Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de₁ F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.

L’objectif global du saute-mouton est de faciliter la création de lignées mutantes pour les gènes essentiels à l’embryogenèse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en génétique du développement et dans d’autres domaines. Le principal avantage de cette technique est qu’on peut obtenir des mutants dans des gènes essentiels de la génération F1.

Pour commencer cette procédure, micro-injectez aux embryons de xénope au stade d’une cellule avec des complexes Cas9-sgRNA comme décrit dans le protocole de texte. Lorsque les embryons atteignent 4,5 heures après la fécondation, au stade neuf précoce de la blastula, retirez-les de l’incubateur à 25 degrés Celsius pour leur permettre de poursuivre leur développement à température ambiante. Pour commencer la transplantation cinq heures après la fécondation, utilisez une pipette pasteur pour transférer un embryon non injecté dans une boîte d’agarose de 60 millimètres contenant des dépressions, qui servira de receveur de greffon.

Transférez également un embryon de donneur PGC dans la boîte. À l’aide d’une pince, vous pouvez retirer manuellement les enveloppes vitellines de chaque embryon. Et faites pivoter les deux embryons de manière à ce que leurs pôles végétaux soient visibles et accessibles pour la chirurgie.

Ensuite, tout en stabilisant l’embryon receveur avec la boucle de cheveux, insérez la pointe pointue d’un couteau à cheveux à sourcils dans le pôle végétal, juste en dessous de la surface. Et avec des mouvements rapides de tranchage vers le haut, faites quatre incisions peu profondes en forme de carré, à l’intérieur de la zone où se formeront les futures cellules de bouteille qui marqueront le blastopore. Une fois que les quatre côtés du carré sont délimités, utilisez le couteau à sourcils pour approfondir chaque incision en utilisant des mouvements de coupe similaires à une profondeur d’environ 1/3 à 1/2 de la distance jusqu’au sol du blastocole.

Libérez l’explant de tissu végétal de l’embryon receveur en effectuant une ou plusieurs coupes horizontales dans la région végétale profonde. Ensuite, en travaillant rapidement, répétez cette procédure sur l’embryon du donneur PGC pour créer un fragment de tissu végétal de taille similaire pour la transplantation. Une fois que le tissu contenant les PGC est retiré de l’embryon donneur, utilisez le couteau à sourcils et la boucle pour cheveux pour positionner l’explant dans l’ouverture créée dans l’embryon receveur.

À l’aide de la tige du couteau à sourcils, tenu parallèlement à la surface du greffon, le greffon enfonce doucement le greffon dans l’ouverture de la surface végétale de l’embryon receveur. Utilisez la boucle de cheveux pour faire glisser doucement la carcasse de l’embryon du donneur sur la surface de l’agarose et dans un puits. Assurez-vous que la plaie ouverte de la carcasse fait face au liquide en vrac.

Glissez l’embryon receveur dans un puits adjacent, et de même, assurez-vous que le tissu du pôle végétal greffé fait face au liquide en vrac. Répétez la transplantation des PGC avec des embryons supplémentaires pour créer plus de paires de carcasses de transplantation, jusqu’à ce que les embryons atteignent approximativement le stade 10 de la gastrula, en transférant les embryons dans des puits vides au fur et à mesure que les greffes sont effectuées. Une fois que les greffons ont cicatrisé en place, généralement 30 à 45 minutes après la transplantation, utilisez une pipette pasteur pour transférer très doucement les embryons des dépressions vers des puits individuels dans une plaque à 24 puits recouverte d’agarose.

Faites pivoter les embryons de manière à ce qu’ils soient positionnés avec le pôle végétal vers le haut, face à la solution en vrac. Placez les carcasses de donneurs et les receveurs de greffons dans des puits adjacents pour aider à suivre les paires d’embryons et à enregistrer ces informations. Ensuite, transférez la plaque de 24 puits contenant les embryons dans un incubateur à 25 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, déplacez chaque receveur de greffon, maintenant au stade précoce du bourgeon caudal, dans un puits individuel d’une plaque fraîche, recouverte d’agarose, à six puits. Élever les embryons sautés et effectuer l’analyse de l’ADN du donneur obtenu à partir des carcasses conformément au protocole textuel. Parce que le saute-mouton produit des animaux qui ont un remplacement efficace de leur lignée germinale par des allèles mutants, des phénotypes mutants peuvent être obtenus dans la génération F1.

Comme présenté dans ce tableau, Blitz et al. ont rapporté qu’une majorité d’animaux F0, ciblés sur le locus tyrosinase, qui est nécessaire à la pigementation des mélanocytes et de la rétine, montrent une transmission germinale de 100 % des génomes mutants dérivés de donneurs, mesurée par croisement avec des animaux tyr minus albinos. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transplanter des cellules germinales primordiales de Xénope.