Comportement de phase des vésicules chargées dans des Conditions de Solution symétrique et asymétrique suivies avec la microscopie en Fluorescence

L’objectif général de ce protocole est d’évaluer quantitativement l’effet des environnements à haute salinité et de l’asymétrie en solution transmembranaire trouvés dans des conditions physiologiques sur les états de phase membranaire. Les solutions à l’intérieur et à l’extérieur des cellules sont très différentes. Nos méthodes aident à comprendre l’effet de l’asymétrie de la solution sur les propriétés de la membrane et le comportement de la phase.

Le principal avantage de notre approche est que les vésicules peuvent être préparées dans des conditions tampons physiologiques et que le dispositif microfluidique peut être utilisé pour créer des conditions tampons asymétriques. Pour commencer la procédure, rêche un côté d’une plaque de PTFE avec du papier de verre fin. Lavez l’assiette, un flacon en verre de 15 millilitres et un récipient en verre refermable avec du détergent à vaisselle du commerce, de l’éthanol et du chloroforme.

À l’aide d’une seringue en verre de 25 microlitres, déposez 10 à 15 microlitres de stock lipidique dans du chloroforme sur le côté rugueux de la plaque de PTFE propre et sèche. Étalez le stock lipidique avec l’aiguille de la seringue pour créer un film lipidique uniforme. À l’aide d’une pince à épiler, transférez la plaque dans le flacon de 15 millilitres.

Chauffez la plaque à 60 degrés Celsius et faites-la sécher pendant deux heures pour faire évaporer le solvant. Ensuite, ajoutez de l’eau déminéralisée dans un récipient en verre à une hauteur d’environ un centimètre. Placez le flacon avec la plaque dans le récipient, en vous assurant qu’il reste stable et vertical, et fermez le récipient.

Laissez la bicouche lipidique pré-gonfler à 60 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, retirez le flacon du récipient. Prélevez cinq millilitres de solution gonflante dans une seringue en plastique et fixez un filtre de 0,45 micromètre à l’extrémité de la seringue.

Ajoutez la solution gonflante filtrée dans le flacon pour hydrater le film lipidique. Fermez le flacon et scellez-le avec un film de paraffine plastique. Conservez le flacon à 60 degrés Celsius pendant la nuit pour obtenir l’agrégat GUV.

Refroidissez les vésicules à température ambiante dans l’heure qui suit le retrait du feu. Coupez l’extrémité d’une pointe de micro-pipette en plastique de 200 litres, afin que l’agrégat GUV puisse être aspiré dans la pointe. À l’aide de l’embout de pipette ajusté, transférez l’agrégat et 50 microlitres de solution gonflante dans un flacon propre et sec de deux millilitres.

Ajouter au flacon 950 microlitres de solution fraîche de gonflement ou une solution isotonique pour obtenir des conditions de solution symétriques ou asymétriques respectivement. Pipetez le mélange de haut en bas, puis retournez doucement le flacon plusieurs fois pour remettre les GUV en suspension. Pour commencer l’évaluation, placez une aliquote de suspension GUV dans un isolateur en silicone dans une lame de microscope.

Scellez la chambre à l’aide d’une lamelle. Laissez l’échantillon se rééquilibrer pendant cinq minutes. Ensuite, placez la lame sur la platine d’échantillonnage d’un microscope à fluorescence et acquérez des images d’au moins 30 GUV par lot.

Inspectez les images pour déterminer les états de phase des GUV de l’image. Les GUV à l’état d’une seule phase liquide seront sphériques et lisses avec un marqueur fluorescent réparti de manière homogène dans toute la membrane. Les GUV dans un état biphasé ordonné et désordonné seront sphériques avec un marqueur fluorescent partitionné en domaines avec des frontières lisses à l’intérieur de la membrane.

Vérifiez que les domaines sont libres de diffuser sur les surfaces des vésicules et qu’ils peuvent fusionner. Les GUV dans un état de phase liquide solide biphasée ou triphasée seront arrondis avec quelques limites angulaires. Les domaines liquides sur un fond solide ne doivent pas afficher de diffusion, mais les domaines solides doivent diffuser librement sur un fond liquide.

Une fois que l’état de phase de chaque GUV d’image a été identifié, déterminez l’état de phase dominant pour le lot. Répétez le processus avec des échantillons indépendants si l’état de phase dominant est une faible majorité. Avant d’utiliser le dispositif microfluidique, préparez au moins cinq millilitres de solutions de renflement du saccharose et du sel.

