Name: Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct des cellules du cortex cérébral primaire pour étudier la progression des lignées cellulaires. Cette méthode permet d'observer la transition des cellules souches neuronales vers neurones et cellules gliales.

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Ce travail a été soutenu par CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) et FAPERN (Fundação de Amparo Pesquisa do Rio Grande do Norte).

Toutes les expériences impliquant des animaux vivants décrites dans ce protocole sont menées conformément aux lois nationales et internationales et ont été approuvées par le Comité universitaire local de soin et d’utilisation des animaux (CEUA/UFRN), sous la licence 009/2014. Le protocole suivant est réalisé dans un environnement stérile. Une familiarité avec la culture cellulaire de base est attendue.
1. Microdissection du télencéphale dorsolatéral
<ol>
	<li>Préparez le milieu de dissection (100 ml) : 98,5 mL de solution saline équilibrée de Hank's (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/mL et 10 000 μg/mL).</li>
	<li>Filtrez et stérilisez le milieu de dissection.</li>
	<li>Prélever les embryons embryonnaires du jour 14 (E14) d’une souris enceinte C57/Bl6 (Mus musculus) sous anesthésie à l’isoflurane. 
	REMARQUE : Considérez E0 comme le jour de la détection du bouchon vaginal. La dissection doit être terminée au plus tard 1 h après le retrait de la souris gravide. Ce protocole s’applique également aux embryons E11-E17.</li>
	<li>Retirer les embryons par hystérectomie dans des conditions stériles.</li>
	<li>Transférez les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu de dissection froid (4 °C).</li>
	<li>Retirez la cervelle du crâne en coupant le long de la fissure longitudinale. Le nombre d’embryons varie généralement de cinq à dix. Chaque cerveau E14 produit environ 2 x 106 cellules, y compris les progéniteurs et les neurones postmitotiques (rapport 1:1) 
	REMARQUE : Utilisez le stéréomicroscope pour les étapes suivantes.</li>
	<li>Retirez les méninges à l’aide d’une pince à dissection. Fendez le télencéphale en deux pour séparer les hémisphères. Pour isoler le télencéphale dorsolatéral, coupez le long de la courbe dorsomédiale et de la limite palliale-sous-palliale à l’aide d’une pince à dissection. Transférez le télencéphale dorsolatéral dans un tube de 2 mL avec un milieu de dissection à froid (4 °C) jusqu’à ce que tous les cerveaux soient disséqués.</li>
</ol>
2. Dissociation et placage cellulaire
<ol>
	<li>Préparez le milieu de prolifération (50 ml de DMEM + 10 % de FCS) : 44 ml de milieu d'aigle modifié Dulbecco (DMEM), 5 ml de sérum de veau fœtal (SCF), 0,5 ml de glucose à 40 %, 0,5 ml de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/ml et 10 000 μg/ml). Filtrez et stérilisez le milieu de prolifération.</li>
	<li>Préparez le milieu de différenciation (50 mL de DMEM + 2 % de B27) : 48 mL de DMEM, 1 mL de B27, 0,5 mL de glucose à 40 %, 0,5 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/mL et 10 000 μg/mL). Filtrez-stérilisez le milieu de différenciation.</li>
	<li>Après une micro-dissection du télencéphale dorsolatéral de souris E14, centrifuger le tube avec le tissu collecté et le milieu de dissection à froid (pendant 5 min à 4 °C, 340 x g) pour précipiter le tissu.</li>
	<li>Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 1 mL de trypsine-EDTA préchauffée (37 °C) (0,05 %) pour la digestion chimique. Incuber pendant 15 min à 37 °C. Ajouter 2 mL de milieu de prolifération pour arrêter l’activité de la trypsine.</li>
	<li>Polissez l’extrémité d’une pipette Pasteur en verre sur un brûleur à gaz ou un bec Bunsen pendant quelques secondes pour réduire légèrement l’ouverture. Lavez la pipette en aspirant le FCS pour enrober l’embout. En évitant les bulles, dissociez mécaniquement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur polie au feu et recouverte de FCS.</li>
	<li>Centrifuger les cellules (pendant 5 min à 4 °C, 340 x g). Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de milieu de prolifération et remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Répétez cette étape une fois.</li>
	<li>Préparez une dilution 1:1 de la suspension cellulaire à l’aide d’une solution de bleu trypan à 0,4 %. Les cellules non viables seront bleues. Comptez le nombre de cellules viables (non colorées) à l’aide d’une chambre Neubauer.</li>
	<li>Diluer les cellules dans un milieu de prolifération pour obtenir 10à 6 cellules/mL. Ajouter 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits (environ 2,5 × 105 cellules/cm2). Incuber les cellules à 37 °C et 5 % CO2. 
