résultat d’une cascade de plusieurs étapes, que se caractérise par l’acquisition de propriétés biologiques uniques. Au moment du diagnostic, la plupart des patients (70 %) est déjà présent avec une maladie disséminée, avec une majorité de cas présentant extraganglionnaires implication dans la rate, la moelle osseuse, et/ou le tractus gastro-intestinal5,6. Chez les patients traités, rechute de tumeurs résistantes dans les prochaines années est commun, même si la chimiothérapie conventionnelle induit des taux de rémission élevé à court terme7,8. Nous présentons un nouveau modèle de la maladie qui peut aider à comprendre la diffusion de la MCL et sa biologie sous-jacente : nous avons établi un modèle de souris de xénogreffe MCL humain provenant des cellules de la tumeur primitive des patients. Nous espérons que ce modèle permettra de développer des stratégies thérapeutiques contre la diffusion de la MCL et éventuellement offrir de nouvelles perspectives cliniques pour diagnostic optimal et le traitement des patients récidivants.

<table><tbody><tr><td>Milieu Ficoll-paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>pour la séparation de cellules mononucléées</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco-Life technologies</td><td>61870-010</td><td>pour la dilution d’un échantillon de sang</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>lavage de cellules</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>pour la préparation du PBS avec 1 % de BSA utilisé dans le lavage des cellules pendant l’isolement</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>marqueur de cellules pan-B humaines</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>marqueur de cellules pan-B humaines</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>marqueur de cellules pan-B humaines</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>marqueur</td></tr> <tr>de cellules T humaines<td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Protéine de surface cellulaire généralement absente dans MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Marqueur pan-leucocytaire</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Protéine de surface cellulaire généralement absente chez les souris MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>utilisée pour développer des xénogreffes MCL dans cette étude</td></tr><tr><td>Kit d’enrichissement de cellules B humaines faciles à utiliser</td> Technologies <td>de cellules souches</td><td>19054</td><td>utilisées pour enrichir les cellules B afin d’obtenir des cellules pures à injecter dans</td></tr><tr><td>des souris FACS Beckman</td><td>Coulter</td><td>Navios</td><td>utilisé pour caractériser l’échantillon de MCL et pour étudier les organes pour la greffe de MCL</td></tr><tr><td>1X chlorure d’ammonium tampon</td><td></td><td></td> de potassium <td>tampon de lyse du sang rouge (NH4Cl 8 024 mg/l ; KHCO3 1 001 mg/l ; EDTA. Na2 et point moyen ; 2H2O 3,722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

greffe de la tumeur dans un modèle murin de xénogreffe de lymphome du manteau homme

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Les lymphocytes B sont des acteurs essentiels dans la circulation de cellules immunitaires et ils abritent principalement et résident dans les organes lymphoïdes. Tandis que les cellules normales de B se multiplient uniquement quand ils sont stimulés par les lymphocytes T, oncogènes B cellules survivent et développez autonome dans des créneaux orgue indéfini. Lymphome du manteau (MCL) est un tel désordre de lymphocytes B, où le taux de survie médiane des patients est 4-5 ans. Cela nécessite le besoin de mécanismes efficaces par lesquels le homing et la prise de greffe de ces cellules sont bloqués afin d’augmenter la survie et la longévité des patients. Par conséquent, les efforts pour développer un modèle de xénogreffe de souris pour étudier l’efficacité de la thérapeutique de la MCL en bloquant l’autoguidage mécanisme in vivo sont primordial. Développement des bénéficiaires animales pour la xénotransplantation de cellules humaines pour tester des médicaments de stade précoce ont longtemps été poursuivies, comme modèles murins précliniques pertinentes sont cruciales pour nouveaux agents thérapeutiques écran. Ce modèle animal est développé afin d’éviter le rejet du greffon humain et d’établir un modèle pour les maladies humaines, et il peut être un outil extrêmement utile pour étudier la progression de la maladie de types différents de lymphomes et d’effectuer des essais précliniques de médicaments candidats pour malignités hématologiques, comme MCL. Nous avons établi un modèle de xénogreffe de souris qui service une excellente ressource pour étudier et développer de nouvelles approches thérapeutiques pour MCL.