Filtrez chaque solution à travers un filtre de 0,45 micromètre. Ensuite, coupez les extrémités de pointes de pipette en plastique de 200 microlitres et placez une pointe de pipette dans chaque canal de l’appareil. Ajouter au réservoir de l’appareil 100 microlitres de solution de gonflement fraîche filtrée du même type que celle utilisée pour préparer les GUV.

Ajoutez cinq microlitres de solution gonflante à chaque pointe de pipette. Centrifugez l’appareil à 900 fois G pendant 10 minutes pour remplir les canaux de l’appareil. Ensuite, remplissez une seringue en verre d’un millilitre avec la même solution de gonflement filtrée.

Connectez une longueur de tube à la seringue. Poussez la solution de gonflement à travers le tube jusqu’à ce que le piston soit complètement enfoncé et que le tube soit rempli de solution. Ensuite, connectez le tube au canal de sortie et montez la seringue sur un pousse-seringue.

Ensuite, connectez l’unité de contrôle de pression aux entrées du canal microfluidique. Assurez-vous que les vannes sont fermées, puis réglez la pression sur trois bars. Placez le dispositif microfluidique sur la platine d’échantillonnage d’un microscope confocal inversé.

À l’aide d’une pipette, retirez la solution gonflante du réservoir de l’appareil jusqu’à ce qu’il ne reste plus que 25 à 50 microlitres de solution. Ajoutez 150 microlitres de la suspension GUV dans le réservoir et mélangez la suspension avec un pipetage doux. Faites fonctionner le pousse-seringue en mode de prélèvement à 10 microlitres par minute pendant 20 minutes ou jusqu’à ce que plus de 90 % des pièges de l’appareil soient occupés.

Ensuite, ouvrez les vannes de l’unité de contrôle de pression pour fermer les vannes annulaires du dispositif microfluidique. Arrêtez le pousse-seringue et laissez l’appareil reposer pendant une heure avant d’acquérir des images confocales des GUV dans l’appareil. Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirez la suspension GUV du réservoir pour ne laisser que 25 à 50 microlitres.

Ajoutez dans le réservoir 150 microlitres de l’autre type de solution de gonflement filtrée et pipetez doucement le mélange de haut en bas. Répétez ce processus au moins cinq fois pour remplacer complètement la solution dans le réservoir. Faites fonctionner le pousse-seringue en mode retrait à 10 microlitres par minute pendant 10 minutes pour remplacer la solution dans les microcanaux.

Ensuite, diminuez le débit à un microlitre par minute. Fermez les vannes de l’unité de régulation de pression pendant deux secondes, puis ouvrez les vannes et arrêtez le pousse-seringue. Laissez l’appareil reposer pendant une heure avant d’enregistrer des images confocales.

Pour commencer à préparer la chambre de contrôle de la température, fixez d’abord les raccords de tube cannelé à un ensemble de flux de chaleur en aluminium avec des fenêtres de recouvrement de deux millimètres d’épaisseur. Fixez une entretoise en caoutchouc à l’une des lamelles pour former la chambre d’observation. Chargez 100 microlitres de la suspension GUV dans la chambre d’observation et scellez la chambre avec une lamelle.

Inversez lentement l’assemblage. Connectez la chambre en aluminium à un bain-marie externe. Montez l’ensemble sur une platine d’échantillon de microscope.

Réglez le bain-marie externe à la température la plus basse souhaitée et laissez le système s’équilibrer pendant 10 à 15 minutes. Acquérir des images des GUV et déterminer les états de phase à différentes températures. Les GUV ont été préparés à partir de rapports variables de DOPG et de sphingomyéline et de cholestérol dans des solutions symétriques de saccharose ou de sel.

Leurs états de phase dominants ont été déterminés par microscopie à fluorescence. Les compositions sélectionnées ont ensuite été transférées à des conditions asymétriques par dilution pour évaluer les conditions de solution efficaces sur le comportement de la phase. Pour étudier plus en détail le comportement de phase des GUV dans les solutions asymétriques, les GUV ont été piégés dans un dispositif microfluidique pour permettre un échange complet de la solution externe.

Les GUVs piégés ont été évalués par microscopie confocale avant et après l’échange fluidique. La fraction de GUV homogènes à séparés en phase a été surveillée sur une plage de températures afin d’évaluer le comportement de la température effective sur la phase GUV. Un motif sigmoïdal a été observé dans les données, qui ont ensuite été ajustées à un modèle de Boltzmann.

La température à laquelle la fraction de GUV à séparation de phase était de 0,5 a été déterminée à partir de la courbe ajustée. Bien que ces méthodes puissent donner un aperçu du comportement de la phase membranaire, les applications peuvent également être utilisées pour d’autres expériences, par exemple pour étudier les interactions entre les membranes dans les biomolécules dans des conditions physiologiques.