Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les kératinocytes primaires de souris de la peau de souris néonatales ou adultes à partir de leur différenciation in vitro ou d’étudier leurs réponses immunitaires innées à l’exposition aux UVb. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie épidermique sur la façon dont la différenciation des kératinocytes est régulée ou comment les kératinocytes épidermiques réagissent aux stimuli externes. Les principaux avantages de cette technique sont que les kératinocytes peuvent être isolés de manière conventionnelle à partir de la peau de souris, de souris néonatales et de souris adultes et qu’ils peuvent être cultivés avec notre sérum.

Fengwu Li, un associé de recherche de mon laboratoire, fera une démonstration de la procédure avec moi. Commencez par retirer les membres d’une souris néonatale de type sauvage C57 BL6 postnatal zéro à deux, juste au-dessus des articulations enchevêtrées du poignet et coupez complètement la queue en laissant une petite boule. Insérez des ciseaux pointus dans le trou de la queue et coupez la peau le long de la ligne médiane dorsale du corps jusqu’à l’ouverture sur le cou.

À l’aide d’une pince, saisissez le corps exposé et utilisez une autre pince pour saisir la peau. Ensuite, retirez doucement toute la peau du corps et sur les moignons des jambes en un mouvement continu, en prenant soin de ne pas casser la peau en morceaux. Rincez la peau pelée avec 50 millimètres de PBS stérile dans une boîte de Pétri de 10 centimètres et placez la peau dans un tube de deux millilitres contenant du gel froid, un tampon de digestion de dispase, en veillant à ce que la peau ne soit pas pliée.

Lorsque toutes les feuilles de peau néonatale ont été prélevées, placez le tube sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, versez le contenu du tube dans une nouvelle boîte de Pétri. Ensuite, transférez chaque morceau de tissu dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 50 millilitres de PBS stérile pour éliminer tout excès de dispase.

À l’aide de deux pinces, placez les échantillons de peau dans des boîtes de Pétri individuelles, côté épidermique vers le bas et étirez soigneusement les plis de la peau de manière à ce que les morceaux soient complètement étendus sur le fond de la boîte. Ajoutez 500 microlitres d’une solution de digestion à base de trypsine dans chaque plat et utilisez une pince pour soulever lentement chaque derme vers le haut et loin de l’épiderme, tout en maintenant l’épiderme en place avec une deuxième pince. Faites flotter les épidermes isolés dans la solution de trypsine avec les niveaux basaux vers le bas et couvrez les plats.

Ensuite, incubez les morceaux de peau sur un agitateur horizontal à température ambiante, en agitant doucement pendant 20 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez deux millilitres de milieu de croissance de kératinocytes supplémenté par épiderme dans chaque boîte de Pétri et utilisez une pince pour frotter vigoureusement les feuillets épidermiques en libérant les cellules individuelles du tissu cutané. Lorsque le milieu devient trouble, inclinez les plats pour permettre la collecte et le transfert des suspensions cellulaires dans un nouveau tube.

Laisser le tissu épidermique restant dans le plat. Après le troisième tour de collecte de cellules, triturez doucement la suspension cellulaire regroupée à quelques reprises pour briser les amas de cellules, et filtrez les cellules à travers une passoire de 100 microns dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre doucement la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de croissance de kératinocytes froid sur de la glace, pour le comptage.

Ensemencez les cellules à une densité de 5x10 à quatre centimètres carrés dans un milieu de croissance de kératinocytes dans des boîtes cultivées, pré-enrobées d’un produit de matrice extracellulaire qui favorise l’attachement cellulaire. Ensuite, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en remplaçant quotidiennement le surnageant par un milieu frais jusqu’à ce que les cellules aient atteint la confluence appropriée. Pour isoler les kératinocytes d’une souris adulte, retirez d’abord la queue à sa base.

