Name: Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Découvrez l'immunohistochimie chromogène pour analyser quantitativement le microenvironnement tumoral dans les résections de glioblastome. Cette méthode utilise ImageJ pour identifier les composants cellulaires et établir des ratios physiologiques pertinents.

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Les auteurs remercient les Drs. Fahad Bafakih et Jim Mandell pour l&#39;acquisition et l&#39;identification des échantillons de patients, Garrett F. Beeghly pour l&#39;assistance à l&#39;immunohistochimie, et le Centre de recherche sur les biorestations et les tissus, le Centre de recherche cardiovasculaire et le Centre d&#39;analyse biomoléculaire de l&#39;Université de Virginie pour obtenir de l&#39;aide avec L&#39;acquisition d&#39;échantillons, l&#39;immunohistochimie et l&#39;imagerie.

Ce protocole identifie les composants cellulaires dans les échantillons intégrés à la paraffine fixée au formol (FFPE), comme c&#39;est le cas pour les échantillons de patients cliniques bancés. L&#39;encastrement de la paraffine permet le meilleur entretien de la morphologie cellulaire et tissulaire ainsi que la meilleure longévité des sections. Les échantillons utilisés pour cette analyse ont été consultés par l&#39;intermédiaire de l&#39;Université de Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Les échantillons de patients ont été sélectionnés par un neuropathologue sur la base d&#39;un diagnostic définitif de glioblastome (astrocytome, grade IV de l&#39;OMS) qui avaient terminé les résections tumorales à l&#39;Université de Virginie entre 2010 et 2013 et ont été désidentifiés avant cette analyse 11 . 1. Déparaffinisation et réhydratation des échantillons FFPE REMARQUE: cette partie du protocole est spécifique aux échantillons FFPE. Alors que les échantillons intégrés à la paraffine peuvent être plus utiles pour cette analyse en raison de la préservation de la cellule et de la tProblème de morphologie, cette analyse peut également être effectuée avec des sections gelées. Si vous utilisez des sections congelées, cette partie peut être omise et procéder directement à l&#39;immunohistochimie chromogène. <ol><li> Effectuez les lavages suivants pendant 5 min chacun: Xylène, Xylène, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Éthanol, 70% Éthanol, Eau désionisée, Eau désionisée </li></ol> 2. Antigen Retrieval REMARQUE: Cette partie du protocole est nécessaire pour casser les ponts méthylène formés lors de la fixation du formol des échantillons FFPE et exposer les sites antigéniques pour les anticorps qui se lient. <ol><li> Diluer la solution de démasquage de l&#39;antigène à pH élevé à base de Tris à la recommandation du fabricant dans l&#39;eau distillée. </li><li> Effectuer une récupération d&#39;antigène à médiation thermique à l&#39;aide d&#39;un micro-ondes. D&#39;autres formes de récupération médiée par la chaleur (comme la cuisinière à pression, le vaporisateur végétal ou l&#39;eau bouillante) suffiraient également. <ol><li> Ajouter la solution de démasquage diluée dans un micro-ondes non scellénavire. Placez les glissières dans le récipient. Placez les toboggans dans le micro-ondes. </li><li> Faire bouillir pendant 20 min à haute puissance. Surveiller les niveaux de liquide pour l&#39;évaporation, et reconstituer avec de l&#39;eau distillée si nécessaire. </li></ol></li><li> Autoriser les échantillons à refroidir en solution pendant 1 h à température ambiante. </li></ol> 3. Immunohistochimie chromogène <ol><li> Décrire l&#39;échantillon de tissu avec un stylo hydrophobe pour minimiser le volume de réactifs nécessaires pour couvrir l&#39;échantillon. REMARQUE: Assurez-vous de garder les échantillons de tissus hydratés et ne les laissez pas sécher car cela affectera l&#39;efficacité de la coloration. </li><li> Pipeter suffisamment de solution de perméabilisation (Tris-buffered saline (TBS) + 0,01% Triton-X) pour couvrir l&#39;échantillon de tissu (typiquement environ 100 à 200 μL). </li><li> Supprimez et jetez la solution et répétez l&#39;étape 3.2. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante avec une solution de blocage (2,5% de sérum de cheval + solution de perméabilisation). </li><li> Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ºC avec des anticorps primaires diluésEn solution de blocage. NOTE: Tous les anticorps primaires utilisés ici sont dilués à 1: 200, mais des dilutions optimales peuvent être déterminées à l&#39;aide de dilutions en série, en commençant par la recommandation du fabricant. Des informations détaillées sur les anticorps utilisés dans ce protocole ont déjà été publiées 11 . </li><li> Détecter les anticorps primaires en utilisant un réactif polymère de peroxydase de raifort correspondant à l&#39;animal hôte d&#39;anticorps primaire, suivant le protocole du fabricant. </li><li> Pipeter suffisamment de solution de perméabilisation pour couvrir l&#39;échantillon de tissu et incuber pendant 5 minutes. </li><li> Retirez et jetez la solution et répétez l&#39;étape 3.7. </li><li> Incuber les diapositives dans 0,3% de H 2 O 2 dans 1x TBS pendant 15 min. </li><li> Développer des échantillons avec un substrat de peroxydase diaminobenzidine (DAB) pendant 2 à 10 min jusqu&#39;à ce que l&#39;intensité de tache souhaitée soit atteinte. </li><li> Contrôler les échantillons pour identifier les noyaux cellulaires, par exemple avec l&#39;hématoxyline, selon le protocole du fabricant. </li><li> Déshydratez des échantillons avec 100%L&#39;éthanol et le xylène. </li><li> Monter des échantillons en permanence avec des supports de montage. </li></ol> 4. Identification des régions d&#39;intérêt <ol><li> Diapositives d&#39;images sous microscope à champ lumineux capable d&#39;images haute résolution. REMARQUE: Utilisez les composants cellulaires d&#39;imagerie à une résolution minimale de 20x. </li><li> Déplacez la caméra vers des régions d&#39;intérêt spécifiques tout au long des échantillons de tissus. </li><li> Enregistrez les images en tant que fichiers TIFF pour la quantification. </li></ol> 5. Analyse d&#39;image <ol><li> Ouvrez les images dans ImageJ pour la quantification du pourcentage de couverture. </li><li> Utilisez le plug-in Threshold Color pour supprimer la couleur pourpre des noyaux colorés à l&#39;hématoxyline. </li><li> Convertir l&#39;image en 8 bits. </li><li> Ajouter un seuil sans arrière-plan sombre. </li><li> Traitez l&#39;image en utilisant l&#39;un des 17 filtres de seuil ImageJ pré-chargés ( c&#39;est-à-dire MaxEntropy), de sorte que seulement les portions colorées DAB sont incluses dans le seuil. REMARQUE: sélectionnez le filtre de seuil préchargé optimal qui minimiseEs inclusion de la coloration d&#39;arrière-plan. Cela peut dépendre de la qualité de la coloration et de la spécificité des anticorps. Utilisez le même seuil pour toutes les réplications techniques dans chaque échantillon de patient. </li><li> Appliquer le seuil. </li><li> Mesurez la superficie en pourcentage de l&#39;image de seuil. </li><li> Coefficient de couverture en pourcentage moyen pour plusieurs régions dans chaque échantillon. </li></ol>