	REMARQUE : N’utilisez pas de lamelles en verre, car elles peuvent se déplacer pendant l’expérience et modifier le champ d’observation. Vous pouvez également utiliser des plaques de culture tissulaire à fond de verre. 
	REMARQUE : Si vous n’utilisez pas de polyboliques traités à la culture cellulaire, il est important de prétraiter vos plaques avec Poly-D-Lysin (50 μg/ml) 2 h à 37 °C. Les plaques traitées PDL peuvent être stockées à 4 °C après lavage à l’eau distillée.</li>
</ol>
3. Transfection médiée par rétroviral
REMARQUE : Il s’agit d’une méthode simple pour transfecter uniquement les cellules progénitrices. Cependant, d’autres vecteurs viraux ou la transfection chimique/électrique peuvent être utilisés pour insérer des gènes d’intérêt dans des cellules en culture.
<ol>
	<li>Pour manipuler l’expression des gènes et marquer les cellules avec des protéines rapporteures fluorescentes, ajoutez des rétrovirus porteurs de plasmides avec des gènes d’intérêt 2 h après le placage cellulaire. 
	REMARQUE : Les vecteurs rétroviraux ne s’intègrent que dans le génome des cellules en division. Par conséquent, il est important d’infecter les cellules lorsque la prolifération est élevée. 
	REMARQUE : Nous avons utilisé un plasmide contenant la séquence de fusion Bêta-actine/CMV (CAG) et un site d’entrée ribosomique interne (IRES) suivi de la séquence codante de la protéine fluorescente verte (GFP), désignée pCAG-IRES-GFP44. Les gènes d’intérêt ont pu être clonés entre le promoteur CAG et la séquence IRES37.</li>
	<li>Diluer le rétrovirus dans un milieu de différenciation pour obtenir le nombre souhaité de particules par mL. Ajouter 500 μL de milieu de différenciation avec rétrovirus dans chaque puits. 
	REMARQUE : La quantité de rétrovirus utilisée dépend de son titre et doit être calculée pour obtenir 50 à 100 cellules infectées par puits. Ce titre permet d’identifier des clones isolés exprimant la GFP, dont la relation peut être confirmée par le suivi d’images en contraste de phase (voir rubrique 6). Le titrage du rétrovirus doit être effectué en utilisant la même population cellulaire 45.</li>
</ol>
4. Vidéo-microscopie time-lapse
REMARQUE : Cette étape nécessite un microscope à fluorescence inversée avec chambre d’incubation (voir Tableau des matériaux).
<ol>
	<li>Après l’infection par le rétrovirus, placez la plaque de culture tissulaire dans un incubateur connecté à des contrôleurs de température et de CO2. 
	REMARQUE : Le préchauffage de la chambre pendant 3 h avant de commencer l’imagerie peut aider à minimiser la dérive et la défocalisation pendant l’acquisition. 
	REMARQUE : La chambre doit maintenir les cellules dans des conditions constantes de 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Sélectionnez une position dans l’axe XY qui servira de point zéro (XY = 0). Cela permettra à une référence de retrouver les positions à l’avenir, par exemple après une immunocytochimie post-imagerie (voir section 5). 
	REMARQUE : Il est conseillé de dessiner un signe dans la plaque qui peut être utilisé comme référence pour déterminer le point zéro.</li>
	<li>Sélectionnez les positions à imager avec un grossissement de 10X. 
	REMARQUE : Sélectionnez 10 à 15 positions par puits pour augmenter la probabilité d’observer des cellules transfectées rétroviralement. 
