Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles

L’objectif global de ce nouveau système modèle basé sur l’ADN est de comprendre les propriétés fondamentales d’une classe de polymères semi-flexibles, qui décrit également le comportement d’une classe vitale de biopolymères. Cette nouvelle méthode nous permet d’étudier des questions clés dans le domaine de la métaphysique douce, en particulier, elle permet d’explorer le comportement des filaments semi-flexibles et leurs arrangements en réseaux. Le principal avantage de cette technique est que les propriétés mécaniques des filaments intravisifs sont accessibles expérimentalement et peuvent être ajustées avec précision.

Les polymères semi-flexibles sont définis par les propriétés particulières des filaments qui n’étaient auparavant traités que dans le cadre théorique en raison de l’absence de systèmes expérimentaux accordables. Bien que cette méthode donne un aperçu de la quantité déterminante de polymères semi-flexibles, elle peut également être appliquée en tant que nouvel hydrogel pour étudier la migration cellulaire dans des matrices de différentes rigidités sans modifier la taille du maillage de sous-couche. La plus petite unité répétitive du nanotube peut être considérée comme un anneau unitaire.

Plusieurs de ces anneaux unitaires s’empilent lors de l’hybridation. Cela conduit à la formation de nanotubes allongés. Pour commencer, mettez à nouveau en suspension les oligonucléotides lyophilisés dans de l’eau purifiée et suivez les autres étapes de remise en suspension indiquées dans le manuel correspondant de l’entreprise.

Ajustez la quantité d’eau pour obtenir une concentration finale de 200 micromolaires. Déterminez la concentration des brins d’ADN simples pour vérifier les valeurs données par le distributeur, car la stœchiométrie exacte est cruciale pour le processus d’assemblage. À l’aide d’une micropipette, mélangez les brins d’ADN de même concentration dans un récipient adapté au thermocycleur pour former l’ADN et les tubes hélicoïdaux souhaités.

Hybridez l’ADN et les tubes hélicoïdaux dans un thermocycleur en utilisant les paramètres trouvés dans le protocole texte. Stockez l’ADN hybride et les tubes hélicoïdaux jusqu’à 3 semaines à 4 degrés Celsius sans dégradation détectable. Avant d’effectuer la rhéologie, diluez soigneusement l’échantillon à la concentration finale souhaitée en utilisant le tampon d’échantillon si nécessaire.

Choisissez une géométrie appropriée pour le rhéomètre à cisaillement dynamique. Ensuite, chargez l’échantillon sur le rhéomètre. Pour éviter les effets potentiels d’évaporation, passivez l’interface air-eau de l’échantillon et de l’environnement à l’aide de l’une des 3 techniques.

Soit entourer l’échantillon de 2,5 millilitres de bain tampon d’échantillon. Vous pouvez également ajouter un tensioactif juste en dessous de la concentration micelle à l’échantillon. Alternativement, utilisez la seringue hamilton pour entourer l’échantillon de lipides afin d’éviter le contact direct de l’échantillon avec l’air.

Scellez la chambre d’échantillonnage à l’aide d’un capuchon équipé d’éponges humides. Et, si possible, utilisez un bain-marie supplémentaire pour supprimer davantage l’évaporation. Démarrez la mesure à l’aide du logiciel spécifique au rhéomètre à température ambiante permettant à l’échantillon de s’équilibrer pendant 2 heures à température ambiante.

Le temps d’équilibrage est crucial pour permettre au système thermoflect d’atteindre un état randomisé isotrope complet puisque c’est la seule confirmation permettant la comparaison entre les différentes mesures. Après la mesure, traitez les données comme décrit dans le protocole texte. Préparez 8 aliquotes de 12 microlitres pour chaque échantillon en utilisant 1 à 4 micromolaires d’ADN par brin, 12,5 millimolaires de chlorure de magnésium et 1x colorant de gel d’acide nucléique.

De plus, faites un contrôle négatif sans ADN, mais incluez la coloration au gel d’acide nucléique. Transférez les aliquotes sur une plaque PCR en temps réel et scellez-la avec un film adhésif. Centrifugez la plaque à 100 fois G pendant 1 minute à température ambiante pour éliminer les bulles de gaz.

Il est essentiel d’éliminer les bulles de gaz car elles peuvent se dilater pendant les mesures et les échantillons ne peuvent pas être analysés. Après la centrifugation, chargez la plaque scellée dans un système de PCR quantitative en temps réel. Programmez un programme de recuit pour dénaturer l’ADN à quatre-vingt-dix degrés Celsius pendant 10 minutes et abaisser rapidement la température à soixante-douze degrés Celsius.

Ensuite, la température doit diminuer lentement de 0,5 degré Celsius toutes les trente minutes. Une fois que le signal a diminué, accélérez la rampe de température. Assurez-vous que le couvercle du cycleur chauffe à au moins cent degrés Celsius pour éviter la condensation de l’échantillon évaporé sur le film adhésif.

Lors de l’assemblage, excitez les échantillons avec un laser à ions argon à quatre cent quatre-vingt-huit nanomètres et détectez la fluorescence à cinq cent cinquante nanomètres en utilisant un colorant CY3. Pour les autres colorants, choisissez une combinaison d’émission d’excitation appropriée. Mesurez le signal de fluorescence aussi souvent que possible pour augmenter la qualité globale du signal à l’aide de la caméra intégrée.

Des données brutes représentatives d’une mesure rhéologique sont montrées révélant l’élasticité du réseau. Le balayage temporel pendant le temps d’équilibrage est illustré ici. Ce graphique révèle le comportement dépendant de la déformation du réseau.

Dans ce graphique, le comportement dépendant de la fréquence du réseau est évident. À ce stade, les valeurs à une fréquence spécifique sont choisies. Les valeurs de la population spécifique du tube hélicoïdal de l’ADN ont été tracées en fonction de la concentration.

Ce processus a été répété pour tous les tubes d’ADN et d’hélice. La pente a ensuite été extraite dans un graphique diagraphié produisant l’exposant de la loi de puissance. Enfin, les valeurs ont été retracées en fonction de la longueur persistante pour chaque concentration mesurée.

Ces graphes permettent d’extraire l’échelle du module du plateau élastique par rapport à la concentration et à la longueur de persistance. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la matière molle et de la physique des polymères pour explorer l’effet de la rigidité du filament pour la classe des polymères semi-flexibles. À la suite de cette procédure, des effets supplémentaires tels que la récitation des réseaux intriqués, le croisement des réseaux en général et le processus de formation de la structure peuvent être abordés.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’hybrider les nanotubes d’ADN et de mesurer les propriétés rhéologiques de leurs réseaux.