Name: En utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle C. Elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique dans les neurones de tête des mâles C. elegans en réponse aux phéromones à l'aide d'une puce olfactive microfluidique. Cette méthode permet d'étudier la régulation spécifique des circuits neuronaux.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Manuel Zimmer pour nous avoir fourni le fichier de conception initiale qui a été adapté pour une utilisation avec des mâles ; Frank Schroeder de synthèse et de fourniture de RRSA #3 ; Ross Lagoy de perspicacité et d’assistance avec l’imagerie et l’analyse ; et Laura Aurilio pour la fabrication de maître et qui, aux côtés de Christopher Chute, a contribué à l’examen de ce manuscrit. Ce travail a été financé sous le 1R01DC016058-01 de subvention du National Institutes of Health (J.S.), la National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) et le Burroughs Wellcome Career Award à l’Interface scientifiques (D.R.A.).

1. Fabrication de dispositifs Nota : voir référence 1.
 Remarque : moules maîtres de silicium ont été fabriquées à l’aide de techniques photolithographiques standard pour le patterning SU-8 photorésine sur un silicium maître 1 , 7. Masques pour la structuration de la plaquette ont été imprimés à 25 000 dpi. Les fonctionnalités du dispositif adapté au mâle une puce olfactif Chronis conçoivent 19 avec un changement dans le ver port de chargement, d’adapter un dessin obtenu de M. Zimmer (correspondance personnelle, 2016). Un virage est inclus pour contrôler la rotation des animaux. La largeur du chenal du port de chargement ver est réduite à 50 μm. Tous les canaux sont hauteur 32 μm. Une fois un moule maître de silicium est disponible pour l’utilisateur, l’utilisateur peut suivre la suite du protocole, comme décrit plus haut 1.
<ol><li>Agent PDMS Mix de base et polymérisation à un ratio de 10:1 en poids.</li>
	<li>Bien les mélanger avec des pipettes de transfert.</li>
	<li>Une solution contenant le mélange dans un dessiccateur à vide pendant 1 h, jusqu'à ce que toutes les bulles visibles sont enlevés.</li>
	<li>Verser le mélange sur un maître de moule silicone dans un plat de diamètre 150 mm, jusqu'à ce qu’il est de 5 mm d’épaisseur (100 g). Utiliser une pipette Pasteur pour enlever les bulles ou poussières qui ont été introduits dans le mélange.</li>
	<li>Cuire au four à 65 ° C pendant au moins 3 h, ou toute la nuit.</li>
	<li>Coupe le PDMS loin du moule à l’aide d’un scalpel et coupe les appareils séparés dehors à l’aide d’une lame de rasoir.</li>
	<li>, Percez des trous d’entrée et de sortie avec un coup de poing par voie cutanée de 1 mm.</li>
	<li>Rincer les trous avec dH 2 O, éthanol et encore une fois avec dH 2 O pour enlever les particules des coups de poing. Séchez l’appareil dans une impulsion de flux d’air.</li>
	<li>Nettoyer les côtés du canal et le dessus de l’appareil avec du ruban adhésif, enlever toute poussière ou débris restant sur l’appareil pour permettre une liaison réussie.</li>
	<li>Plasma-bond le dispositif, canal-vers le bas, d’un couvercle en verre n ° 1.
	Lamelle couvre-objet <ol><li>exposer et dispositif (canal vers le haut) à plasma d’air à l’aide de conditions permettant une bonne adhérence, par exemple 100 W pendant 30 s ou 24 W pour 60 s. 
		Remarque : Les paramètres est réglable pour améliorer l’efficacité du collage. Les conditions de liaison plasma ne sont pas aussi critiques que nettoyage correct lorsque vous tentez d’améliorer l’efficacité du collage. Un dispositif insuffisamment nettoyé vouloir pas le bon, même dans des conditions idéales de plasma.</li>
		<li>Inverser la lamelle couvre-objet sur le côté du chenal de l’appareil et appuyez vers le bas avec le pouce pendant 5 s.</li>
	</ol></li></ol> 2. Préparation de la mémoire tampon <ol><li>diluer 1 x S Basal (100 mM NaCl et 0,05 M KPO 4, pH 6,0) provenant d’un stock stérile 10 x.</li>
	<li>Diluer 1 M Tétramisole stock à une concentration finale de 1 mM, 1 x S Basal pour tous mettre en mémoire tampon des solutions.</li>
	<li>Ajouter fluorescéine à la fois la &#34; contrôle de flux &#34; et &#34; tampon &#34; réservoirs.
	<ol><li>Créer un stock de 100 mg/mL de fluorescéine dans 1 x Basal de S.</li>
		<li>Diluer le stock à la concentration finale de 1 µg/mL dans le contrôle de flux et de 0,1 µg/mL dans le tampon.</li>
	</ol></li> <li>Créer les stimuli.
	<ol><li>Glycérol dilué à une concentration finale de 1 M dans 1 X Basal de S.</li>
		<li>Diluée ascaroside #3 (RRSA #3) à une concentration finale de 1 µM dans 1 X Basal de S.</li>
	</ol></li></ol> 3. Device Setup Nota : voir 1.
 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig1.jpg" /> figure 1. Installation de dispositif microfluidique. (A) réservoirs et tuyauterie. Un 30 mL seringue sans un piston sert le &#34; réservoir. &#34; ceci est attenant à une vanne Luer avec trois options de flux. Une sortie est reliée à une seringue de 3 mL avec un piston, tandis que l’autre est reliée à une aiguille (orange) qui s’insère dans le tuyau qui se connecte à l’appareil de la microfluidique. (B), l’ensemble le programme d’installation de la microfluidique imaging experiment. Le dispositif est placé sur une scène d’un microscope à épifluorescence inversé, au-dessus de l’objectif. Le &#34; contrôle de flux &#34; tampon se déplace à travers une vanne 3 voies qui est commandée par une unité sur l’étagère au-dessus de l’installation. Les lignes contenant des tampons sont ensuite insérés dans les ports de périphérique approprié. (C) les ports du dispositif microfluidique. Le &#34; contrôle de flux &#34; ports flanquent les autres ports d’entrée : le &#34; stimulation &#34; et &#34; tampon &#34; ports. La &#34; prise &#34; port est le plus à droite. En raison de l’emplacement de l’arène de chargement de ver, le &#34; ver chargement &#34; port est le port plus centrale sur l’appareil. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig1large.jpg" target="_blank"> s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>Préparer trois réservoirs de liquides en joignant une seringue de 30 ou 60 mL Luer vanne à 3 voies, avec une seringue de 3 mL et une aiguille attachée à la valve de Luer ainsi (comme dans la Figure 1 a). Connecter l’aiguille à un tube qui s’étend au dispositif microfluidique (comme dans la Figure 1 a -B).</li>
	<li>Enlever les bulles d’air du réservoir et tube.</li>
	<li>Remplir la seringue de 3 mL avec tubulure avec 1 x S Basal et insérez-le dans la prise de port</li>
	<li>Exercez une légère pression sur la seringue jusqu'à ce que la mémoire tampon apparaît en haut des orifices d’admission.</li>
	<li>Connecter le contrôle de flux, de tampon et tubes de stimulation sur les trous d’entrée approprié (comme dans la Figure 1 b -C), veiller à ce que les gouttes de liquides sont présents sur les deux orifice de chargement du trou et le tube de tampon à apposer.</li>
	<li>Encore une fois, exercez une légère pression à la seringue qui est raccordée à l’orifice de sortie jusqu'à ce que les gouttelettes apparaissent dans le ver à l’entrée du port de chargement.</li>
	<li>Insérer une goupille de blocage solide dans le ver chargement port.</li>
	<li>Retirer la seringue de l’orifice de sortie et de fixer la ligne de sortie connectée au vide maison (-670 Torr).</li>
	<li>Inspecter l’appareil pour toutes les bulles dans le flux des chaînes, visuellement et par le biais de confirmation vidéo via un logiciel compatible avec l’appareil photo utilisé, par exemple le logiciel open source Micro-crèche. Voir l’étape 6 pour obtenir des conseils sur l’utilisation des Micro-Manager.
	<ol><li>Si les bulles sont présentes, attendez que les déloger ou être absorbés par le PDMS mur avant le chargement de tous les animaux, la présence de bulles perturbera le bon écoulement des fluides à travers le dispositif.</li>
	</ol></li> <li>à l’aide d’un filtre GFP, confirmer la dynamique de l’écoulement approprié au sein de l’appareil avant chargement en actionnant le robinet à 3 voies et en observant la commutation des tampons de ver.
	<ol><li>Déterminer la dynamique de l’écoulement : observer la fluorescéine présente dans les solutions de contrôle et de la mémoire tampon de débit ( Figure 2D -2E) changer lorsque la valeur de contrôle de flux est modifiée en appuyant sur la commande bouton correspondant à la vanne 3 voies sur le lien de la soupape ( Figure 1 b).</li>