<ol><li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+glioma+growth%3A+a+guerilla+war%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li>
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<li>Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer%3A+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li>
<li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752(2013).</li>
</ol>

Notre méthode proposée ici est une approche quantitative pour analyser des échantillons histologiques colorés en utilisant une immunohistochimie chromogène traditionnelle. La méthodologie actuelle pour ce type d&#39;analyse comprend des protocoles de coloration similaires suivis d&#39;un classement par des pathologistes indépendants. Cette méthode a été fiable, mais pour un certain nombre d&#39;applications, une compréhension plus précise du maquillage cellulaire est nécessaire, comme une meilleure compréhension de l&#3...

Le glioblastome (GBM), le cancer du cerveau le plus fréquent et le malin, se caractérise par une invasion très diffuse de la masse tumorale primaire dans le parenchyme 1 , 2 du cerveau sain environnant. Cette invasion diffuse rend la tumeur particulièrement difficile à résister pleinement, et les cellules cancéreuses envahissantes qui restent post-thérapeutique sont la raison la plus fréquente pour la récurrence inévitable 2 , 3 , 4 . Auparavant, nous avons constaté que l&#39;invasion de cellules de gliome diffus était bénéfique sur le plan thérapeutique 5 , mais on sait peu de choses sur les mécanismes complexes contribuant à l&#39;invasion GBM. Le micro-environnement tumoral, ou le tissu entourant le cancer, a été impliqué dans la progression des tumeurs dans de multiples cancers 6 , 7 . Le micro-environnement de la tumeur du glioblastome, en pArticulaire, est relativement sous-caractéristique et est exclusivement complexe, composée de cellules gliales multiples, telles que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes, ainsi que la matrice extracellulaire, les facteurs solubles et les facteurs biophysiques. D&#39;une manière expérimentale, les astrocytes et la microglie ont montré une augmentation de la progression du gliome et de l&#39;invasion 8 , 9 , 10 , mais la composition de toutes les cellules gliales dans le microenvironnement du cerveau humain natif est inconnue. Nous avons déjà montré que les composants microenvironnaires peuvent prédire la survie du patient en analysant quantitativement les composants cellulaires du micro-environnement du glioblastome et en incorporant nos analyses dans un modèle de risques proportionnels 11 . Ici, nous décrivons la méthode d&#39;analyse quantitative pour identifier les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales du patient au glioblastomeS. Nous avons utilisé l&#39;immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. L&#39;évaluation du pourcentage de couverture crée une mesure simple pour déterminer les différences morphologiques des cellules, en particulier celles affectées par les interactions avec les cellules cancéreuses. Des études antérieures pour quantifier la coloration histopathologique utilisent une coloration standard telle que l&#39;hématoxyline et l&#39;éosine 12 ou le trichrome de Masson 13 , qui ne profitent pas de la spécificité de la coloration par immunohistochimie à base d&#39;anticorps. Notre méthode a été développée pour quantifier directement les populations de gliales dans les résections de tumeur du patient liées au glioblastome, que nous visons à utiliser pour élucider le micro-environnement complexe du glioblastome.

<table><tbody><tr><td>Xylène</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de démasquage de l’antigène à pH élevé</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum</td><td></td><td></td><td></td>de cheval</tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&nbsp ;</td><td>abcam&nbsp ;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IBA1&nbsp ;</td><td>abcam&nbsp ;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Protéine spécifique anti-oligodendrocytes1&nbsp ;</td><td>abcam&nbsp ;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-chèvre</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-souris/lapin)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT Substrat DAB</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Contre-coloration à l’hématoxyline</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Support de montage</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products</td><td>International 195506</td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Avec l&#39;intérêt croissant pour le micro-environnement de la tumeur, nous nous sommes mis à développer une méthode pour déterminer spécifiquement les composants de micro-environnement dans les échantillons de patients de glioblastome, le cancer du cerveau le plus mortel et le plus invasif. Non seulement les méthodes quantitatives sont-elles bénéfiques pour décrire avec précision les tissus malades, mais peuvent également contribuer à un pronostic plus précis, au diagnostic et au développement de systèmes et de remplacements tissulaires. Dans le glioblastome, les cellules gliales, telles que la microglie et les astrocytes, ont été corrélées indépendamment avec un mauvais pronostic basé sur le classement des pathologistes. Cependant, l&#39;état de ces cellules et d&#39;autres composants des cellules gliales n&#39;a pas été bien décrit de manière quantitative. Cela peut être difficile en raison des grands processus qui marquent ces cellules gliales. En outre, la plupart des analyses histologiques se concentrent sur l&#39;échantillon de tissu global ou seulement dans la masse de la tumeur, par opposition à la délimitation de quantifications basées sur des régionsDans le tissu hautement hétérogène. Ici, nous décrivons une méthode pour identifier et analyser quantitativement les populations de cellules gliales dans la masse tumorale et les régions adjacentes de résections tumorales des patients atteints de glioblastome. Nous avons utilisé l&#39;immunohistochimie chromogène pour identifier les populations de cellules gliales dans les résections tumorales des patients et ImageJ pour analyser la couverture en pourcentage de la coloration pour chaque population gliale. Avec ces techniques, nous sommes en mesure de mieux décrire les cellules gliales dans toutes les régions du micro-environnement de la tumeur du gliome.

Pour cette analyse, deux régions d&#39;intérêt dans nos résections tumorales - la masse tumorale primaire et les régions adjacentes, principalement composées de tissu sain avec des cellules cancéreuses envahissantes diffuses ( Figure 1A , 1B ) - ont été identifiées par des neuropathologues collaborateurs sur l&#39;hématoxyline et le patient coloré à l&#39;éosine Échantillons. Dans chaque échantillon de patient, on a identifié une coloration ...

Ce protocole a été développé pour identifier quantitativement les composants de micro-environnement de la tumeur dans les résections du patient au glioblastome utilisant l&#39;immunohistochimie chromogène et ImageJ.

Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

L'objectif général de ce protocole est d'identifier de manière quantitative les composants du microenvironnement tumoral dans des prélèvements de tissus tumoraux de patients atteints de glioblastome, en utilisant l'immunohistochimie chromogénique et le logiciel ImageJ. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que l'aspect de ces composants dans les échantillons de patients et la manière dont nous pouvons déterminer des rapports cellulaires physiologiquement pertinents. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité d'analyse sur des échantillons provenant de patients. Les implications de cette technique s'étendent à l'élucidation du microenvironnement tumoral complexe du glioblastome, encore mal caractérisé.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car le temps de développement chromogène doit être surveillé attentivement afin d'éviter une sur-développement et une saturation du tissu. Commencez le protocole en effectuant les lavages spécifiés dans le protocole textuel accompagnant. Diluez la solution de démasquage d'antigène à base de tris et à pH élevé avec de l'eau distillée selon les recommandations du fabricant.Passez à la récupération d'antigène médiée par la chaleur en ajoutant la solution de démasquage diluée à un récipient micro-ondable non scellé. Placez les lames dans le récipient. Ensuite, placez le récipient contenant les lames dans le micro-ondes.Ensuite, porter le récipient à ébullition pendant 20 minutes à puissance maximale. Surveiller le niveau du liquide en cas d'évaporation et compléter le récipient avec de l'eau distillée si nécessaire. Laisser refroidir les échantillons en solution pendant une heure à température ambiante.Délimitez l'échantillon de tissu avec un marqueur hydrophobe afin de minimiser le volume de réactifs nécessaire pour recouvrir l'échantillon. Ensuite, ajoutez suffisamment de solution de perméabilisation, entre 100 et 200 microlitres, pour couvrir l'échantillon de tissu. Retirez et jetez la solution, puis recouvrez à nouveau l'échantillon de tissu avec la solution de perméabilisation.Incuber les échantillons à température ambiante avec la solution de blocage pendant une heure. Ensuite, incuber les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius avec les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage. Le jour suivant, détecter les anticorps primaires à l'aide d'un réactif polymère de peroxydase de raifort correspondant à l'espèce hôte de l'anticorps primaire.Introduisez suffisamment de solution de perméabilisation pour recouvrir l'échantillon de tissu et incubez l'échantillon pendant cinq minutes. Retirez et jetez la solution, puis recouvrez à nouveau l'échantillon de tissu de solution de perméabilisation pendant cinq minutes supplémentaires. Incubez les lames dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,3 % et dans du TBS 1X pendant 15 minutes.Développer les échantillons avec un substrat de diaminobenzidine ou DAB pour la peroxydase pendant deux à dix minutes, jusqu'à l'obtention de l'intensité de coloration souhaitée. Contre-colorer les échantillons afin d'identifier les noyaux cellulaires, par exemple avec l'hématoxyline, en suivant le protocole du fabricant. Déshydrater les échantillons avec de l'éthanol à 100 % et du xylène.Enfin, montez les échantillons de manière permanente avec un milieu de montage. Deux régions d'intérêt au sein de nos résections tumorales, la masse principale de la tumeur et les régions adjacentes, composées principalement de tissu sain avec des cellules cancéreuses envahissantes diffuses, ont été identifiées par le neuropathologiste collaborateur sur des échantillons de patients colorés à l'hématoxyline et à l'éosine. L'immunohistochimie chromogénique a révélé une coloration positive pour les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes dans chaque échantillon de patient.Nous avons effectué une coloration sans anticorps primaire pour un contrôle négatif. Le fabricant a recommandé plusieurs dilutions supplémentaires avant de retenir une dilution au 1/200, en raison d'une coloration positive optimale du corps cellulaire et des prolongements, tout en minimisant le fond pour l'anticorps anti-ALDH1L1. À l'aide d'ImageJ, le pourcentage de recouvrement de la coloration des oligodendrocytes positifs pour OSP-1 a été quantifié afin de comparer ultimement les différences dans nos régions d'intérêt.Une fois le seuil approprié appliqué à l'image, le pourcentage de recouvrement issu du seuil peut être mesuré et comparé entre plusieurs patients. Cinq régions adjacentes et régions massives d'échantillons de patients atteints de glioblastome ou GBM, ainsi que du tissu cérébral sain, ont été comparés en fonction du pourcentage de recouvrement par la protéine spécifique des oligodendrocytes 1 ou OSP1. Une fois maîtrisée, la technique de coloration peut être réalisée en quatre heures le premier jour et deux heures le deuxième jour, si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller attentivement l'intensité de la coloration des tissus et leur hydratation.