Suivi d’un retrait d’environ deux millimètres de l’extrémité de la queue afin qu’il y ait un trou visible. Utilisez une lame tranchante pour couper le long de la peau de la queue de la base à la pointe. Ensuite, à l’aide d’une pince pour saisir le coccyx exposé et d’une autre pince pour saisir la peau, décollez doucement le tissu cutané de l’os en un mouvement continu.

Coupez la peau pelée à mi-chemin, de sorte que chaque morceau mesure moins de deux à trois centimètres de long, et rincez les morceaux dans 15 millilitres de PBS stérile dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Placez les peaux d’un maximum de cinq queues dans un tube de 15 millilitres contenant jusqu’à 12 millilitres de liquide de glace, dispasez le tampon de digestion et incubez les peaux pendant la nuit à quatre degrés Celsius, avec rotation. Le lendemain matin, isolez les cellules épidermiques des feuillets de peau partiellement digérés, comme cela vient d’être démontré pour les échantillons de peau néonatale.

Ensuite, ensemencez les cellules kératinocytaires adultes isolées à une densité centimétrique centimètre carrée de puissance cinq dans un milieu de croissance de kérétioncytes dans des boîtes de culture pré-enrobées de collagène. Changer le surnageant tous les jours, jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence appropriée. Pour induire la différenciation terminale de l’un ou l’autre type de culture de kératinocytes, ajoutez du chlorure de calcium pour les cellules à des concentrations nanomolaires de 2

Pour la mort induite par l’irradiation UVb, remplacez le milieu de croissance d’une culture de kératinocytes confluents par 500 microlitres de PBS et exposez brièvement les cellules à 15 millijoules par centimètre carré d’UVb. Remplacez le PBS par un milieu de croissance frais et remettez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant six heures. Après avoir collecté le milieu conditionné à chaque point temporel expérimental, quantifiez la viabilité cellulaire à l’aide du kit de comptage cellulaire, selon les instructions du fabricant.

Mesurez ensuite le TNL pour qu’il soit libéré par les kératinocytes irradiés dans un milieu conditionné selon les protocoles standard. Les kératinocytes épidermiques du mode primaire, plaqués et maintenus à 06 nanomolaires de chlorure de calcium, se sont développés comme une monocouche, les cellules individuelles présentant une forme polygonale avec des espaces intercellulaires distincts et démontrant un aspect général de pavés lorsqu’elles sont confluentes. L’élévation du chlorure de calcium à 2 millimolaires induit un changement rapide de morphologie dans les cellules.

Les cellules s’aplatissent et l’espace intercellulaire distinct devient moins apparent en huit heures. Et l’adhésion de cellule à cellule entre les jonctions serrées devient plus frappante dans les 24 heures. Au bout de 48 à 72 heures, la formation de l’enveloppe cellulaire cornée et la stratification cellulaire verticale deviennent apparentes.

La coloration à la phalloïdine des kératinocytes traités à haute teneur en calcium révèle la formation de projections filopodiales riches en fibres d’actine entre les cellules adjacentes, dès trois heures, après le changement de calcium. Entre six et 24 heures, un remodelage supplémentaire de la fibre d’actine devient évident. Avec la quantité importante de stratification cellulaire apparente 48 heures après une exposition élevée au calcium.

L’irradiation UVb déclenche la mort cellulaire dépendante du temps des cultures de kératinocytes, comme en témoignent l’imagerie à contraste de phase et le test de viabilité cellulaire. En effet, au bout de 24 heures, presque toutes les cellules deviennent arrondies et détachées, et sont mesurées comme non viables par le test de viabilité cellulaire. Très probablement en raison des niveaux élevés de TNF alpha, soulagé par les kératinocytes, en réponse à l’exposition aux UVb.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il faut garder le kératinocyte dissocié sur de la glace à tout moment et plaquer les cellules dès que possible pour éviter la différenciation terminale des cellules isolées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie épidermique pour explorer les rôles des kératinocytes dans le développement de la peau et dans une défense immunitaire innée de la peau. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver des kératinocytes épidermiques primaires à partir de peau de souris néonatale ou adulte.