		<li>Après ouverture Micro-Manager, cliquez sur &#34; Live &#34; pour observer une image en direct de l’appareil. Allumez la source de lumière fluorescente d’observer le flux des tampons dans le dispositif ( Figure 2D -2E).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56026/56026fig2.jpg" /> Figure 2 : Une mâle adaptés olfactif puce microfluidique. Patrons de (A), le débit de l’appareil quand le ver est exposé au tampon. Tampon (B) apparaît en marron, tandis que le mousseur (FC) est indiqué en jaune, avec relance (S) en blanc. Le ver à l’orifice de chargement a été adapté pour inclure une courbe qui permet de mieux contrôler l’orientation ver. Modèles (B), le débit de l’appareil quand le ver est exposé au stimulus. Tampon (B) apparaît en marron, tandis que le mousseur (FC) est indiqué en jaune, avec relance (S) en blanc. (C) des mesures de l’appareil adapté comme mécano. Le ver à l’orifice de chargement se termine par un 42 µm d’ouverture, avec un canal µm 50, conçu pour la largeur de sexe masculine. La hauteur mesurée des canaux est 32 µm, malgré une cible de 25 µm dans la conception. (D-E) A pris au piège les hommes exprimant p sra-6 :: GCaMP3. Le promoteur sra-6 n’est pas spécifique au frêne, et certaines expressions peuvent être observé dans le neurone ASI, mais aucun transitoires de calcium ont été observés dans l’ASI. L’image est (D), une combinaison de l’éclairement lumineux-zone et fluorescent, tandis que (E) n’est fluorescent. Les barres d’échelle indiquent 42 The ASH µm. (F), neurone répond à la stimulation de glycérol de 1 M avec activité neurale robuste. La zone bleue désigne le temps de l’impulsion de glycérol de 1 M. La région ombrée indique l’écart-type, avec n = 20 impulsions de sept vers. Les traces rouges correspondent aux réponses dépolarisantes. Les axes des ordonnées montrent ΔF/F 0. La barre d’échelle représente 5 s. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56026/56026fig2large.jpg" target="_blank"> s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
 4. préparation de l’animal Nota : voir référence 23.
<ol><li>Réponses ASH imaging au glycérol de 1 M.
	<ol><li>Place environ 20 c. elegans mâles qui sont positifs pour p sra-6 :: expression tableau GCaMP3 sur une nématode croissance moyenne (NGM) Gélose ensemencée avec une pelouse de OP50 e. coli. Utiliser les expressions du GECI fluorescente ou un marqueur de coinjection pour l’identification des animaux séropositifs au tableau. 
		NOTE : Les animaux positifs Array seront réagissent en selon le GECI utilisé (c.-à-d. animaux exprimant GCaMP sera réagissant en vert sous la stimulation de la lumière bleue, tandis que les Patriot04 animaux est réagissant en rouge sous stimulation feu vert). Marqueurs de coinjection peuvent varier entre autres protéines fluorescentes, comme GFP et DP, et marqueurs phénotypiques comme rol-6, ou peuvent sauver un phénotype dominant, tels que la mutation de pha-1 28.
		<ol><li>Si la cueillette immédiatement avant l’essai, les jeunes hommes adultes pick. Si la cueillette le jour avant le test, choisissez les larves mâles L4.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Imaging les réponses CEM à 1 µM RRSA #3.
	<ol><li>Pick environ 20 L4 c. elegans mâles (fkEx98 [p pkd-2 ::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1] ; Pha-1 (e2123ts) ; lui-5 (e1490) ; Lite-1 (ce314)) qui sont positifs pour l’expression de marqueurs coinjection dsRed. 
		NOTE : expression dsRed dans les neurones de ray du conte mâle est plus facile à observer et à confirmer que l’expression GCaMP dans les neurones CEM quatre.</li>
		<li>Isoler ces mâles de hermaphrodites sur une gélose au NGM ensemencé avec une pelouse de OP50 e. coli pour les 5-14 h avant de procéder à l’expérimentation d’imagerie. 
		NOTE : Mâles non isolés pendant au moins 5 h ne réagissent pas sur le plan comportemental au RRSA #3 et donc susceptible de présenter encore moins transitoires de calcium à l’ascaroside que celle observée ici.</li>
	</ol></li></ol> 5. Chargement animal Nota : voir refefence 1.
<ol><li>Choisir un ver sur une gélose ensemencée NGM utilisant des techniques de maintenance standard ver.
	<ol><li>Pick worms par flambage d’une pioche (en fil de platine aplati), cueillette de bactéries sur le choix, et &#34; tamponnant &#34; un ver pour le ramasser. Placez délicatement le ver sur la plaque de nouveau, ce qui lui permet de ramper hors sur sa propre.</li>
	</ol></li> <li>Ajouter environ 5 mL 1 x S basale à la plaque non ensemencée, telle que la plaque est inondée.</li>
	<li>Tirer le ver dans une seringue de chargement (c'est-à-dire, seringue de 3 mL avec tubulure) qui a été pré-rempli avec 1 x baso S.
	<ol><li>N’oubliez pas de sucer le ver uniquement dans le tube, pas complètement dans la seringue. 
		Remarque : Si le ver se rend dans la seringue, il est presque impossible de le récupérer dans la tubulure.</li>
	</ol></li> <li>Éteindre l’aspirateur pour arrêter l’écoulement en tournant la vanne Luer.</li>
	<li>Retirez la tige solide bloquant le ver chargement port.</li>
	<li>Tourner la soupape de Luer raccordée à l’orifice de sortie ( Figure 1 b) pour qu’il est ventilation. 
	Remarque : Utiliser une vidéo en direct pendant le chargement de la vis sans fin d’alimentation pour confirmer l’emplacement et l’orientation de l’animal (étapes 5,8-5,13).</li>
	<li>Insérer le ver tube dans le ver port de chargement de chargement</li>
	<li>Exercez une légère pression sur la seringue jusqu'à ce que le ver s’affiche dans le canal de chargement.</li>
	<li>Si le ver commence à entrer dans le chenal de queue en premier, tirez sur le piston de la seringue pour empêcher le ver dans le canal.</li>
	<li>Commutateur entre application et inverser la pression jusqu'à ce que la tête entre le canal première.</li>
	<li>Ouvrir le vide en tournant la vanne à 3 voies Luer raccordé à l’orifice de sortie de l’ouvrir de l’aspirateur au lieu de l’atmosphère.</li>
	<li>Presser manuellement en appuyant sur le piston de la seringue pour orienter et placer la tête de la vis sans fin telle qu’elle est exposée sur le canal d’écoulement de tampon, mais pas si loin que le chef peut se déplacer librement (D-2E de la Figure 2).</li>
</ol> 6. Stimulation et Acquisition <ol><li>à l’aide d’un logiciel open source microscopie, tels que Micro-Manager, enregistrer en capturant des images comme une pile TIFF à 10 images/s, utilisant l’excitation de la lumière bleue (470 nm) pendant 30 s.</li>
	<li>Régler l’exposition sur le menu principal pour Mme 100 <ol><li>Open &#34; multi-D Acq. &#34; dans le menu principal du logiciel. Définir la &#34; nombre &#34; à &#34; 300, &#34; et le &#34; intervalle &#34; à &#34; 0. &#34; cliquez &#34; Acquire ! &#34; pour acquérir la vidéo.</li>
	</ol></li> <li>Appliquer une impulsion de 10 s de stimulation 5 s après le lancement d’acquisition. Ajuster la durée d’application de la stimulation comme vous le souhaitez.
	<ol><li>Après l’acquisition de 5 s de vidéo, changer la vanne 3 voies contrôlant le tampon de contrôle de flux pour appliquer le stimulus à l’animal mis à l’essai. Cliquez sur le bouton le plus à gauche sur le lien de la soupape ( Figure 1 b).</li>
		<li>Après 10 s de l’exposition de relance (ce temps peut être ajusté comme souhaité par l’utilisateur), modifier le flux des tampons de nouveau en appuyant sur le bouton le plus à gauche sur le lien de la vanne.</li>
	</ol></li> <li>Record sous tampon seulement jusqu'à la fin de la fenêtre de 30 s pour permettre la fluorescence de GECI revenir au niveau de référence.</li>
	<li>Répéter comme vous le souhaitez. Attendre 30 s entre la fin de l’acquisition et l’ouverture du procès suivant.</li>
</ol> 7. Analyse d’image <ol><li>ouvrir la pile TIFF avec le logiciel open-source, ImageJ, en faisant glisser le fichier dans la fenêtre de ImageJ.</li>
	<li>Cliquez sur l’aide du curseur et faites glisser pour définir la zone d’intérêt (ROI) dans le neurone d’intérêt. Définir la zone d’inclure le soma des neurones d’intérêt (comme dans la Figure 3 a).</li>
	<li>Tracer la z-pile de l’intensité de la fluorescence du ROI dans l’ensemble de piles en cliquant sur Ouvrir-&#62; Image - &#62; piles - &#62; tracer le profil z.</li>
	<li>Click &#34; liste &#34; dans la fenêtre qui s’ouvre. Cliquez sur Edit - &#62; copier pour copier les valeurs. Coller les valeurs dans un tableur.</li>
	<li>Analyser la fluorescence de fond pour chaque impulsion en faisant glisser le ROI à une région du ver qui ne contient-elle pas d’expression GCaMP.</li>
	<li>Exécuter la soustraction de fond pour chaque impulsion en soustrayant la valeur background de fluorescence de la valeur d’intensité de fluorescence neuron.</li>
	<li>Calculer ΔF/F 0 pour chaque image de chaque impulsion.
	<ol><li>Calculer F 0 comme valeur moyenne intensité du ROI pour 1 première s d’acquisition (par exemple, les cadres de 1-10).</li>
		<li>Calculer ΔF/F 0 en divisant la valeur soustraite à l’arrière-plan de l’image d’intérêt par la valeur calculée de 0 F.</li>
	</ol></li> <li>Répétez pour chaque neurone imagé et chaque impulsion de stimulus.</li>
	<li>De neurones avec des profils de réponse cohérente, tels que les cendres, en moyenne toutes les impulsions de chaque neurone et calculer le SEM (comme dans la Figure 2F).</li>
	<li>Tracer la moyenne ΔF/F 0 avec SEM au fil du temps pour chaque neurone. 
	Remarque : Dans ce cas, il est pratique courante d’inclure les heatmaps des réponses neuronales individuels de chaque essai aussi bien. Dans les neurones qui ne montrent pas compatibles changements transitoires de calcium lors de l’exposition à des stimuli à travers des stimulations répétées, ou dans différents individus 23, il peut être plus il y a lieu de montrer des traces d’impulsion (comme dans la figure 4). Voir la Discussion pour plus d’informations sur déterminer comment afficher les données.</li>
</ol>

