Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

L’objectif global de ce protocole est d’identifier quantitativement les composants du microenvironnement tumoral dans les résections de patients atteints de glioblastome à l’aide de l’immunohistochimie chromogène et de l’image J.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que l’apparence de ces composants dans les échantillons de patients et la façon dont nous pouvons déterminer des ratios de cellules physiologiquement pertinents. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple pour l’analyse dans des échantillons de patients. Les implications de cette technique s’étendent à l’élucidation du microenvironnement tumoral complexe et sous-caractérisé du glioblastome.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car le moment du développement chromogène doit être surveillé de près pour éviter le surdéveloppement et la saturation des tissus. Commencez le protocole en effectuant les lavages spécifiés dans le protocole de texte qui l’accompagne. Diluez la solution de démasquage de l’antigène à pH élevé à base de tris et l’eau distillée en suivant les recommandations du fabricant.

Passez à la récupération d’antigène médiée par la chaleur en ajoutant la solution de démasquage diluée dans un récipient non scellé allant au micro-ondes. Placez les lames dans le récipient. Placez ensuite les lames du récipient dans le micro-ondes.

Ensuite, faites bouillir le récipient pendant 20 minutes à haute puissance. Surveillez les niveaux de liquide pour l’évaporation et remplissez le récipient avec de l’eau distillée si nécessaire. Laisser refroidir les échantillons en solution pendant une heure à température ambiante.

Délignez l’échantillon de tissu avec un hydrophobe pour minimiser le volume de réactifs nécessaire pour couvrir l’échantillon. Ensuite, versez suffisamment de solution de perméabilisation, 100 à 200 microlitres pour couvrir l’échantillon de tissu. Retirez et jetez la solution et recouvrez à nouveau l’échantillon de tissu avec une solution de perméabilisation.

Incuber les échantillons à température ambiante avec une solution de blocage pendant une heure. Ensuite, incubez les échantillons pendant la nuit à quatre degrés Celsius avec des anticorps primaires dilués dans une solution bloquante. Le lendemain, détectez les anticorps primaires à l’aide d’un réactif polymère de peroxydase de raifort correspondant à l’animal hôte de l’anticorps primaire.

Introduisez suffisamment de solution de perméabilisation pour couvrir l’échantillon de tissu et incubez l’échantillon pendant cinq minutes. Retirez et jetez la solution et couvrez l’échantillon de tissu dans la solution de perméabilisation une fois de plus pendant cinq minutes. Incuber les lames dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3 % et IX TBS pendant 15 minutes.

Développer les échantillons avec un substrat de peroxydase, de diaminobenzidine ou de dab pendant deux à 10 minutes jusqu’à ce que l’intensité de coloration souhaitée soit atteinte. Contre-colorez les échantillons pour identifier les noyaux cellulaires, par exemple avec de l’hématoxyline en suivant le protocole du fabricant. Déshydrater les échantillons avec 100 % d’éthanol et de xylène.

Enfin, montez les échantillons de manière permanente avec des supports de montage. Deux régions d’intérêt au sein de nos résections tumorales, la tumeur primaire Bulk et les régions adjacentes, principalement composées de tissus sains avec des cellules cancéreuses envahissantes diffuses, ont été identifiées par un neuropathologiste collaborateur sur des échantillons de patients colorés à l’hématoxyline et à l’éosine. L’immunohistochimie chromogène a identifié une coloration positive pour les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes dans chaque échantillon de patient.

Nous avons effectué une coloration sans anticorps primaire pour un contrôle négatif. Le fabricant a recommandé d’effectuer d’autres dilutions avant de se fixer sur la dilution de un à 200 en raison d’une coloration positive optimale du corps cellulaire et du processus avec un bruit de fond minimisant pour l’anticorps anti-ALDH 1l1. À l’aide de l’image J, le pourcentage de couverture de la coloration oligodendrocytaire positive OSP-1 a été quantifié pour finalement comparer les différences dans nos régions d’intérêt.

Une fois que le seuil approprié a été appliqué à l’image, le pourcentage de couverture à partir du seuil peut être mesuré et comparé pour plusieurs patients. Cinq régions adjacentes et en vrac d’échantillons de patients atteints de glioblastome ou de GBM, ainsi que de tissu cérébral sain, ont été comparés pour la couverture de la protéine 1 spécifique des oligodendrocytes ou de l’OSP1 pour cent. Une fois maîtrisée, la technique de coloration peut être réalisée en quatre heures le premier jour et en deux heures le deuxième jour si elle est effectuée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de surveiller de près l’intensité de la coloration et l’hydratation des tissus.