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Source : Núñez, F. J., et al. Évaluation des biomarqueurs dans le gliome par immunohistochimie sur des cultures de gliome 3D de la neurosphère intégrées à la paraffine. J. Vis. exp. (2019). Cette vidéo fait la démonstration d’une technique immunohistochimique pour le marquage de biomarqueurs tumoraux dans les neurosphères tumorales cérébrales intégrées à la paraffine. Les sections de la neurosphère subissent une élimination de la paraffine et une réhydratation, suivies d’un traitement visant à...

Coloration immunohistochimique de biomarqueurs dans des coupes de la neurosphère d’une tumeur cérébrale

Protocole pour la propagation des spécimens chirurgicaux à haute teneur dissociés de gliome dans le milieu sans sérum de neurosphère pour sélectionner pour des cellules avec le phénotype de cellules souches cancéreuses. Pour les spécimens qui ne se développent pas en tant que neurosphères, un protocole alternatif est suggéré. Une technique de incorporation de paraffine pour maintenir l’architecture 3D de neurosphère pour immunocytochemistry est décrite.

Optimisation de la culture cellulaire de gliome de haut grade à partir d’échantillons chirurgicaux pour une utilisation dans des modèles animaux cliniquement pertinents et l’immunochimie 3D

Présenté ici est une méthode simple pour l'isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Nous décrivons ici une méthode pour séparer et enrichir les composants du microenvironnement tumoral immunitaire et non immuns dans les tumeurs sous-cutanées établies. Cette technique permet l’analyse distincte d’infiltrat immunitaire de tumeur et fractions de tumeur non immuns qui peuvent permettre la caractérisation complète du microenvironnement immunitaire de la tumeur.

Enrichissement et la caractérisation des tumeur immunitaire et Non immuns micro-environnements dans les tumeurs murines sous-cutanée établis

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

Neurospheres cultivés comme 3D cultures constituent un outil puissant pour étudier la biologie de gliome. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’immunohistochimie en conservant la structure 3D de gliome neurospheres par enrobage de paraffine. Cette méthode permet la caractérisation des propriétés neurosphère gliome tels que stemness et différenciation neurale.

Évaluation de biomarqueurs dans les gliomes par immunohistochimie sur la paraffine 3D gliome Neurosphère Cultures

La microdissection laser (LMD) est une technique sensible et hautement reproductible qui peut être utilisée pour découvrir des voies qui médité glioma hétérogénéité et invasion. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour isoler les zones discrètes du tissu de gliome utilisant le LMD laser suivi de l’analyse transcriptomique.

Microdissection laser de sous-régions de Glioma pour la caractérisation spatiale et moléculaire de l’hétérogénéité intratumorale, des oncostreams et de l’invasion

La dysrégulation protéomique joue un rôle important dans la propagation des gliomes infiltrant de manière diffuse, mais plusieurs protéines pertinentes restent non identifiées. Le traitement spatial numérique (DSP) offre une approche efficace et à haut débit pour caractériser l’expression différentielle des protéines candidates qui peuvent contribuer à l’invasion et à la migration des gliomes infiltrants.

Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Nous présentons une méthode de réplication du microenvironnement tumoral du gliome sur le front invasif qui intègre le flux de liquide interstitiel. Ce modèle est un hydrogel hyaluronane-collagène I dans un insert de culture tissulaire où une tête de pression de fluide peut être appliquée. L’invasion peut être quantifiée et les cellules peuvent être isolées ou lysées.

Un modèle photopolymérisable d’acide hyaluronique-collagène du microenvironnement invasif du gliome avec flux interstitiel

Ce protocole a préparé avec succès suffisamment de tissus néovasculaires de haute qualité à partir d’échantillons de gliome en utilisant une microdissection par capture laser pour l’analyse quantitative de protéomique de l’angiogenèse tumorale, surmontant les limites des études traditionnellement axées principalement sur les facteurs angiogéniques et fournissant un profil protéomique à grande échelle de l’angiogenèse du gliome.

Préparation des tissus néovasculaires à partir de tissus gliomes humains pour l’analyse quantitative de la protéomique de l’angiogenèse tumorale

Découvrez l'immunohistochimie chromogène pour analyser quantitativement le microenvironnement tumoral dans les résections de glioblastome. Cette méthode utilise ImageJ pour identifier les composants cellulaires et établir des ratios physiologiques pertinents.

Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

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