<ol><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li>
<li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior%2C+nerve+regeneration%2C+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 561-567 (2009).</li>
<li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worm+chips%3A+Microtools+for+C.+elegans+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li>
<li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li>
<li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023(2016).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neuro%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).</li>
<li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li>
<li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li>
<li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li>
<li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+Lon%22%5BJournal%5D)">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li>
<li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li>
<li>Sammut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-derived+neurons+are+required+for+sex-specific+learning+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia-derived neurons are required for sex-specific learning in C. elegans.</a> Nature. 526 (7573), 385-390 (2015).</li>
<li>Sulston, J. E., Albertson, D. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+male%3A+postembryonic+development+of+nongonadal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans male: postembryonic development of nongonadal structures.</a> Dev Biol. 78 (2), 542-576 (1980).</li>
<li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons%3A+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> The EMBO Journal. 24 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org/chapters/www_transformationmicroinjection/transformationmicroinjection.html">Transformation and microinjection.</a> WormBook. , (2006).</li>
<li>Cáceres, I. dC., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+Orienting+C.+elegans+Using+Geometry+at+Microscale+for+High-Throughput+Visual+Screens+in+Neurodegeneration+and+Neuronal+Development+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Laterally Orienting C. elegans Using Geometry at Microscale for High-Throughput Visual Screens in Neurodegeneration and Neuronal Development Studies.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35037(2012).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>García, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li>
<li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescent+%26%2334%3Blipofuscin+granules%26%2334%3B+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The autofluorescent &#34;lipofuscin granules&#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li>
<li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La puce olfactive adaptées au mâle incorpore un virage dans un orifice de chargement plus étroit, qui permet plus de contrôle de l’orientation et le piégeage efficace des hommes c. elegans. Cela permet la visualisation des deux membres gauche et droite du neuronales paires bilatérales, sans besoin de z d’empilage. Cette courbe conduit à une orientation loin vertical 100 % du temps à worms où seule paire bilatérale s’adresse à un marqueur fluorescent, tels que les cendres (Figure 2D<...

