À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

L’objectif global de ces procédures est d’étudier la formation des parois aortiques embryonnaires et périnatales au cours du développement normal ainsi que les perturbations de ce processus au cours de la maladie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement vasculaire, telles que la source des cellules qui contribuent au milieu vasculaire embryonnaire et périnatal. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles permettent d’évaluer la pathogenèse et la morphogenèse des muscles lisses qui se produisent au cours des stades embryonnaires et périnataux du développement.

L’implication de ces techniques découle du traitement des maladies vasculaires telles que la sténose aortique supravalvulaire ou la maladie périodique qui provoque une production excessive de cellules sumo. La procédure de mise en place de la mini-pompe sera effectuée par le Dr Jiasheng Zhang, un chercheur scientifique dirigeant un noyau de microchirurgie et l’Université Yale. Commencez par établir des paires d’accouplement entre des souris âgées de deux à six mois avec Cre ER et des souris avec un rapporteur cre.

À l’aide d’une sonde métallique, vérifiez la présence de bouchons vaginaux chaque matin, en séparant la femelle de l’homme lorsqu’un bouchon est détecté. Pour une induction embryonnaire précoce, injectez du tamoxifène par voie intrapéritonéale dans l’humidité de la grossesse. Pour marquer les cellules du milieu à la fin de la période de gestation et pour retracer leur devenir ou leur clonalité chez la souris postnatale, injectez de la progestérone dans la cavité intrapéritonéale de la femme humide enceinte avec du tamoxifène dans un rapport de une à deux doses.

Pour récolter les embryons à la date embryonnaire appropriée, nettoyez l’abdomen de la femme enceinte humide avec de l’éthanol à 70 % et utilisez des ciseaux pour ouvrir l’abdomen afin d’enlever l’utérus. Prélevez les embryons de l’utérus à l’aide d’une pince et d’un stéréomicroscope pour les séparer soigneusement du placenta et du sac vitellin. Fixez les embryons dans du paraformaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius pendant deux heures.

Suivi de trois lavages au PBS pour éliminer l’excès de fixateur. Après le troisième lavage, incubez les embryons dans 30 % de saccharose dans du PBS, dans des tubes individuels de 15 millilitres jusqu’à ce que les embryons coulent. Ensuite, remplissez les moules de congélation en plastique avec un composé de température de coupe optimale jusqu’aux deux tiers du volume maximum et placez un embryon verticalement dans chaque moule.

Après 10 minutes à température ambiante, congelez les mouchoirs à la verticale dans un bain de glace carbonique à 70 % d’éthanol et réglez la température du cryostat à 22 degrés Celsius. Sectionnez les blocs de tissu pour générer des coupes transversales de tissu de 10 à 20 micromètres d’épaisseur sur l’ensemble de chaque aorte, en capturant chaque section sur une lame de microscope en verre au fur et à mesure de leur obtention. Lorsque tous les échantillons ont été acquis, séchez les lames à température ambiante pendant 30 minutes avant de les stocker à 80 degrés Celsius.

Pour colorer les échantillons de tissus, décongelez les lames à température ambiante, protégez-les de la lumière pour éviter le blanchiment aux fluorophores et lavez les lames dans 0,1 % de PBS twin 20. Pour l’analyse clonale, colorez les tissus avec un colorant nucléaire approprié et imagez directement les autres flurophores du rapporteur de la crème arc-en-ciel au microscope fluorescent. Pour la cartographie du devenir, avec le rapporteur mTmG cre, visualisez l’expression de la GFP par imagerie directe avec ou sans immunomarquage.

Pour cultiver et explanter une aorte embryonnaire, placez l’embryon en position couchée et fixez les membres étendus à une planche de dissection sous un stéréomicroscope. À l’aide de ciseaux, faites une incision verticale de l’abdomen à travers le sternum jusqu’au haut du thorax. Disséquez les poumons trachéaux, l’œsophage, le foie et l’intestin les plus fins.

À l’aide d’une pince, tirez doucement le cœur par voie ventrale, à l’aide de ciseaux, pour disséquer l’aorte en l’éloignant de la face dorsale des cavités thoracique et abdominale. Coupez l’aorte au niveau de la racine proximale et des positions abdominales distales pour la libérer et placez l’aorte récoltée dans du PBS stérile et glacé dans une hotte de culture cellulaire. Après un bref lavage, transférez l’aorte dans un puits d’une plaque de 24 puits, contenant un milieu DMEM complété par 0,5 % de PBS et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à 24 heures.

