Immunohistochimie quantitatif du microenvironnement cellulaire dans les résections du glioblastome du patient

L'objectif général de ce protocole est d'identifier de manière quantitative les composants du microenvironnement tumoral dans des prélèvements de tissus tumoraux de patients atteints de glioblastome, en utilisant l'immunohistochimie chromogénique et le logiciel ImageJ. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du microenvironnement tumoral, telles que l'aspect de ces composants dans les échantillons de patients et la manière dont nous pouvons déterminer des rapports cellulaires physiologiquement pertinents. Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité d'analyse sur des échantillons provenant de patients. Les implications de cette technique s'étendent à l'élucidation du microenvironnement tumoral complexe du glioblastome, encore mal caractérisé.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car le temps de développement chromogène doit être surveillé attentivement afin d'éviter une sur-développement et une saturation du tissu. Commencez le protocole en effectuant les lavages spécifiés dans le protocole textuel accompagnant. Diluez la solution de démasquage d'antigène à base de tris et à pH élevé avec de l'eau distillée selon les recommandations du fabricant.

Passez à la récupération d'antigène médiée par la chaleur en ajoutant la solution de démasquage diluée à un récipient micro-ondable non scellé. Placez les lames dans le récipient. Ensuite, placez le récipient contenant les lames dans le micro-ondes.

Ensuite, porter le récipient à ébullition pendant 20 minutes à puissance maximale. Surveiller le niveau du liquide en cas d'évaporation et compléter le récipient avec de l'eau distillée si nécessaire. Laisser refroidir les échantillons en solution pendant une heure à température ambiante.

Délimitez l'échantillon de tissu avec un marqueur hydrophobe afin de minimiser le volume de réactifs nécessaire pour recouvrir l'échantillon. Ensuite, ajoutez suffisamment de solution de perméabilisation, entre 100 et 200 microlitres, pour couvrir l'échantillon de tissu. Retirez et jetez la solution, puis recouvrez à nouveau l'échantillon de tissu avec la solution de perméabilisation.

Incuber les échantillons à température ambiante avec la solution de blocage pendant une heure. Ensuite, incuber les échantillons toute la nuit à quatre degrés Celsius avec les anticorps primaires dilués dans la solution de blocage. Le jour suivant, détecter les anticorps primaires à l'aide d'un réactif polymère de peroxydase de raifort correspondant à l'espèce hôte de l'anticorps primaire.

Introduisez suffisamment de solution de perméabilisation pour recouvrir l'échantillon de tissu et incubez l'échantillon pendant cinq minutes. Retirez et jetez la solution, puis recouvrez à nouveau l'échantillon de tissu de solution de perméabilisation pendant cinq minutes supplémentaires. Incubez les lames dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 0,3 % et dans du TBS 1X pendant 15 minutes.

Développer les échantillons avec un substrat de diaminobenzidine ou DAB pour la peroxydase pendant deux à dix minutes, jusqu'à l'obtention de l'intensité de coloration souhaitée. Contre-colorer les échantillons afin d'identifier les noyaux cellulaires, par exemple avec l'hématoxyline, en suivant le protocole du fabricant. Déshydrater les échantillons avec de l'éthanol à 100 % et du xylène.

Enfin, montez les échantillons de manière permanente avec un milieu de montage. Deux régions d'intérêt au sein de nos résections tumorales, la masse principale de la tumeur et les régions adjacentes, composées principalement de tissu sain avec des cellules cancéreuses envahissantes diffuses, ont été identifiées par le neuropathologiste collaborateur sur des échantillons de patients colorés à l'hématoxyline et à l'éosine. L'immunohistochimie chromogénique a révélé une coloration positive pour les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes dans chaque échantillon de patient.

Nous avons effectué une coloration sans anticorps primaire pour un contrôle négatif. Le fabricant a recommandé plusieurs dilutions supplémentaires avant de retenir une dilution au 1/200, en raison d'une coloration positive optimale du corps cellulaire et des prolongements, tout en minimisant le fond pour l'anticorps anti-ALDH1L1. À l'aide d'ImageJ, le pourcentage de recouvrement de la coloration des oligodendrocytes positifs pour OSP-1 a été quantifié afin de comparer ultimement les différences dans nos régions d'intérêt.

Une fois le seuil approprié appliqué à l'image, le pourcentage de recouvrement issu du seuil peut être mesuré et comparé entre plusieurs patients. Cinq régions adjacentes et régions massives d'échantillons de patients atteints de glioblastome ou GBM, ainsi que du tissu cérébral sain, ont été comparés en fonction du pourcentage de recouvrement par la protéine spécifique des oligodendrocytes 1 ou OSP1. Une fois maîtrisée, la technique de coloration peut être réalisée en quatre heures le premier jour et deux heures le deuxième jour, si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller attentivement l'intensité de la coloration des tissus et leur hydratation.