Dispositifs microfluidiques fournissent un accès accru à précisément les environnements maîtrisés, où animaux, tels que le nématode c. elegans, peut être manipulée expérimentalement1. Ces études comprennent des tests comportements, études d’imagerie calcique ou même des projections pour les phénotypes spécifiques, résultant en des mesures plus exactes des résultats expérimentaux1,2,3,4, 5,6. Microfluidique offrent des conditions liquides à petite échelle à travers lequel les expériences détaillées peuvent être exécutées tout en utilisant des quantités minimales de réactifs. Il y a une production constante de nouvelles conceptions de dispositif microfluidique, et l’utilisation de chacun varie, entre les arènes permettant le mouvement naturel sinusoïdal de c. elegans , des essais comportements et des études d’imagerie neuronales piéger les appareils utilisés en imagerie neurale et études olfactifs, aux appareils qui permettent de haut débit analyse phénotypique en génétique écrans4,5,6,7. Suite à la fabrication d’un moule maître, Dispositifs microfluidiques sont peu coûteux à construire, compte tenu de la réutilisabilité du maître — et facile à utiliser, permettant la génération de données rapide via des études de haut débit. La fabrication des dispositifs à l’aide de polymères comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) permet la création de nouveaux dispositifs dans les heures.
Études d’imagerie calcique utilisent des indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) exprimés dans les cellules de cible pour mesurer la dynamique neuronale de ces cellules en temps réel8,9,10,11. La nature transparente de c. elegans permet l’enregistrement des niveaux fluorescents de ces protéines dans les animaux vivants. Traditionnellement, GECIs dépendent de la protéine fluorescente verte (GFP)-base de capteur GFP-calmoduline-M13 Peptide (GCaMP), bien que des études plus récentes ont adapté ces capteurs permettant de meilleurs ratios signal-bruit et profils d’excitation décalée vers le rouge. Suite au développement de GCaMP3, avec ces spécifications, les protéines ont varié, y compris les capteurs tels que GCaMP6s et GCaMP6f (lent et rapide de fluorescence hors-taux, respectivement), ainsi que de la DP-calmoduline-M13 Peptide (Patriot04), qui a une décalée vers le rouge Profil de l’activation. La combinaison de ces GECIs avec séquences promotrices de c. elegans gène spécifique des cellules peut cibler des cellules d’intérêt, les neurones sensoriels en particulier12,13,14,15 , 16.
Alors que la facilité d’utilisation de c. elegans en microfluidique études est apparente, presque toutes les études ont porté sur les hermaphrodites. Malgré les hommes représentaient seulement 0,01-0,02 % de la population de souche sauvage, conclusions inestimable peuvent découler de leur caractérisation. Tandis que le connectome physique du système nerveux hermaphrodite a été entièrement localisé pour des décennies17, le mâle connectome reste incomplète, en particulier dans la région céphalique des animaux18. L’utilisation d’imagerie calcique chez les mâles aideront à créer une compréhension du système nerveux mâle et les différences qui surviennent entre les deux sexes. La petite taille des mâles adultes de c. elegans empêche un piégeage efficace et fiable dans les ports de chargement des appareils olfactifs traditionnels conçus pour agrandissement hermaphrodites. Pour y remédier, une version modifiée de la puce olfactif Chronis19 a été développée avec un orifice de chargement plus étroit, une hauteur inférieure à canal et se transforme dans l’orifice de chargement du ver (qui tournent l’animal), permettant la visualisation de bilatérale gauche/droite paires neuronales. Cette conception permet : (1) le recouvrement efficace de jeunes mâles adultes, (2) une orientation plus fiable de l’animal pour la visualisation des deux membres de neurones paires bilatérales et (3) l’imagerie précise de l’activité neuronale dans les neurones masculins.
De plus en plus, des études montrent que le c. elegans mâles réagissent différemment des hermaphrodites à une variété d’ascarosides (RRSA) ou nématode phéromones20,21,22,23 ,,24. Par conséquent, développer une compréhension de la dynamique neuronale et les représentations au sein de la connectome mâle est devenu encore plus pertinente. Mâles de c. elegans contiennent 87 sexe neurones non présents dans les hermaphrodites25,26, altérant la connectome en tant que-façons encore indéterminé. Être capable à l’image de ces dynamiques de neurones uniques nous permettra à mieux comprendre les réponses selon le sexe et représentations neurales.
Ce protocole décrit l’utilisation d’une puce olfactive adaptées au mâle pour l’imagerie neurale du mâle c. elegans chémosensation. Le neurone nociceptif QU'ASH répond sûrement à 1 M glycérol chez les mâles, conformes aux précédentes hermaphrodite études27. Exposition à ascarosides peut provoquer des réponses qui sont variables d’un animal à l’autre, nécessitant un plus grand nombre d’animaux à tester. La réponse des neurones spécifiques aux mâles CEM a déjà été démontrée, par électrophysiologie et de calcium, imagerie, répondre variablement à ascaroside #323.

