Name: Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Apprenez l'électrophorèse de gel horizontal native pour analyser les interactions ARN-protéines en temps réel. Cette méthode permet de surveiller la formation des complexes pendant la migration électrophorétique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Laura Vanderploeg pour la préparation des chiffres. Le travail dans le laboratoire Sheets est soutenu par la subvention NSF 1050395 et la subvention NIH (R21HD076828). Le travail dans le laboratoire Ryder est soutenu par les subventions du NIH R01GM117237 et R01GM117008. Megan Dowdle est soutenu par une bourse d&#39;opportunités avancées SciMed GRS par l&#39;intermédiaire de l&#39;École universitaire de Wisconsin-Madison et du Programme de formation en biotechnologie par le biais de l&#39;Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (T32GM008349).

1. Préparation du gel de polyacrylamide natif horizontal 4 . <ol><li> Préparation des matériaux nécessaires. <ol><li> Pour l&#39;appareil de gel horizontal, utilisez une boîte en gel (37 cm x 24 cm) avec un plateau de 27 cm x 21 cm et une capacité pour deux peignes de 24 po. Cette configuration fournit un total de 48 échantillons qui peuvent être analysés simultanément. </li><li> Préparez les réactifs suivants: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED et 10% APS (persulfate d&#39;ammonium). </li></ol></li><li> Génération d&#39;un gel d&#39;acrylamide natif à 10%. <ol><li> Dans un ballon de 500 mL, ajouter 80 mL de 5x TBE, 100 mL d&#39;acrylamide à 40% et de l&#39;eau à un volume final de 400 ml. </li><li> Ajouter 4 mL d&#39;APS à 10% et 400 μL de TEMED. Bien mélanger. </li><li> Verser le mélange dans le bac de coulée horizontale et laisser le gel polymériser pendant 30 min. Le gel aura environ 2 cm d&#39;épaisseur. REMARQUE: Les gels peuvent couler dans une hotte pour accélérerJusqu&#39;à la polymérisation. Après la polymérisation, une fine couche de liquide restera sur le dessus du gel. </li><li> Verser le liquide et rincer avec le tampon courant. Retirez le (s) peigne (s) avec précaution et rincez les puits avec un tampon courant à l&#39;aide d&#39;une seringue. </li></ol></li><li> Préparation du tampon courant. <ol><li> Préparez 2 L de 1x tampon de fonctionnement TBE pour la boîte à gel. Diluer 400 ml de 5XTBE avec 1600 ml et mélanger. Placez le tampon TBE dans la chambre froide pour refroidir. </li></ol></li><li> Pré-exécuter le gel <ol><li> Ajouter 2 L de tampon de fonctionnement à froid dans la boîte à gel et insérer le gel. </li><li> Pré-exécuter le gel à 120 V pendant 1 h à 4 ° C dans une chambre froide. Pendant ce temps, préparez la réaction de liaison. </li></ol></li></ol> 2. Réaction de liaison 8 <ol><li> 2.1.Préparez les composants de réaction suivants. DTT 20 mM BSA 10 mM 10 mM d&#39;ARNt de levure 5X tampon de liaison (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM de KCl, 0,2% de Tween-20) L&#39;ARN marqué à la fluorescéine 100 nM a été acheté commercialement Concentré de protéine Bicaudal-C 50% de glycérol dans H 2 O traité par DEPC H 2 O traité par DEPC </li><li> Assembler les composants de réaction de liaison dans un tube de microcentrifugeuse sans RNase. <ol><li> Au tube, ajouter 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL d&#39;ARNt de levure 10 mM, 10 μL de 5x Binding Buffer. </li></ol></li><li> Ajouter une protéine à une concentration finale de 250 nM dans 50 μL. Ajouter de l&#39;eau à un volume final de 45 μL. </li><li> Ajouter 5 μL de substrat d&#39;ARN marqué par fluorescence. Utiliser un substrat de 32 nucleotides marqué par fluorescéine 3 &#39;commercialement acheté. </li><li> Mélanger et incuber dans l&#39;obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. </li></ol> 3. Analyse des échantillons sur le gel de polyacrylamide horizontal natif <ol><li> Pour chaque réaction, ajouter 15 μL de 50% de glycerol et mélanger doucement. </li><li> CarefuAjouter 30 μL de chaque réaction au gel. La quantité d&#39;échantillon qui peut être chargée dans un puits unique varie en fonction de l&#39;épaisseur du gel et de la taille des puits. Nous avons chargé des volumes aussi peu que 15 μL et jusqu&#39;à 45 μL dans un seul puits de gels créé avec un peigne de 24 po et versé à une épaisseur de 2 cm. </li><li> Après avoir connecté l&#39;alimentation à l&#39;appareil gel, allumez l&#39;alimentation et réglez la tension. Faire passer le gel à 4 ° C à 120 V. REMARQUE: pour l&#39;appareil de gel horizontal, cela finit par être d&#39;environ 5 V / cm. Pour l&#39;appareil de gel vertical, il s&#39;agit de 16 V / cm. <ol><li> Pour éviter d&#39;endommager ou blanchir l&#39;ARN marqué par fluorescence, effectuer une électrophorèse dans l&#39;obscurité. </li><li> Varier les temps d&#39;électrophorèse en fonction des spécificités du complexe ARN-protéine analysé. REMARQUE: Un avantage majeur de l&#39;analyse EMSA horizontale est que l&#39;électrophorèse peut être arrêtée, le gel imagé et ensuite le géJe peux être replacé dans l&#39;appareil et l&#39;électrophorèse peut être poursuivie pendant plus longtemps. </li></ol></li></ol> 4. Imagerie du Gel <ol><li> Effectuer une analyse avec n&#39;importe quel instrument conçu pour la détection et l&#39;imagerie de substrats fluorescents. </li><li> Placez le gel sur l&#39;imageur. </li><li> Régler les paramètres de l&#39;image. Pour les ligands d&#39;ARN marqués à la fluorescéine, utilisez les paramètres suivants: FAM (longueur d&#39;onde 473 nm), 750 Tension de photomultiplicateur (PMT), taille de pixel de 100 μm. </li><li> Scannez le gel pour capturer l&#39;image. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement 2 , 3 . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale 1 , 4 , 6 , 7</...

Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques 1 , 2 , 3 . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l&#39;affinité de liaison des protéines à l&#39;ARN ou à l&#39;ADN 3 , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines 1 et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison de l&#39;ARN par des expériences de compétition de substrat 1 . La configuration expérimentale traditionnelle pour ces essais consiste à mélanger une protéine purifiée avec un substrat d&#39;ARN radiomarqué. Les complexes résultants sont ensuite analysés avec des gels de polyacrylamide non dénaturants (natifs) versés entre deux plaques de verre suivies d&#39;une électrophorèse d&#39;échantillon dans un appareil vertical 3. Bien que cette approche ait été utilisée de manière exhaustive pour fournir des informations importantes sur les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la liaison des protéines aux acides nucléiques, elle a également plusieurs limites. Par exemple, cette stratégie de base a un débit relativement faible et n&#39;est pas facilement adaptable pour les applications nécessitant l&#39;analyse de plusieurs réactions de liaison en parallèle. En outre, avec l&#39;appareil vertical traditionnel, il est difficile de surveiller potentiellement les complexes à plusieurs reprises lors de l&#39;électrophorèse 3 , 4 . Nous présentons ici une adaptation du dosage EMSA qui utilise des gels de polyacrylamide natifs coulés dans un appareil à plat, une électrophorèse horizontale et des substrats d&#39;ARN marqués par fluorescence 4 , 5 , 6 , 7 . L&#39;incorporation de ces modifications relativement simples à la base straTegy offre de nombreux avantages. En particulier, le format à plat horizontal se prête facilement à analyser des dizaines d&#39;échantillons simultanément 4 . En outre, pour certains complexes ARN-protéines, tels que ceux formés entre la protéine Bicaudal-C et son électrophorèse au substrat d&#39;ARN dans un gel horizontal, offre une capacité accrue à résoudre des complexes distincts de protéines d&#39;ARN et à les discriminer à partir de substrat d&#39;ARN non lié.

<table><tbody><tr><td>Boîte de gel horizontale</td><td>OWL N</td><td>/A</td><td>Produit qui n’est plus fabriqué. Des boîtes de gel similaires peuvent être trouvées chez Thermo Scientific, boîtes de gel de la série A. Numéro de catalogue : A2-BP</td></tr><tr><td>24-well large large horizontal gel electrophorèse peignes</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Produit qui n’est plus fabriqué. Des boîtes de gel similaires peuvent être trouvées chez Thermo Scientific, peignes de boîtes de gel de la série A. Numéro de catalogue : A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II Cellule d’électrophorèse</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40 % 19:1 Acrylamide/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescéine étiquetée ARN</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>La commande peut être faite sur mesure à la longueur et à la séquence souhaitée</td></tr><tr><td>EDTA sel tétrasodique hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HEPES Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>US Biological</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-arn

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

L&#39;électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l&#39;analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l&#39;horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d&#39;ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l&#39;électrophorèse progresse. Cela fournit l&#39;occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l&#39;expérience. De plus, l&#39;électrophorèse sur gel horizontale permet d&#39;analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.