	REMARQUE : Des objectifs longue distance à fort grossissement (20X ou 40X) peuvent être utilisés pour obtenir des images de plus haute résolution. En fonction de la distance de travail des objectifs, des plaques à fond en verre peuvent être nécessaires.</li>
	<li>Acquérez des images en contraste de phase toutes les 5 minutes et des images de fluorescence toutes les 3 heures pour réduire la phototoxicité. Vérifiez et ajustez la mise au point dans les 3 premières heures de l’expérience, car elle peut changer pendant que la température s’équilibre. Vérifiez et ajustez la mise au point quotidiennement. 
	REMARQUE : Nous observons que la mise au point devient stable après les premières 24 heures. Cependant, il est conseillé de surveiller la mise au point. Vous pouvez également utiliser un système de mise au point automatique basé sur un logiciel.</li>
	<li>Après 7 jours, arrêter l’acquisition et procéder à l’immunocytochimie post-imagerie (voir rubrique 5).</li>
	<li>Après l’immunocytochimie, replacez la plaque dans l’incubateur du microscope, trouvez le point zéro, réinitialisez XYZ = 0 et rechargez l’expérience avec les positions enregistrées. Acquérez les images de fluorescence de chaque position à l’aide de filtres de fluorescence appropriés.</li>
</ol>
5. Immunocytochimie post-imagerie
<ol>
	<li>Après 7 jours de culture, fixer la culture cellulaire avec un fixateur de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 15 min à température ambiante. 
	ATTENTION : Le PFA est toxique et doit être manipulé dans une hotte chimique.</li>
	<li>Rincer avec 0,5 mL de PBS 0,1 M pendant 5 min. Répéter 3 fois.</li>
	<li>Incuber dans les anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C dans 0,5 % de triton et 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS 0,1 M. 
	REMARQUE : Utilisez l’anticorps anti-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) pour confirmer le phénotype neuronal (IgG1 de souris, 1:1 000) et l’anticorps anti-GFP pour marquer les cellules transduites (anticorps de poulet, 1:500). D’autres anticorps peuvent être utilisés pour détecter les cellules progénitrices ou gliales.</li>
	<li>Rincer avec 0,5 mL de PBS 0,1 M pendant 5 min. Répéter 3 fois.</li>
	<li>Diluer les anticorps secondaires dans 0,5 % de triton et 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS 0,1 M et incuber pendant 2 h à température ambiante. Dilution recommandée : 1:1 000.</li>
	<li>Rincer avec 0,5 mL de PBS 0,1 M pendant 5 min. Répéter 3 fois.</li>
	<li>Pour la coloration des noyaux, incuber les cellules pendant 5 min avec 0,1 μg/mL de 4′6′-diamino-2-phénylindone (DAPI) dans du PBS 0,1 M.</li>
	<li>Rincer avec 0,5 mL de PBS 0,1 M pendant 5 min. Répéter 3 fois.</li>
	<li>Conservez les cellules dans du PBS 0,1 M et protégez-les de la lumière (par exemple, enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium).</li>
</ol>
6. Suivi des cellules
REMARQUE : Nous décrivons brièvement ici les principales étapes de l’analyse des données de vidéo-microscopie en accéléré à l’aide du logiciel The Tracking Tool (tTt), qui est disponible sur le lien fourni dans la Table des matériaux.
REMARQUE : Si l’acquisition d’images est effectuée avec un autre logiciel, importez les données d’image avec le convertisseur tTt disponible dans l’installateur de tTt (lien fourni dans la table des matériaux). Seuls les formats d’image png, tif ou jpg sont acceptés. Suivez les étapes indiquées à l'Figure 1 A - B après avoir démarré le convertisseur tTt.