<table><tbody><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Développeur</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Wafer Mask</td><td>Cad / Art</td> <td>Services-Commande</td> <td>personnalisée. Imprimé à 25 000 dpi.</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhésifs</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Poinçons dermiques</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>Tube souple</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Tube dur</td><td>IDEX Santé & Science</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>New England Petit Tube</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr><tr><td>Broches de blocage</td><td>New England Petit Tube</td><td>0.415/0.425" OD x .500 Long</td><td>Batch PB07027</td></tr><tr><td>Seringues de 3 mL</td><td>309657</td><td></td><td>Seringues de</td></tr><tr><td>30 mL</td><td>Vitality Medical</td><td>302832</td><td>Utilisé comme réservoirs tampons.</td></tr><tr><td>Aiguille émoussée en acier inoxydable de calibre 23, polyprolylène Luer</td><td>Component Supply Company</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr><tr><td>Robinets d’arrêt avec raccords Luer ; 3 voies ; serrure mâle ; 5 modèles de flux ; non stérile</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-30600-07</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Système de contrôle Mercator LF-5 Système plasma</td><td>Mercator</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>Series 20 Chambre</td><td>Warner Instruments</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>Déshydratant sous vide</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>420250000</td><td>24 cm de diamètre intérieur.</td></tr><tr><td>Pesées</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>Classic Plus Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>Four</td><td>Sheldon Manufacturing Inc</td><td>9120993</td><td>Numéro de modèle : 1500E.</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri de 60 mm, non ventilées, à arêtes vives</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss-Hammamatsu</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Lumière Fluorescente</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>Adaptateur d’éclairage</td><td>Zeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>Series 1 et 2 Vanne d’isolement miniature en PTFE inerte</td><td>Parker</td><td>001-0017-900</td><td>Vanne à 3 voies pour le contrôle du débit.</td></tr><tr><td>ValveLink8.2&reg ;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager-Free</td><td></td> <td>logiciel, peut être téléchargé sur : https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td> <td>ImageJ-Free logiciel, peut être téléchargé sur : https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td><td></td></tr> <tr><td>Agar, Bacteriological</td><td>Grade Apex</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tétramisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S-250mg</td><td>sensible à la lumière. Conserver dans des flacons photoprotecteurs.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td><td></td><td></td> - <td>synthétisé dans le laboratoire Schroeder (Université Cornell).</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td>-</td><td>-</td><td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6 ::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Développé dans le laboratoire Bargmann. Fourni par la bibliothèque Albrecht Lab.</td></tr><tr><td>Ligne CEM GCaMP6</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2 ::GCaMP ::SL2 ::d sRED + pBX-1] ; pha-1(e2123ts) ; him-5(e1490) ; lite-1(ce314)). Développé par Robyn Lints. Fourni par la bibliothèque du laboratoire Srinivasan.</td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Centre de Génétique</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>"Réservoir</td><td> »</td><td>--</td><td>Pour créer un Réservoir : Une « seringue de 30 ml », est connectée à un « Robinet d’arrêt avec raccords Luer ; 3 voies ; serrure mâle ; 5 modèles de débit ; non stérile », qui est connecté à une « seringue de 3 ml » et à une « aiguille émoussée en acier inoxydable de calibre 23, Polyprolylène Luer". L’aiguille émoussée en acier inoxydable de calibre 23, polyprolylène Luer est ensuite insérée dans un tube souple à environ 1/3 de la longueur de l’aiguille.</td></tr></tbody></table>

en utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle c. elegans

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

L’utilisation d’indicateurs de calcium a grandement amélioré notre compréhension de la dynamique des neurones et de la réglementation. Le nématode Caenorhabditis elegans, avec ses entièrement cartographiée du système nerveux et l’anatomie transparent, présente un modèle idéal pour comprendre la dynamique neuronale en temps réel en utilisant des indicateurs de calcium. En combinaison avec les technologies microfluidiques et expérimentaux, les études d’imagerie calcique à l’aide de ces indicateurs sont réalisées chez l’animal de mouvement libre et pris au piège. Cependant, la plupart des études précédentes utilisant des dispositifs de piégeage, tels que la puce olfactive décrit dans Chronis et al., d’appareils conçus pour utilisation dans l’hermaphrodite plus commun, le mâle moins commun est à la fois structurellement et morphologiquement dissemblables. Une puce olfactive adaptée a été conçue et fabriquée pour une efficacité accrue dans l’imagerie neuronale mâle avec l’aide de jeunes animaux adultes. Un virage a été incorporé dans le ver port pour faire pivoter les animaux et pour permettre la séparation des neurones individuels au sein d’une paire bilatérale en imagerie 2D de chargement. Vers sont exposés à un écoulement contrôlé de substance odorante au sein du dispositif microfluidique, tel que décrit dans les précédentes études hermaphrodites. Transitoires de calcium sont ensuite analysées en utilisant le logiciel open source ImageJ. La procédure décrite ci-après devrait permettre une plus grande quantité de base mâle c. elegans calcium imagerie, approfondir notre compréhension des mécanismes de signalisation neuronale spécifique au sexe.

