Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

L’objectif général de cette expérience est d’observer les comportements cellulaires au cours de la progression de la lignée des cellules souches neurales aux neurones ou aux cellules gliales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine neurodéveloppemental telles que le rôle des divisions cellulaires symétriques et asymétriques, l’allongement du cycle cellulaire et les taux de croissance cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’observation de la lignée cellulaire pendant de longues périodes.

Cela permet d’observer le passage de la neurogenèse à la genèse gliale au sein d’une seule lignée et une composition directe des progéniteurs neuronaux et gliaux sublinéaires. Commencez par prélever le cerveau de 5 à 10 embryons e14 dans une boîte de Pétri avec un milieu de dissection froid. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement la peau et le crâne et isolez le cerveau.

Pendant que vous travaillez sous le stéréomicroscope, utilisez une pince à dissection pour enlever les méninges. Ensuite, divisez le télencéphale en milieu pour séparer les hémisphères. Pour isoler le télencéphale dorsolatéral, coupez le long de la courbe dorsomédiale et de la limite du pallion et du sous-pallium.

Transférez les télencéphales dorsolatéraux dans un tube de 2 ml avec un milieu de dissection sur de la glace jusqu’à ce que tous les cerveaux soient disséqués. Après une micro-dissection du télencéphale dorsolatéral, placez le tissu dans un tube conique de 15 ml. Ensuite, centrifugez le tube contenant le tissu collecté dans un milieu de dissection froid pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 340 fois G pour précipiter le tissu.

Après l’essorage, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette et ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius 0,05 % pour la digestion chimique. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter 2 ml de milieu de prolifération pour inhiber l’activité de Trypsim.

Ensuite, polissez l’extrémité d’une pipette Pasteur en verre sur un brûleur à gaz ou un bec Bunsen pendant quelques secondes pour réduire légèrement l’ouverture. SCF aspergé pour enrober l’extrémité de la pipette. Puis dissocier mécaniquement les cellules avec la pipette Pasteur polie au feu et recouverte de FCS en pipetant de haut en bas en faisant attention à ne pas générer de bulles.

Centrifugez les cellules dissociées pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à 340 fois G. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette, puis ajoutez un millimètre de milieu de prolifération et remettez les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Retirez le PBS de la plaque prétraitée avec de la Poly-D-Lysine. Dessinez ensuite un signe sur le bas de la plaque qui peut servir de référence pour déterminer le point zéro.

Après avoir remis les cellules en suspension dans le milieu de prolifération pour la deuxième fois, préparez une dilution un à un de la suspension cellulaire à l’aide d’une solution de bleu de trypan à 0,4 %. Chargez dans les lames de la chambre de comptage et comptez le nombre de cellules viables non colorées. Les cellules non viables seront bleues.

Diluez les cellules dans le milieu de prolifération pour obtenir 10 à la sixième cellules par millimètre. Ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour imager les cellules transduites par des rétrovirus, placez la plaque de culture tissulaire dans une chambre d’imagerie reliée à des contrôleurs de température et de dioxyde de carbone pour maintenir les cellules dans des conditions constantes de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Sélectionnez une position dans l’axe xy pour servir de point zéro et calibrez le point zéro. Sélectionnez 10 à 15 positions par puits pour obtenir une image à un grossissement de 10 fois. Réglez le logiciel pour qu’il exige des images en contraste de phase toutes les cinq minutes et des images de fluorescence toutes les trois heures pour réduire la phototoxicité.

Vérifiez et ajustez la mise au point au cours des trois premières heures de l’expérience, car elle peut changer pendant que la température s’équilibre. Après sept jours, arrêtez l’acquisition et passez à l’immunocytochimie post-imagerie. Démarrez le logiciel de suivi des cellules et choisissez un nom d’utilisateur.

Cliquez sur choisir votre nom d’utilisateur et continuer. Parcourez et sélectionnez le dossier de travail tTt pour enregistrer les arbres de lignage, les statistiques et les images exportées. Ensuite, sélectionnez l’expérience à analyser et à charger.

Si les images ont déjà été converties par le convertisseur tt, cliquez sur convertisseur de fichiers journaux et spécifiez le nombre de secondes entre deux points temporels consécutifs dans la fenêtre du convertisseur de fichiers journaux. Cliquez sur convertir les fichiers journaux pour l’ensemble de l’expérience. Sélectionnez et chargez les images souhaitées manuellement ou à l’aide de l’option affichée dans le programme.

Sélectionnez fichier, ouvrir, nouvelle colonie. Cliquez sur suivi, puis sur démarrer le suivi pour démarrer le suivi dans une position choisie. Une fenêtre de film apparaîtra.

Sélectionnez la cellule à l’aide du cercle de suivi et appuyez sur la touche zéro. Le logiciel passera à l’image suivante. Continuez à positionner le cercle de suivi autour de la cellule de suivi à l’aide de la souris et cliquez sur zéro dans chaque image pour ajouter une marque de suivi sur la cellule.

Utilisez les touches un et trois pour passer à l’image précédente ou suivante. Pour supprimer une marque de piste, il suffit de cliquer sur la bonne position pour marquer et d’appuyer sur zéro. Si la cellule s’est divisée, sélectionnez suivi, raison d’arrêt, division et continuez le suivi d’une cellule fille en sélectionnant l’une des cellules dans la fenêtre de l’éditeur de cellule, puis sélectionnez suivi, démarrer le suivi.

Pour suivre la deuxième cellule fille, sélectionnez-la dans l’éditeur de cellules et appuyez sur F2. Si la cellule est morte pendant la microscopie vidéo, sélectionnez l’apoptose. Si la cellule quitte le champ d’observation ou s’entremêle avec des cellules voisines empêchant le suivi, sélectionnez perdu. Pour arrêter le suivi et continuer plus tard, cliquez sur interrompre.

Dans la fenêtre de l’éditeur de cellules, une arborescence sera générée lors du suivi. Pour enregistrer l’arbre de lignage, sélectionnez fichier, enregistrer, arbre actuel dans la fenêtre de l’éditeur de cellules. Pour exporter le film avec les données de suivi, désactivez le mode de suivi et, dans la fenêtre du film, sélectionnez Exporter le film.

Configurez la plage de format des images, le nombre d’images par seconde et le débit binaire. Cliquez sur démarrer l’exportation. Les photomicrographies suivantes montrent le contraste de phase dans les images fluorescentes GFP d’une culture cellulaire primaire du cortex cérébral

L’expression de la GFP est absente pendant les premières heures de l’imagerie. Le nombre de cellules exprimant la GFP augmente avec le temps et l’intensité de la fluorescence de la GFP augmente, comme l’indique la flèche jaune sur ces images. Cette image à plus fort grossissement dans la région encadrée de l’image précédente montre en détail les cellules exprimant la GFP.

Ces images en contraste de phase montrent un exemple de division cellulaire. On observe ici l’arrondi des cellules des progéniteurs, suivi d’une constriction de la membrane cellulaire et enfin de l’achèvement de la mitose. Il s’agit d’un exemple d’arbre de lignage à cellule unique.

Les flèches colorées indiquent différents modes de division cellulaire, la division proliférative symétrique est indiquée par la flèche jaune. La division asymétrique est indiquée par la flèche bleue. La division terminale symétrique est indiquée par la flèche rouge et X indique la mort cellulaire.

Les chiffres indiquent la durée du cycle cellulaire des cellules progénitrices. Cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de montrer les comportements cellulaires au cours de la progression de la lignée cellulaire des cellules souches aux neurones ou aux cellules gliales.