<ol>
	<li>Démarrez le logiciel tTt et choisissez un nom d’utilisateur. Cliquez sur le bouton « ajouter un utilisateur » et « continuer » (Figure 2A). Parcourez et sélectionnez le « TTTWorkFolder » (Figure 2B). Les arbres de lignages, les statistiques et les images exportées seront enregistrés dans ce dossier. Ensuite, sélectionnez l’expérience à analyser et chargez-la (Figure 2B).</li>
	<li>Si les images ont déjà été converties par tTt Converter, cliquez sur « LogFileConverter » (Figure 3A) et spécifiez le nombre de secondes entre deux points temporels consécutifs dans la fenêtre LogFileConverter. Cliquez sur « Convertir les fichiers journaux pour l’ensemble de l’expérience » (Figure 1C).</li>
	<li>Dans une liste d’images, qui apparaît dans la fenêtre tTt, sélectionnez les images souhaitées qui en les chargeant manuellement ou en utilisant l’option affichée dans le programme. Chargez les images (Figure 3).</li>
	<li>Sélectionnez Fichier > Ouvrir > nouvelle colonie. Cliquez sur « Suivi », puis sur « Démarrer le suivi » pour démarrer le suivi dans une position choisie.</li>
	<li>Une fenêtre vidéo apparaîtra (Figure 4). Sélectionnez la cellule à l’aide du cercle de suivi et appuyez sur la touche 0. Le logiciel passera à l’image suivante. Continuez à positionner le cercle de suivi autour de la cellule suivie à l’aide de la souris et cliquez sur 0 dans chaque image pour ajouter une marque de trace sur la cellule.</li>
	<li>Utilisez les touches 1 et 3 pour passer à l’image précédente ou suivante, respectivement. Pour supprimer une marque de piste, il suffit de cliquer sur la bonne position à marquer et d’appuyer sur 0.</li>
	<li>Si la cellule est divisée, sélectionnez le bouton « division » (rectangle rouge à Figure 4). Poursuivez le suivi d’une cellule fille en appuyant sur Maj+D. Pour suivre la deuxième cellule fille, sélectionnez-la dans l’éditeur de cellules et appuyez sur F2.</li>
	<li>Si la cellule est morte pendant la microscopie vidéo, sélectionnez « apoptose » (rectangle bleu à Figure 4). 
	REMARQUE : Bien que le logiciel qualifie l’événement d'«apoptose », d’autres mécanismes peuvent être responsables de la mort cellulaire.</li>
	<li>Si la cellule quitte le champ d’observation ou s’entremêle avec des cellules voisines empêchant le suivi, sélectionnez « perdu » (rectangle vert à Figure 4).</li>
	<li>Pour arrêter le suivi et continuer plus tard, cliquez sur « interrompre » (rectangle violet à Figure 4). 
	REMARQUE : Dans la fenêtre de l’éditeur de cellules, une arborescence sera générée pendant le suivi. Pour enregistrer l’arborescence de lignage, sélectionnez Fichier > Enregistrer > arborescence actuelle (dans la fenêtre de l’éditeur de cellules).</li>
	<li>Pour commencer le suivi d’une autre cellule, cliquez sur la cellule à l’aide du bouton droit de la souris ou sélectionnez la cellule à l’aide du bouton gauche de la souris et cliquez sur Suivi > Démarrer le suivi.</li>
	<li>Pour exporter le film avec les données de suivi, le logiciel ne doit pas être en « mode suivi ». Pour désactiver le mode de suivi, exécutez l’étape 6.10. Dans la fenêtre Film, sélectionnez Exporter > film. Configurez le format, la plage d’images, le nombre d’images par seconde et le débit binaire. Cliquez sur « Démarrer l’exportation ».</li>
</ol>
7. Quantifications
REMARQUE : Plusieurs mesures peuvent être effectuées à l’aide de données de microscopie vidéo46. Nous décrivons ici trois possibilités qui sont illustrées plus loin dans la section « résultats représentatifs ».
<ol>
	<li>Quantifiez la survie cellulaire de chaque lignée cellulaire en divisant le nombre de cellules vivantes à différents moments par le nombre total de cellules générées avant que ces points chronologiques ne soient atteints au sein des clones individuels37.</li>
	<li>Quantifiez la proportion de progéniteur symétrique (SP, les deux cellules filles continuent de proliférer), asymétrique (A, une cellule fille continue de proliférer et l’autre devient postmitotique) ou terminal symétrique (ST, les deux cellules filles deviennent postmitotiques)15,38.</li>
	<li>Mesurez la durée du cycle cellulaire en calculant l’intervalle de temps entre leur génération et leur division15.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Observation en temps réel des cellules du cortex cérébral primaire permet l’analyse de la prolifération cellulaire, le mode de division cellulaire, la longueur du cycle cellulaire, la différenciation cellulaire et cell survival3,14,15,37. Plus important encore, elle permet l’étude des lignées unicellulaires, conduisant à l’identification des phases intermédiaires adoptées au cours de la progres...