Pour démontrer la puissance et la polyvalence de l&#39;électrophorèse en gel native horizontale, nous avons analysé la liaison de la protéine Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) à un ARN marqué par fluorescence contenant un site de liaison Bicc1. Bicc1 protéines fonctionnent comme des répresseurs pour contrôler traductionnelles spécifiques à l&#39;ARNm de décisions du destin cellulaire au cours des étapes maternelles de développement des animaux 9, <sup...

L&#39;électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l&#39;électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l&#39;utilisation d&#39;électrophorèse sur gel horizontal horizontal.

Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

L'objectif général de ce protocole est d'analyser les interactions ARN-protéine à l'aide d'une électrophorèse native horizontale. Cette méthode permet de répondre à des questions clés en biochimie de l'ARN, telles que la définition des caractéristiques des interactions spécifiques entre ARN et protéines. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à surveiller la formation de complexes à plusieurs reprises durant l'électrophorèse.Pour l'appareil de gel horizontal, utilisez une cuve à gel équipée d'un plateau de coulée de 27 centimètres sur 21 centimètres et pouvant accueillir deux peignes à 24 puits. Ce dispositif permet d'analyser simultanément un total de 48 échantillons. Préparez deux litres de tampon de migration 1x TBE en diluant 400 millilitres de TBE 5x avec 1 600 millilitres d'eau et en mélangeant.Placer le tampon TBE dans la chambre froide pour le refroidir. Préparer les réactifs suivants selon les procédures standard : acrylamide 40 %, ratio 19:1, TBE 5x, TEMED et sulfate d'ammonium peroxy à 10 %. Pour préparer un gel d'acrylamide natif à 10 %, ajouter dans un flacon de 500 millilitres : 80 millilitres de TBE 5x, 100 millilitres d'acrylamide 40 % et de l'eau jusqu'à un volume final de 400 millilitres.Ajoutez quatre millilitres de sulfate d'ammonium à 10 % et 400 microlitres de TEMED, puis mélangez soigneusement. Versez le mélange dans le bac de coulée horizontal et laissez le gel polymériser dans la hotte aspirante pendant 30 minutes. Le gel polymérisé aura une épaisseur d'environ deux centimètres et une fine couche de liquide restera au-dessus du gel.Placez le gel dans la boîte à gel et emportez-la dans la chambre froide. Ensuite, versez le liquide et rincez avec du tampon de migration. Retirez soigneusement les peignes, ajoutez deux litres de tampon de migration froid dans la boîte à gel, puis utilisez une seringue pour rincer les puits avec le tampon de migration.Faites pré-électrophoréser le gel à 120 volts pendant une heure à quatre degrés Celsius dans une chambre froide. Pendant la pré-électrophorèse du gel, préparez les réactions de liaison. Ajoutez les composants suivants de la réaction de liaison à chaque tube microcentrifuge sans ARN, dans cet ordre : cinq microlitres de BSA à 10 millimolaire, cinq microlitres de DTT à 20 millimolaire, cinq microlitres d'ARNt de levure à 10 millimolaire, 10 microlitres de tampon de liaison 5x, la protéine bicaudal-c à une concentration finale de 250 nanomolaire dans un volume total de 50 microlitres, de l'eau traitée au DEPC jusqu'à un volume final de 45 microlitres, et cinq microlitres de substrat d'ARN marqué de manière fluorescente.Fermez les tubes et agitez doucement pour mélanger, centrifugez brièvement les tubes puis incubez-les à l’abri de la lumière pendant 30 minutes à température ambiante. Une fois les réactions de liaison terminées, ajoutez 15 microlitres de glycérol à 50 % à chaque réaction et mélangez délicatement. Chargez soigneusement 30 microlitres de chaque réaction dans les puits du gel ; la quantité d’échantillon pouvant être chargée dans un puit unique varie selon l’épaisseur du gel et la taille des puits.Alimentez l'appareil de gel, allumez le courant, réglez la tension à 120 volts et faites migrer le gel à quatre degrés Celsius. Pour éviter d'endommager ou de décolorer l'ARN marqué de manière fluorescente, réalisez l'électrophorèse à l'obscurité. Les durées d'électrophorèse varieront selon les caractéristiques spécifiques du complexe ARN-protéine analysé.Un avantage majeur de l'analyse du décalage de mobilité par électrophorèse horizontale est que l'électrophorèse peut être arrêtée dans l'image du gel avant la fin de la course. Réalisez l'analyse avec tout instrument conçu pour détecter des substrats fluorescents en image. Ajustez les paramètres de l'appareil d'imagerie ; pour les ligands marqués de manière fluorescente, utilisez les paramètres suivants.Longueur d'onde de la fluorescéine de 473 nanomètres, tension du photomultiplicateur de 750 volts et taille de pixel de 100 micromètres. Balayer le gel pour capturer l'image. Après l'acquisition, le gel peut être replacé dans l'appareil et l'électrophorèse peut être poursuivie pendant des durées plus longues.La liaison de la protéine xenopus bicaudal-C ou Bicc1 à un ARNm Cripto1 marqué par un fluorophore contenant un site de fixation de Bicc1 a été analysée par électrophorèse native verticale et horizontale. Comme contrôle négatif, Bicc1 a été mélangé à un ARN marqué par un fluorophore dérivé de l'ARNm de CyclinB1. Il était clairement apparent, quelle que soit la méthode utilisée, que Bicc1 se lie à l'ARN Cripto1 et forme un complexe spécifique. Toutefois, les complexes Bicc1-Cripto1 étaient nettement plus distincts lorsqu'ils étaient analysés par gel horizontal, ce qui facilitait leur détection et permettait de distinguer les complexes protéine-ARN de l'ARN non lié.Après l'acquisition des images, le gel a été replacé dans l'appareil électrophorétique, soumis à une électrophorèse supplémentaire de trois heures et demie, puis réimager. Comme illustré ici, les complexes avaient migré davantage et restaient clairement détectables, ce qui indique leur stabilité. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre à cinq heures, si elle est effectuée correctement.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser les interactions ARN-protéine à l'aide d'une électrophorèse native horizontale sur gel.

