En utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle C. Elegans

L’objectif global de cette procédure est de piéger efficacement une image de la transience calcique dans les neurones de la tête de C. Elegans mâles lors de l’exposition à des phéromones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la compréhension de la régulation des circuits neuronaux spécifiques au sexe. Le principal avantage de cette technique est que les C. Elegans mâles peuvent maintenant être imagés efficacement dans un dispositif de piège micro-fluidique.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à charger, car le chargement des animaux peut être difficile au début et les phéromones biogènes ne provoquent pas de transience calcique chez tous les animaux. Pour commencer l’assemblage des réservoirs, préparez trois ensembles de tubes en insérant une aiguille à une extrémité et un tube métallique à l’autre. Ensuite, pour chaque réservoir, prenez une valve Luer à trois voies et fixez une seringue de 30 millilitres avec son piston retiré, une seringue de trois millilitres et le tube.

Remplissez chaque réservoir avec le tampon approprié, soit le stimulus S basal, soit le stimulus S basal contenant de la fluorescine. Ensuite, retirez toutes les bulles d’air du réservoir et de la tubulure, en effleurant et en pompant la seringue. Maintenant, remplissez une nouvelle seringue de trois millilitres et un tube avec du S basal et insérez-le dans l’orifice de sortie du dispositif microfluidique.

Appliquez doucement une petite pression sur la seringue jusqu’à ce que le tampon apparaisse à la surface des trous d’entrée. Ensuite, connectez les tubes du contrôle de débit, du tampon et du réservoir de stimulus à leurs trous d’entrée appropriés, en vous assurant que des gouttes de liquide sont présentes à la fois sur le trou de l’orifice de chargement et sur le tube à fixer. Maintenant, appliquez doucement un peu plus de pression sur la seringue jusqu’à ce que des gouttelettes apparaissent dans l’entrée de l’orifice de chargement de la vis sans fin, puis insérez une goupille de blocage solide dans cet orifice.

Ensuite, retirez la seringue de l’orifice de sortie et fixez une conduite de sortie connectée à la maison du vide. Maintenant, inspectez l’appareil pour détecter toute bulle dans les canaux flottants du flux vidéo du microscope. Cliquez sur en direct, pour observer l’image en direct et attendez que les bulles se dissipent naturellement avant de continuer.

Ensuite, allumez la source de lumière fluorescente et utilisez un filtre GFP pour confirmer la bonne dynamique d’écoulement. Actionnez la vanne à trois ondes et observez le flux de contrôle fluorescent apparaître dans le flux vidéo, lorsque la vanne est ouverte. Pour commencer, choisissez un ver sur une plaque de gélose NGM non ensemencée et laissez le ver s’éloigner en rampant.

Ensuite, faites flotter la plaque avec S basal. Prélevez la solution contenant le ver dans la seringue. Maintenant, sur l’appareil, éteignez le vide pour arrêter le débit à l’aide de la valve Luer de sortie.

Ensuite, retirez la goupille solide qui bloque l’orifice de chargement de la vis sans fin. Insérez le tube contenant les vis sans fin dans l’orifice de chargement. Ouvrez le robinet Luer de sortie et observez le flux vidéo en direct.

Maintenant, appliquez une légère pression sur la seringue jusqu’à ce que le ver apparaisse. Tirez le ver vers en arrière s’il entre en premier dans la queue, il doit entrer la tête la première pour être exposé au stimulus. L’utilisateur doit tirer le ver vers vers l’arrière avant que la queue n’entre complètement dans le canal, sinon il est extrêmement difficile de faire sortir le ver du canal et nécessite généralement de rincer complètement le ver à travers le canal et de charger un nouveau ver.

Maintenant, en utilisant la pression de la seringue, faites avancer la vis sans fin dans le canal et positionnez la tête de la vis de manière à ce qu’elle soit exposée au flux tampon mais pas trop loin dans le canal, pour qu’elle soit libre de se déplacer. Une petite quantité de mouvement axial ou de rotation est attendue chez les animaux non paralysés. Bien que l’ajout d’un paralysant aux tampons élimine presque cet effet.

Pour réduire la probabilité de mouvement pendant l’essai, utilisez des mâles plus âgés qui sont piégés plus efficacement, diminuez la largeur ou l’épaisseur du port de chargement du ver ou augmentez le temps passé dans le paralytique. Utilisez le logiciel pour effectuer des enregistrements en utilisant l’excitation de la lumière bleue. Réglez l’exposition sur 100 millisecondes, ouvrez la fenêtre d’acquisition d’image, réglez les points temporels sur 300 avec un intervalle à zéro, puis lancez l’acquisition d’image.

Après cinq secondes, appliquez le stimulus en changeant la valve à trois voies contrôlant les tampons. Une stimulation de 10 secondes est un bon point de départ et la durée du stimulus peut être ajustée au besoin. Après la stimulation, rétablissez le flux en appuyant à nouveau sur le bouton et continuez l’enregistrement jusqu’à ce que la vidéo de 30 secondes soit terminée.

Cela permet à la fluorescence g camp de revenir à la ligne de base. Maintenant, laissez reposer la préparation pendant 30 secondes avant le prochain essai. Les vers exprimant g camp trois dans le neurone non susceptif, ASH, répondent à une molaire de glycérol avec des changements visibles de fluorescence dans le neurone ASH, indiquant une activité neuronale.

Le neurone doit rester dans la zone d’analyse pendant toute la durée de la vidéo, sinon un artefact de mouvement peut se produire. Si c’est le cas, déplacez la zone d’analyse de ces points temporels et fusionnez les valeurs d’intensité pour créer une seule trace. Les mâles qui sont stimulés par la phéromone biogénique attrayante ascaroside trois pendant l’exposition, la transémience calcique ont été mesurés dans les quatre neurones CEM.

D’un animal à l’autre et d’un neurone à l’autre, les traces variaient en forme, en signe et en grandeur. Ainsi, il est très important d’analyser de nombreux animaux lors de l’étude des réponses aux phéromones. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de charger un C elegans mâle dans un dispositif micro-fluidique et d’analyser la fugacité du calcium dans les neurones de la tête.

Le même processus peut être utilisé avec les hermaphrodites, pour identifier des différences spécifiques dans les réponses neuronales. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une demi-heure pour le premier animal imagé. Après le premier enregistrement, un nouvel animal peut être chargé en image en 10 minutes environ.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme l’optogénétique peuvent être combinées à ce protocole afin de mieux comprendre comment les circuits neuronaux sont régulés.