Des cellules souches neurales (NSC) générer des neurones et des cellules de macroglial au cours du développement du cortex cérébral. Au début-exocytosis, CNS subissent plusieurs séries de la division cellulaire symétrique et élargir le bassin de l’ancêtre. Ensuite, les CNS divisent asymétriquement pour générer des neurones directement ou indirectement par le biais d’intermédiaires1. Seulement à mi - à fin-exocytosis, progéniteurs commutateur pour générer les astrocytes et oligodendrocytes2,3,4. Cependant, les mécanismes complets qui contrôlent la prolifération cellulaire et la différenciation, ainsi que la contribution des progéniteurs sort restreints à la génération de types uniques de neurones ou cellules macroglial restent un sujet de débat intense4,5,6. Le potentiel des CNS corticales individuels pour générer des neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes a été étudiée in vitro et in vivo à l’aide d’une multitude de techniques telles que : vivre l’imagerie en single-cell cultures7,8,9,10,11,12,13; vivre d’imagerie à haute densité de cultures cultures3,14,15; vivre d’imagerie en tranche cultures16,17,18; clonale analyse virale véhiculée par vector étiquetage génétique dans les cultures à haute densité14,15,19,20,21; analyse clonale in vivo à l’aide de rétrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; et analyse clonale in vivo à l’aide des animaux transgéniques,34.
Chacune de ces techniques présente des avantages et des inconvénients. Par exemple, in vivo le traçage de lignée est sensible à la mettre et fendage erreurs3, aboutissant à des conclusions contradictoires quant au potentiel des progéniteurs corticales individuels. En outre, les études in vitro et in vivo sur l’étiquetage des cellules progénitrices au début-points dans le temps et analyse postérieure des lignages cellulaires peut être influencée par la présence non détectée de mort cellulaire au cours de la lignée-progression35. Par conséquent, un système approprié d’analyser le potentiel des CNS unique doit permettre l’identification de toutes les cellules générées, ainsi que la caractérisation appropriée de destins de cellules au sein de la lignée. Combinaison de culture de cellules primaires et imagerie live fournit ce paramètre. À l’aide de la culture de cellule unique et microscopie vidéo Time-lapse, Temple et coll. ont montré l’interrupteur dans la lignée des progéniteurs individuels cortex cérébral de neurogenèse à gliogenesis11. Plus tard, ils ont utilisé le même système pour montrer que différents types de neurones sont générés à partir un seul ancêtre corticale12. Cependant, ce système présente une mise en garde importante : seulement 1 % des progéniteurs corticales isolées au début exocytosis générer des clones de 4 ou plus de descendance9. Après l’ajout de FGF2, la fréquence des cellules générant 4 ou plusieurs cellules augmente de 8 à 10 %9. Néanmoins, ce nombre est trop petit, étant donné que pratiquement tous les progéniteurs corticales sont prolifératives à ce stade. En outre, les effets potentiels de FGF2 sur sort-cahier des charges n’est pas exclus de36. Pour contourner ces limitations, nous avons utilisé des cultures de cellules haute densité favorisant la prolifération des deux ventriculaire (exprimant le Pax6) et de progéniteurs corticale sous-ventriculaire (exprimant le Tbr2)15. De plus, l’observation en temps réel de ces cultures a montré que plusieurs caractéristiques de la progression de lignée NSC sont reproduits dans ces conditions, tels que le mode de division cellulaire, allongement du cycle cellulaire, des cellules simples susceptibles de générer des neurones et des cellules gliales, entre autres,3,15. Plus récemment, nous avons également utilisé ce système pour montrer que CREB-signalisation affecte la survie cellulaire des neurones immatures cortex cérébral en souris37. Ainsi, nous croyons que Time-lapse vidéo-microscopie de murin du cortex cérébrale primaire les cellules cultivées à haute densité est un outil puissant et accessible afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la progression du cycle cellulaire, le mode de division cellulaire, la survie des cellules et la spécification des cellules sort. Ce dernier peut être réalisé à l’aide d’animaux transgéniques, ce qui permet l’identification des destins cellulaires spécifiques en temps réel38,39,40 ou l’utilisation d’études d’imagerie immunocytochimie3,38,41,42.
