Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

L'objectif général de la méthode du bond en avant est de faciliter la création de lignées mutantes pour des gènes essentiels à l'embryogenèse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en génétique du développement et dans d'autres domaines. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet d'obtenir des mutants pour des gènes essentiels dès la génération F1.

Pour commencer cette procédure, microinjectez des embryons de Xenopus au stade une cellule avec des complexes Cas9-sgARN, comme décrit dans le protocole écrit. Lorsque les embryons atteignent 4,5 heures post-fécondation, au stade de blastula précoce neuf, retirez-les de l'incubateur à 25 degrés Celsius afin de permettre leur développement à température ambiante. Pour commencer la greffe à 5 heures post-fécondation, utilisez une pipette de Pasteur pour transférer un embryon non injecté dans une boîte en agarose de 60 millimètres contenant des dépressions, qui servira de receveur du greffon.

Transférez également un embryon donneur PGC dans la boîte. Utilisez des pinces pour retirer manuellement les enveloppes vitellines de chaque embryon. Faites ensuite pivoter les deux embryons afin que leurs pôles végétatifs soient visibles et accessibles pour la chirurgie.

Ensuite, tout en stabilisant l'embryon receveur à l'aide de la boucle de cheveu, insérez la pointe effilée d'un couteau en poil de sourcil au pôle végétatif, juste sous la surface. Puis, à l’aide de mouvements de coupe rapides et ascendants, effectuez quatre incisions superficielles en forme de carré, à l’intérieur de la zone où se formeront ultérieurement les cellules en bouteille, marquant ainsi le blastopore. Une fois les quatre côtés du carré délimités, utilisez le couteau en poil de sourcil pour approfondir chaque incision en répétant des mouvements de coupe similaires, sur une profondeur d’environ 1/3 à 1/2 de la distance jusqu’au plancher du blastocèle.

Libérez l'explant de tissu végétatif de l'embryon récipient en effectuant une ou plusieurs coupes horizontales dans la région végétative profonde. Ensuite, travaillant rapidement, répétez cette procédure sur l'embryon donneur de CPG afin de créer un fragment de tissu végétatif de taille similaire pour la transplantation. Une fois que le tissu contenant les CPG a été retiré de l'embryon donneur, utilisez le couteau en poil de sourcil et la boucle en poil pour positionner l'explant dans l'ouverture créée dans l'embryon récipient.

Utilisez la tige du couteau à poils de sourcils, tenue parallèlement à la surface du greffon, pour appuyer délicatement le greffon dans l'ouverture de la surface végétative de l'embryon receveur. Utilisez la boucle à poils pour faire glisser doucement la carcasse de l'embryon donneur à la surface de l'agarose et dans un puits. Veillez à ce que la plaie ouverte de la carcasse soit orientée vers le liquide en masse.

Faites glisser l'embryon receveur dans un puits adjacent, et assurez-vous également que le tissu du pôle végétatif greffé est orienté vers le liquide principal. Répétez la transplantation des cellules germinales primitives avec d'autres embryons afin de créer davantage de paires de carcasses greffées, jusqu'à ce que les embryons atteignent environ le stade 10 de gastrula précoce, en transférant les embryons dans des puits vides au fur et à mesure des greffes. Une fois que les greffons se sont bien fixés, généralement entre 30 et 45 minutes après la transplantation, utilisez une pipette de Pasteur pour transférer très délicatement les embryons des cavités vers des puits individuels d'une plaque de 24 puits revêtue d'agarose.

Faites pivoter les embryons de manière à ce que le pôle végétatif soit orienté vers le haut, en direction de la solution bulk. Placez les carcasses donneuses et les embryons receveurs dans des puits adjacents afin de faciliter le suivi des paires d'embryons, et enregistrez ces informations. Ensuite, transférez la plaque 24 puits contenant les embryons dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, transférer chaque receveur de greffe, désormais au stade précoce de bourgeon caudal, dans un puits individuel d'une plaque fraîche à six puits, revêtue d'agarose. Élever les embryons « leapfrogged » et réaliser l'analyse de l'ADN du donneur obtenu à partir des carcasses selon le protocole décrit dans le texte. Étant donné que la technique du « leapfrogging » produit des animaux dont la lignée germinale est efficacement remplacée par des allèles mutants, les phénotypes mutants peuvent être obtenus dès la génération F1.

Comme indiqué dans ce tableau, Blitz et al. ont rapporté qu'une majorité d'animaux F0, ciblés au locus de la tyrosinase, nécessaire à la pigmentation des mélanocytes et de la rétine, présentent une transmission germinale à 100 % des génomes mutés d'origine donneur, mesurée par croisement avec des animaux albinos tyr négatifs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transplanter les cellules germinales primitives de Xenopus.