Un exemple de la configuration du dispositif global peut être vu dans la Figure 1 a-B. Figure 1 a dépeint la construction correcte de réservoir et configuration. Figure 1 b montre les connexions des réservoirs pour le dispositif microfluidique. La figure 1 représente un dispositif microfluidique avec différents ports étiquetés pour plus de clarté.
<p...

L’utilisation d’une « puce olfactive » adaptée pour l’imagerie calcique efficace de c. elegans mâles est décrite ici. Études sur l’exposition de glycérol et d’une phéromone mâle sont également indiqués.

En utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

L'objectif général de cette procédure est de piéger efficacement une transitoire calcique dans les neurones de la tête de mâles de C. elegans suite à une exposition à des phéromones. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que la compréhension de la régulation des circuits neuronaux spécifiques au sexe. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'observer désormais efficacement les mâles de C. elegans à l'aide d'un dispositif de piégeage microfluidique.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car le chargement des animaux peut être difficile au départ et les phéromones biogéniques n'induisent pas de transitoire calcique chez chaque animal. Pour commencer l'assemblage des réservoirs, préparez trois jeux de tubulures en insérant une aiguille à une extrémité et un tube métallique à l'autre. Ensuite, pour chaque réservoir, prenez un robinet en té à raccord luer et fixez une seringue de 30 millilitres sans piston, une seringue de trois millilitres et la tubulure.Remplissez chaque réservoir avec le tampon approprié, soit le tampon S basal, soit le S basal contenant de la fluorescéine. Ensuite, éliminez toutes les bulles d'air présentes dans le réservoir et le tube en tapotant et en actionnant la seringue. Remplissez maintenant une nouvelle seringue de trois millilitres et son tube avec du S basal, puis insérez-la dans le port de sortie du dispositif microfluidique.Appliquez doucement une légère pression sur la seringue jusqu'à ce que le tampon apparaisse à la surface des orifices d'entrée. Ensuite, connectez les tubes de contrôle d'écoulement, de tampon et de réservoir de stimulus à leurs orifices d'entrée respectifs, en veillant à ce que des gouttes de liquide soient présentes à la fois sur l'orifice du port de chargement et sur le tube à raccorder. Appliquez ensuite légèrement plus de pression sur la seringue jusqu'à l'apparition de gouttelettes dans l'orifice d'entrée du port de chargement du ver, puis insérez une épingle de blocage solide dans ce port.Ensuite, retirez la seringue du port de sortie et fixez un tuyau de sortie relié à la pompe à vide. À présent, examinez l'appareil à la recherche de bulles dans les canaux du flotteur sur l'image transmise par le microscope. Cliquez sur « live » pour observer l'image en direct et attendez que les bulles disparaissent naturellement avant de poursuivre.Ensuite, allumez la source de lumière fluorescente et utilisez un filtre GFP pour confirmer les dynamiques d'écoulement adéquates. Actionnez la vanne à trois ondes et observez le courant de contrôle fluorescent apparaître sur la vidéo lorsque la vanne est ouverte. Pour commencer, sélectionnez un vers sur une boîte de gélose NGM non ensemencée et laissez le vers ramper loin. Ensuite, faites flotter la plaque avec le milieu S basal. Aspirez la solution contenant le vers dans la seringue. Maintenant, sur l'appareil, fermez le vide pour arrêter l'écoulement à l'aide de la vanne luer de sortie.Ensuite, retirez l'épingle solide qui bloque le port de chargement des vers. Insérez le tube contenant les vers dans le port de chargement. Ouvrez la vanne luer de sortie et observez le flux vidéo en direct.Appliquez maintenant une pression douce sur la seringue jusqu'à ce que le ver apparaisse. Ramenez le ver en arrière s'il entre par la queue ; il doit entrer par la tête afin d'être exposé au stimulus. L'utilisateur doit retirer le ver avant que la queue n'entre complètement dans le canal, sinon, il devient extrêmement difficile d'extraire le ver du canal et il faut généralement le faire passer entièrement à travers le canal, puis charger un nouveau ver.Maintenant, à l’aide de la pression exercée par la seringue, faire avancer le vers dans le canal et positionner sa tête de manière à ce qu’elle soit exposée au flux de tampon, sans toutefois l’insérer trop profondément dans le canal, au point qu’il puisse se déplacer librement. Un léger mouvement axial ou rotationnel est attendu chez les animaux non paralysés. Bien que l’ajout d’un agent paralysant aux tampons élimine presque entièrement cet effet.Pour réduire la probabilité de mouvement pendant l'essai, utilisez des mâles plus âgés, qui sont piégés plus efficacement, diminuez la largeur ou l'épaisseur du port de chargement des vers, ou augmentez la durée passée dans le paralytique. Utilisez le logiciel pour effectuer des enregistrements à l'aide d'une excitation par lumière bleue. Réglez le temps de pose à 100 millisecondes, ouvrez la fenêtre d'acquisition d'images, réglez le nombre de points temporels à 300 avec un intervalle nul, puis démarrez l'acquisition d'images.Après cinq secondes, appliquez le stimulus en modifiant le robinet à trois voies qui contrôle les tampons. Une stimulation de 10 secondes constitue un bon point de départ, et la durée du stimulus peut être ajustée selon les besoins. Après la stimulation, rétablissez l'écoulement en appuyant à nouveau sur le bouton et poursuivez l'enregistrement jusqu'à la fin de la vidéo de 30 secondes.Cela permet à la fluorescence de g camp de revenir à la ligne de base. Laissez maintenant le prélèvement reposer pendant 30 secondes avant le prochain essai. Les vers exprimant g camp trois dans le neurone ASH, sensible au no, répondent à un glycérol un molaire par des changements visibles de fluorescence au sein du neurone ASH, indicatifs d'une activité neuronale.Le neurone doit rester dans la zone d'analyse pendant toute la durée de la vidéo, sinon un artefact de mouvement peut survenir. Dans ce cas, déplacez la zone d'analyse pour ces points temporels et fusionnez les valeurs d'intensité afin de créer un seul tracé. Chez les mâles stimulés par le phéromone biogénique attractif ascaroside trois pendant l'exposition, la transitoire en calcium a été mesurée dans les quatre neurones CEM.D'animal à animal et de neurone à neurone, les tracés variaient en forme, en signe et en amplitude. Il est donc très important d'analyser de nombreux animaux lors de l'étude des réponses aux phéromones. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de charger un mâle C elegans dans un dispositif microfluidique et d'analyser la transience calcique dans les neurones de la tête.Le même processus peut être utilisé avec des hermaphrodites, afin d'identifier des différences spécifiques à la lignée sec dans les réponses neuronales. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une demi-heure pour le premier animal imagé. Après le premier enregistrement, un nouvel animal peut être chargé et imagé en environ 10 minutes.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'optogénétique peuvent être combinées à ce protocole afin de mieux comprendre la régulation des circuits neuronaux.