Le manuscrit décrit un protocole optimisé pour la mise au point d’un modèle de souris de xénogreffe pour greffe de cellules MCL. Préparation d’une population de cellules pur (dans ce cas cellules MCL), est très essentiel d’élaborer des xénogreffes MCL réussies. La figure 1 représente les étapes préparatoires pour l’isolement de cellules mononucléées du sang du patient MCL de séparation gradient de densité. Les cellules mononucléaires sont traitées ultérieurem...

Lymphome du manteau (MCL) est difficile à traiter la maladie de lymphocytes B et il est tout aussi difficile d’établir un modèle de souris de xénogreffe de MCL primaire pour étudier et développer des produits thérapeutiques. Nous décrivons ici la mise en place réussie des xénogreffes MCL chez les souris pour aider à comprendre sa biologie sous-jacente.

Greffe de la tumeur dans un modèle murin de xénogreffe de lymphome du manteau homme

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

L'objectif général de cette méthode est d'établir un modèle de souris xénogreffe pour le lymphome à cellules du manteau, afin de développer des stratégies thérapeutiques pour cette maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématooncologie, telles que l'efficacité thérapeutique de différentes stratégies de traitement. Le principal avantage de cette technique est qu'elle nous permet d'étudier l'effet de médicaments sur des cellules de lymphome humaines in vivo.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du lymphome à cellules du manteau, car l'utilisation de ce modèle permet non seulement d'étudier de manière faisable, mais aussi pratique, l'effet d'un traitement sur des cellules dérivées de patients. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les aspects thérapeutiques du lymphome à cellules du manteau, elle peut également être appliquée à l'étude de différents types de lymphomes. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il est difficile d'obtenir des xénogreffes dérivées de patients.Lorsque nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode, lorsque nous souhaitions étudier la migration des cellules B in vivo, ainsi que les effets de certaines thérapies sur ce processus. Diluez 12 millilitres d'échantillon sanguin de lymphome à cellules du manteau avec des volumes égaux de milieu RPMI 1640. Ensuite, retournez plusieurs fois le milieu de gradient de densité avant utilisation.Aspirez 15 millilitres de milieu de gradient de densité dans un tube de centrifugation de 50 millilitres. À l’aide d’un aspirateur, ajoutez soigneusement et délicatement l’échantillon de sang dilué au-dessus du milieu de gradient de densité sans mélanger les deux couches. Ensuite, désactivez les freins et centrifugez l’échantillon de sang à 400g pendant 40 minutes à température ambiante.Utilisez une pipette de Pasteur stérile pour aspirer les cellules sanguines mononucléées de la couche intermédiaire et transférez-les dans un tube propre. Pour laver les cellules mononucléées, ajoutez un volume triple de solution saline tamponnée au phosphate stérile à concentration simple contenant 1 % de sérum de veau fœtal à un volume estimé de suspension cellulaire. Pipetez la suspension cellulaire plusieurs fois afin d'assurer un mélange adéquat.Ensuite, centrifuger l'échantillon à 400-500g pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et laver le culot cellulaire avec une solution tampon saline au phosphate à concentration unitaire contenant 1 % d'albumine sérique bovine. Centrifuger l'échantillon.Ensuite, éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans un ou deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Puis, dénombrer le nombre de cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé. Diluer les cellules dans la solution saline tamponnée au phosphate, puis prélever les cellules à la pipette et les transférer dans un tube en polystyrène de cinq millilitres, auquel on ajoute 100 microlitres de cocktail d’anticorps à la suspension cellulaire.Effectuez plusieurs aspirations et dispensations douces de la suspension cellulaire pour bien mélanger. Incubez ensuite les cellules à température ambiante dans le flux laminaire pendant 10 minutes. Pendant ce temps, vortexez les particules magnétiques du kit d'enrichissement des cellules B pendant 30 secondes.Ensuite, ajoutez 150 microlitres des particules magnétiques à deux millilitres de suspension cellulaire. Incubez le mélange de cellules et de particules magnétiques à température ambiante pendant cinq minutes. Ajustez le volume de l'échantillon à 2,5 millilitres, puis placez le tube dans l'aimant et incubez pendant trois à cinq minutes supplémentaires.Après l'incubation, d'un seul mouvement continu, versez la suspension cellulaire du tube fixé sur l'aimant dans un nouveau tube. Ensuite, déterminez le rendement total de lymphocytes B dans la suspension à l'aide d'un compteur