À la fin de l’incubation, lavez l’aorte deux fois avec du PBS et fixez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes. Après trois autres lavages de PBS, transférez l’aorte dans un tube de 1,5 millilitre contenant 30 % de PBS de sucrosine jusqu’à ce que le tissu coule. Pour l’isolement des cellules musculaires lisses de l’aorte périnatale, utilisez une aiguille de calibre 23 pour percer le ventricule gauche d’une souris postnatale de 0,5 jour et utilisez un tube en plastique pour connecter l’aiguille à une seringue stérile contenant du PBS, maintenue verticalement en position élevée, de sorte que le PBS s’écoule dans le ventricule gauche par gravité.

Lorsque le foie blanchit, utilisez des pinces pour retirer le tissu adventice à l’extérieur de l’aorte et récoltez l’aorte comme nous venons de le démontrer. Dissociez le tissu aortique dans 500 microlitres de solution de digestion en secouant manuellement toutes les cinq à 10 minutes. Après 45 minutes, transférez le tube dans un capot de culture cellulaire stérile et utilisez une pipette de 200 microlitres pour triturer la suspension tissulaire jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire ait été obtenue.

Transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres, puis ajoutez deux millilitres de DMEM et collectez les cellules par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans trois millilitres de milieu de culture de cellules musculaires lisses et ensemencez les cellules sur une plaque de culture de 35 millimètres. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, en rafraîchissant le milieu de culture cellulaire tous les trois jours.

Pour placer une mini-pompe osmotique sous-cutanée, commencez par raser le bas du dos d’une souris anesthésiée avec une tondeuse et placez la souris en position couchée sur une plaque chirurgicale chauffée. Frottez le dos avec de la bétadine et de l’alcool isopropylique et placez la souris sous un stéréomicroscope. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, faites une incision cutanée horizontale de 0,5 à un centimètre d’environ trois à cinq centimètres rostral jusqu’à la base de la queue, sans blesser le muscle sous-jacent.

Insérez un hémostat dans l’incision et ouvrez et fermez les mâchoires de l’hémostatique pour créer une poche sous-cutanée. Insérez une mini-pompe osmotique remplie de l’agent d’intérêt dans la poche et utilisez 6 ou sutures non résorbables pour fermer l’incision. Ensuite, laissez la souris récupérer avec la surveillance jusqu’à l’obtention de la décubitus sternal.

Les embryons mutants pour le gène codant pour la protéine de la matrice extracellulaire, l’élastine, accumulent un excès de cellules musculaires lisses dans les couches internes de l’aorte, à partir du 15e jour embryonnaire. L’analyse clonale des cellules musculaires lisses avec le rapporteur cre multicolore au cours de ce processus, indique que les cellules sont de plusieurs couleurs et sont donc polyclonales. L’immunocoloration des coupes d’aorte explantées révèle que les aortes embryonnaires mutantes d’élastine du jour 15,5 deviennent hypermusculaires et sténodiques dans les 18 heures suivant la culture, un processus qui est atténué par l’ajout d’un anticorps anti-anti-anti-bêta-bloquant.

Les cellules musculaires lisses isolées de l’aorte de souris de type sauvage qui, après le jour natal 0,5, expriment des marqueurs de cellules musculaires lisses, mais pas CD31. L’infusion continue d’un inhibiteur de l’intégrine bêta-trois dans des femmes humides enceintes à partir du 13e jour embryonnaire 13,5 atténue considérablement la sténose aortique et l’hypermusculation chez les souris mutantes de la protéine de la matrice extracellulaire, l’élastine. Mais ne modifiez pas les aortes des souris de type sauvage.

Une fois maîtrisée, la technique de placement de la mini-pompe osmotique peut être réalisée en moins de 10 minutes si elle est correctement exécutée. À la suite de ces procédures, ces approches peuvent également être extrapolées pour étudier les muscles lisses codés, non vasculaires, tels que les tissus du tractus gastro-intestinal ou les zones pulmonaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser une cartographie de l’ajustement embryonnaire in vivo et une analyse clonale, des aortes embryonnaires explantées par culture, des cellules musculaires lisses de l’aorte aortique périnatale et des mini-pompes osmotiques sous-cutanées.

N’oubliez pas que travailler avec des souris, du tamoxifène et un réducteur fixe peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et d’une blouse de laboratoire et des précautions supplémentaires doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.