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Source : Stenum, T. S., et al. Quantification de l’abondance et des niveaux de charge des ARN de transfert chez Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre l’utilisation de l’électrophorèse sur gel et du blot nord pour détecter et comparer les niveaux de charge des ARN de transfert chez E. coli en séparant les formes aminoacylées et déacylées.

Électrophorèse sur gel et butant du nord pour détecter les niveaux de charge de l’ARNt chez E. coli

Cette vidéo présente une technique de séparation dénaturante à base de polyacrylamide pour les protéines. Cette technique permet d’identifier avant tout les protéines en fonction de leur poids moléculaire.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium pour l’analyse des protéines : une technique pour séparer et visualiser les protéines en fonction de leur poids moléculaire

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration d’une méthode d’électrophorèse sur gel bidimensionnelle qui sépare des protéines individuelles d’un mélange complexe de protéines obtenues à partir de tissus tumoraux d’adénome hypophysaire non fonctionnel humain (NFPA). Les protéines sont séparées en fonction de leur charge électrique dans la première dimension et séparées en fonction des poids moléculaires dans la deuxième dimension.

Électrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide : technique de séparation pour l’analyse des protéines dans un mélange complexe de protéines basé sur la charge et la masse moléculaire

Dans cette vidéo, nous démontrons le test de décalage de mobilité électrophorétique pour détecter les interactions protéine-ADN à l’aide de sondes d’ADN marquées par fluorescence infrarouge. Lorsque la protéine se lie à la sonde d’ADN, elle forme un grand complexe qui migre lentement et apparaît comme une bande décalée sur le gel.

Essai de décalage de mobilité électrophorétique pour la détection de complexes facteur de transcription-ADN

Nous présentons ici un protocole d'analyser les interactions ARN / protéines. L'essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l'électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d'ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.

Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l&#39;étude des interactions ARN-protéine: L&#39;IRE / IRP Exemple

Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d'ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.

Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

Nous rapportons les protocoles pour la synthèse et purification d’oligomères de Peptide Nucleic Acid (PNA) incorporant des résidus modifiée. Décrit les méthodes biochimiques et biophysiques pour la caractérisation de la reconnaissance des duplex de RNA par les mis à jour le PNAs.

Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

Un protocole pour le profilage métabolique des échantillons biologiques par électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse en utilisant une conception d'interface de pointe poreuse introducteur est présenté.

Introducteur Electrophorèse Capillaire-Spectrométrie de masse pour Metabolic Profiling des échantillons biologiques

Cet article décrit un protocole simple et rapide pour évaluer l’état oligomérique de la protéine GTPase MxA de type dynamine à partir de lysats de cellules humaines en utilisant une combinaison de PAGE non dénaturante et d’analyse par western blot.

Caractérisation des complexes multi-unité de protéine MxA humaine utilisant dénaturant non-Gel-électrophorèse polyacrylamide

Ici, il est démontré comment le dosage in situ de ligature de proximité (PLA) peut être utilisé pour détecter et visualiser les interactions directes protéines-protéines entre ATM et p53 dans des cultures de cellules en suspension exposées au stress génotoxique.

Détection et visualisation des complexes protéiques induits par endommagement de l&#39;ADN dans des cultures cellulaires en suspension utilisant l&#39;essai de ligature de proximité

Apprenez l'électrophorèse de gel horizontal native pour analyser les interactions ARN-protéines en temps réel. Cette méthode permet de surveiller la formation des complexes pendant la migration électrophorétique.

Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN

Explorer plus de vidéos