cellulaire automatisé. Pour confirmer la pureté des lymphocytes B enrichis, incubez environ 50 000 cellules avec des anticorps anti-CD19, anti-CD20 et anti-CD45 couplés à différents fluorochromes, à température ambiante pendant 15 à 30 minutes.Ensuite, lavez les cellules avec un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate à concentration unitaire contenant 1 % d'albumine sérique bovine. Centrifugez les cellules à 400-500g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate.Analyser la pureté des cellules B par cytométrie en flux, qui est généralement supérieure à 90 % avec cette méthode. Suspendre les cellules dans 150 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate à concentration unitaire. Ensuite, injecter la suspension cellulaire par voie intraveineuse dans la veine de la queue de souris âgées de six à sept semaines, indépendamment de leur sexe.L'injection intraveineuse, dans la veine de la queue de la souris, des cellules de lymphome isolées à partir du sang du patient est également essentielle pour assurer un engraftement réussi. Après l'euthanasie des souris dans une chambre à dioxyde de carbone, prélevez les différents organes. Ensuite, soumettez les organes à une dissociation mécanique sur un filtre de 70 microns à l’aide de l’extrémité arrière du piston d’une seringue afin d’obtenir une suspension monocellulaire.Centrifuger tous les échantillons, sauf le sang, à 400-500g pendant cinq minutes, puis jeter le surnageant. Utiliser un tampon ammonium-chlorure-potassium à concentration unitaire pour lyser les cellules sanguines, de la moelle osseuse, de la rate et du foie. Il est important de filtrer les cellules provenant d'organes isolés de souris afin d'obtenir une suspension monocellulaire avant de passer au cytomètre en flux, afin d'éviter tout colmatage.Utilisez des anticorps spécifiques des cellules B, tels que l'anti-CD19, CD20 et CD45, pour marquer les cellules. L'utilisation de la cytométrie en flux a permis d'obtenir les cellules B provenant de chaque organe marquées positivement pour les anticorps CD19, CD20 et CD45. À partir des cellules sélectionnées par fenêtrage, quantifiez les cellules spécifiques à l'organe et les cellules tumorales greffées obtenues chez les souris injectées avec un lymphome à cellules du manteau.Dans cette étude, la cytométrie en flux est réalisée afin d'évaluer la pureté des cellules B avant et après enrichissement dans le lymphome à cellules du manteau. Pour caractériser le lymphome à cellules du manteau mononucléé, des marqueurs spécifiques des cellules B tels que CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa et Lambda sont utilisés. L'analyse par cytométrie en flux révèle des cellules positives pour CD45, CD19, CD20 et CD5.Et ceux-ci sont sélectionnés pour la caractérisation. Les cellules qui ne se sont pas marquées pour CD23 et CD200 sont également sélectionnées. Le degré d'engraftement spécifique aux organes est étudié en traitant davantage les organes par cytométrie en flux, puis en analysant la présence de cellules B.Voici une représentation comparative du schéma d'engrèvement obtenu à partir de deux patients en utilisant des organes tels que la rate, la moelle osseuse et le foie. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de trois semaines. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'enrichir les PBMC utilisés pour les xénogreffes et de surveiller régulièrement les souris pour détecter des signes vitaux de maladie tels que le pelage hérissé, le dos voûté, la paralysie des membres postérieurs et la perte de poids.Après avoir suivi cette procédure, les xénogreffes pourraient être appliquées à d'autres types de lymphomes, par exemple, afin de pratiquer une médecine personnalisée. Après son développement, cette technique pourrait ouvrir la voie à d'autres chercheurs dans le domaine de l'hématoncologie, pour explorer les moyens d'établir un lymphome à cellules du manteau provenant de patients chez des souris nod scid immunodéficientes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la manière de purifier les PBMC provenant de patients et de les utiliser pour xénogreffer des souris immunodéficientes afin de comprendre la stratégie des thérapies.Veuillez noter que le travail avec des échantillons sanguins humains primaires peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de l'exécution de ces procédures.

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Recherche sur le cancer

Une méthode pour greffer de manière fiable la luciférase taggés humaines malignes des cellules nerveuses périphériques gaine de la tumeur dans le nerf sciatique de souris immunodéficientes est décrite. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence pour démontrer établissement correct des greffes tumorales et les critères de la ségrégation aléatoire des animaux dans des groupes d'étude sont également discutées.