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour préparer la culture cellulaire primaire cortex cérébral soutenant la prolifération des CNS et la génération suivante des neurones et des cellules macroglial. Nous discutons également l’utilisation de la transfection rétrovirale médiation pour manipuler l’expression des gènes des cellules individuelles, qui peuvent être identifiés et suivis au niveau de la cellule unique à l’aide de la microscopie vidéo Time-lapse. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les cellules du cortex cérébral primaire isolés du début à la fin de l’exocytosis chez les rongeurs, mais quelques ajustements peuvent être nécessaires selon l' étape14. CNS isolés provenant d’autres sources peuvent également être étudiés à l’aide de la microscopie vidéo Time-lapse de cultures 2D, mais le système de culture approprié doit être déterminé en comparant les comportements de cellulaire in vitro et in vivode38,43.

<table><tbody><tr><td>Solution saline équilibrée Hank’s (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle’s Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA (0,05 %)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2, souris</td><td>Sigma</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP poulet</td><td>Aves</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-poulet alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>ETH Zurich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope observateur cellulaire Pipette</td><td></td> Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td> PBS Le logiciel The Tracking Tool (tTt) https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html lien de téléchargement <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie des cellules du cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de culture 2d en direct

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Au cours du développement du cortex cérébral, cellules progénitrices subissent plusieurs séries de symétriques et asymétriques des divisions cellulaires pour générer de nouveaux géniteurs ou neurones mitotiques. Plus tard, quelques progéniteurs basculer vers un sort gliogenic, ajoutant à la population astrocyte et oligodendrocyte. À l’aide de Time-lapse vidéo-microscopie des cultures de cellules primaires de cortex cérébral, il est possible d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le mode de division cellulaire et les paramètres de cycle cellulaire des cellules progénitrices. De même, le sort des cellules postmitotiques peut être examiné à l’aide de protéines spécifiques des cellules fluorescentes journaliste ou études d’imagerie immunocytochimie. Plus important encore, toutes ces caractéristiques peuvent être analysées au niveau unicellulaire, permettant l’identification de cellules souches s’est engagé à la génération de types spécifiques de cellules. Manipulation de l’expression génique peut également être effectuée utilisant virale véhiculée par transfection, permettant l’étude des phénomènes autonome-cellule et cellule-non-autonomes. Enfin, l’utilisation de protéines fluorescentes fusion permet l’étude de la distribution symétrique et asymétrique des protéines sélectionnées au cours de la division et la corrélation avec le destin des cellules-filles. Nous décrivons ici la méthode vidéo-microscopie Time-lapse pour cellules murines primaire cortex cérébral pour plusieurs jours d’images et d’analyser le mode de division cellulaire, longueur du cycle cellulaire et le destin des cellules nouvellement créées. Nous décrivons également une méthode simple pour transfecter de cellules progénitrices, qui peuvent être appliqués pour manipuler les gènes d’intérêt ou simplement étiqueter des cellules avec des protéines de journaliste.

Les cultures primaires de cellules du cortex cérébral isolées d'embryons E14 contiennent à la fois des cellules progénitrices et des cellules neuronales. Pendant la période d'observation, les progéniteurs subissent plusieurs cycles de division cellulaire, augmentant ainsi le nombre de cellules (Figure 5 et Vidéo Figure 1).
La transfection médiée par rétrovirus de quelques cellules p...

L’imagerie Live est un outil puissant pour étudier les comportements cellulaires en temps réel. Nous décrivons ici un protocole pour le Time-lapse vidéo-microscopie des cellules du cortex cérébral primaire qui permet un examen détaillé des phases adoptées au cours de la progression de la lignée du primaire des cellules souches neurales au différenciée des neurones et cellules gliales.