using-an-adapted-microfluidic-olfactory-chip-for-imaging-neuronal

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous décrivons une technique mis en place pour mesurer et analyser les odeurs évoquées réponses calciques dans le lobe antennaire de la...

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

Cet article présente les protocoles d'intrinsèques des signaux optiques et d'imagerie d'autofluorescence flavoprotéines signaux de cartographier les odeurs évoquées activités à la surface du bulbe olfactif chez la souris.

Activités d&#39;imagerie Odeur évoqués dans le bulbe olfactif de la souris en utilisant la réflectance optique et Signaux Autofluorescence

Un dispositif simple microfluidique a été développé pour effectuer anesthésie...

Simple Dispositifs microfluidiques pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Et le poisson-zèbre

Nous décrivons ici une lecture moléculaire adaptation à long terme...

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

Nous démontrons variations de la technique d'enregistrement multi-unité extracellulaire de caractériser les odeurs réponses évoquées dans les trois premières étapes de la voie olfactive invertébrés. Ces techniques peuvent être facilement adaptés pour examiner l'activité d'ensemble dans d'autres systèmes neuronaux ainsi.

Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du 3ème stade larvaire chez la drosophile.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Nouveaux outils pour la recherche de mécanobiologie sont nécessaires pour comprendre les contraintes mécaniques comment active des voies biochimiques et suscite des réactions biologiques. Ici, nous présentons une nouvelle méthode de stimulation mécanique sélective des animaux immobilisée avec un piège de microfluidique permettant l’imagerie à haute résolution des réponses cellulaires.

En utilisant un dispositif microfluidique pour une Stimulation mécanique et l’imagerie haute résolution de c. elegans

Ce protocole décrit l’utilisation de codé génétiquement Ca2 + reporters de consigner les changements dans l’activité neuronale en comportement vers Caenorhabditis elegans .

Imagerie ratiométrique Calcium des neurones individuels en comportement Caenorhabditis Elegans

Le protocole décrit une conception simple de puces microfluidiques et une méthodologie de microfabrication utilisées pour cultiver C. elegans en présence d’un approvisionnement alimentaire continu jusqu’à 36 heures. Le dispositif de croissance et d’imagerie permet également une imagerie intermittente à haute résolution à long terme des processus cellulaires et sous-cellulaires pendant le développement pendant plusieurs jours.

Une puce microfluidique simple pour la croissance à long terme et l’imagerie de Caenorhabditis elegans

Ce protocole établit des méthodes pour extraire et quantifier les réponses à la phéromone sexuelle volatile chez C. elegans, fournissant des outils pour étudier la communication chimique et la trajectoire de navigation.

Extraction de phéromones sexuelles volatiles et test de chimioattraction chez Caenorhabditis elegans

Ce protocole décrit l’imagerie microfluidique de C. elegans tout au long du développement post-embryonnaire.

Imagerie haute résolution de C. elegans à tous les stades larvaires

Découvrez l'imagerie calcique dans les neurones de tête des mâles C. elegans en réponse aux phéromones à l'aide d'une puce olfactive microfluidique. Cette méthode permet d'étudier la régulation spécifique des circuits neuronaux.

En utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle C. Elegans (Vidéo) | JoVE Journal

En utilisant une puce olfactif microfluidique adapté pour l’imagerie de l’activité neuronale en réponse aux phéromones dans les neurones de tête mâle C. Elegans

Explorer plus de vidéos