Orthotopique xénogreffe de l&#39;homme-luciférase Tagged malin cellules nerveuses périphériques tumeur Gaine pour In vivo Test d&#39;agents thérapeutiques candidats

Cette vidéo montre un test permettant de générer un modèle murin de xénogreffe humanisé. Une souris immunodéprimée reçoit une injection de cyclophosphamide pour provoquer l’épuisement des cellules immunitaires. Des cellules tumorales dérivées de patients mélangées à des cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) dans un hydrogel sont injectées par voie sous-cutanée dans la souris, formant une tumeur avec des lymphocytes T infiltrants.

Technique de génération d’un modèle de souris xénogreffe humanisée greffée de PBMC humain

Xénogreffes de tumeurs humaines dans des souris immunodéficientes sont des outils précieux pour étudier la biologie du cancer. Des protocoles spécifiques pour générer des xénogreffes sous-cutanées et intra-hépatiques à partir de cellules humaines de carcinome hépatocellulaire ou des fragments de tumeur sont décrits. La régénération du foie induite par une hépatectomie partielle dans les souris receveuses sont présentées en tant que stratégie pour faciliter la prise de greffe intrahépatique.

Génération de sous-cutanée et intra-hépatique droits de carcinome hépatocellulaire xénogreffes chez la souris immunodéficientes

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

Ici nous utilisons bioluminescent, radiographie et tomographie par émission de positons/calculé tomographie imaging pour étudier comment inhiber l’activité mTOR impacts tumeurs myélome de la moelle osseuse-implanté dans un modèle de xénogreffe. Cela permet des analyses physiologiquement pertinents, non invasif et multimodales de l’effet anti-myélome de thérapies ciblant myélome de la moelle osseuse-greffée tumeurs in vivo.

Multimodal bioluminescentes et émission positronique tomographie/Computational imagerie par tomographie des xénogreffes de moelle osseuse de myélome Multiple chez les souris NOG

Ici, nous présentons un protocole pour induire et marquer la maladie dans un modèle xnogeneic de greffe-contre-hôte de la maladie (xenoGVHD). xenoGVHD fournit un modèle in vivo pour étudier l'immunosuppression des lymphocytes T humains. En outre, nous décrivons comment détecter les lymphocytes T humains dans les tissus avec PCR numérique comme outil pour quantifier l'immunosuppression.

Induction et notation de la maladie de graft-Versus-Host dans un modèle xénogéné de murine et quantification des cellules t humaines dans des tissus de souris utilisant PCR numérique

Nous décrivons une cellule mononucléaire périphérique humaine de sang (PBMC) — modèle humanisé basé de souris de xénogreffe pour la recherche translationnelle d'immuno-oncologie. Ce protocole pourrait servir de ligne directrice générale pour établir et caractériser des modèles similaires pour l'évaluation de la thérapie I-O.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research (A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research (A-O)

Le protocole actuel décrit les méthodes pour établir des modèles de xénogreffe (PDX) dérivés du patient et des lignées cellulaires cancéreuses primaires à partir d'échantillons chirurgicaux de cancer gastrique. Les méthodes fournissent un outil utile pour le développement de médicaments et la recherche en biologie du cancer.

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

Des modèles de souris de xénogreffe de xénogreffe de mélanome uastatique de foie humain orthotopic ont été créés utilisant des techniques orthotopic chirurgicales d'implantation orthotopic avec le morceau patient-dérivé de tumeur et les techniques d'injection d'aiguille avec les lignes humaines cultivées de cellules de mélanome uveal.

Génération d'un foie orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.

Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris

Le présent protocole décrit comment greffer de la peau humaine sur des souris non obèses diabétiques (NOD)-SCID à récepteur de la chaîne gamma (NSG) diabétiques (NOD). Une description détaillée de la préparation de la peau humaine pour la transplantation, de la préparation des souris pour la transplantation, de la transplantation de la peau humaine d’épaisseur fendue et de la procédure de récupération post-transplantation est incluse dans le rapport.

Modèle de peau de xénogreffe pour manipuler les réponses immunitaires humaines in vivo

Découvrez comment établir un modèle de xénogreffe murin pour le lymphome du manteau afin d'étudier les effets thérapeutiques in vivo sur des cellules dérivées de patients.

Greffe de la tumeur dans un modèle murin de xénogreffe de lymphome du manteau homme

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