Imagerie des cellules du Cortex cérébral primaire à l’aide d’un système de Culture 2D en direct

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

L'objectif général de cette expérience est d'observer les comportements cellulaires au cours de la progression de la lignée, depuis les cellules souches neurales jusqu'aux neurones ou aux cellules gliales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine du développement neuronal, telles que le rôle des divisions cellulaires symétriques et asymétriques, l'allongement du cycle cellulaire et les taux de croissance cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'observation de la lignée cellulaire sur de longues périodes.Ceci permet d'observer le passage de la neurogenèse à la gliogenèse au sein d'une même lignée et une comparaison directe des progéniteurs neuronaux et gliaux sublinéaires. Commencez par retirer les cerveaux de 5 à 10 embryons e14 dans une boîte de Pétri contenant un milieu de dissection froid. Utilisez une pince pour retirer soigneusement la peau et le crâne et isoler les cerveaux.En travaillant sous le microscope stéréoscopique, utilisez des pinces de dissection pour retirer les méninges. Ensuite, divisez le télencéphale en son milieu afin de séparer les hémisphères. Pour isoler le télencéphale dorso-latéral, incisez le long de la courbe dorso-médiale et de la limite entre le pallium et le sous-pallium.Transférez les télencéphales dorso-latéraux dans un tube de 2 mL contenant du milieu de dissection sur de la glace, jusqu'à ce que tous les cerveaux soient disséqués. Après la microdissection du télencéphale dorso-latéral, placez le tissu dans un tube conique de 15 mL. Ensuite, centrifugez le tube contenant le tissu recueilli dans du milieu de dissection froid pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et à 340 ×g pour précipiter le tissu.Après la centrifugation, éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 1 mL de trypsine-EDTA 0,05 % à 37 degrés Celsius pour la digestion chimique. Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajouter 2 mL de milieu de prolifération pour inhiber l’activité de la trypsine.Ensuite, polissez l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre au-dessus d'un bec Bunsen ou d'un brûleur à gaz pendant quelques secondes afin de réduire légèrement l'ouverture. Imbibez la pipette de SFC pour en recouvrir l'extrémité. Puis, dissociez mécaniquement les cellules à l'aide de la pipette Pasteur polie à la flamme et recouverte de SFC en aspirant et en rejetant plusieurs fois, tout en prenant soin d'éviter la formation de bulles.Centrifuger les cellules dissociées pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à 340 ×g. Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, puis ajouter un millilitre de milieu de prolifération et resuspendre les cellules à l’aide d’une pipette. Retirer le PBS de la plaque prétraitée avec de la poly-D-lysine. Ensuite, dessiner un signe sur le fond de la plaque qui pourra servir de référence pour déterminer le point zéro.Après avoir re-suspendu les cellules dans le milieu de prolifération pour la deuxième fois, préparez une dilution au demi de la suspension cellulaire en utilisant une solution de bleu de trypan à 0,4 %. Chargez les lamelles de chambre de comptage et comptez le nombre de cellules viables non colorées. Les cellules non viables seront bleues.Diluez les cellules dans un milieu de prolifération afin d'obtenir 10 puissance six cellules par millilitre. Ajoutez 500 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Pour imager les cellules transduites par un rétrovirus, placez la plaque de culture tissulaire dans une chambre d'imagerie reliée à des contrôleurs de température et de dioxyde de carbone afin de maintenir les cellules dans des conditions constantes de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Sélectionnez une position sur l'axe xy qui servira de point zéro et étalonnez ce point zéro. Sélectionnez 10 à 15 positions par puits à imager à un grossissement de 10 fois. Configurez le logiciel pour qu'il acquière des images en contraste de phase toutes les cinq minutes et des images en fluorescence toutes les trois heures afin de réduire la phototoxicité.Vérifiez et ajustez la mise au point durant les trois premières heures de l'expérience, car elle peut changer pendant l'équilibration thermique. Après sept jours, arrêtez l'acquisition et procédez à l'immunocytochimie post-imagerie. Lancez le logiciel de suivi cellulaire et choisissez un nom d'utilisateur.Cliquez sur choisissez votre nom d'utilisateur et continuez. Parcourez et sélectionnez le dossier de travail tTt pour enregistrer les arbres phylogénétiques, les statistiques et les images exportées. Ensuite, sélectionnez l'expérience à analyser et à charger.Si les images ont déjà été converties à l'aide du convertisseur tTt, cliquez sur le convertisseur de fichiers journaux et indiquez le nombre de secondes entre deux points temporels consécutifs dans la fenêtre du convertisseur de fichiers journaux. Cliquez sur convertir les fichiers journaux pour l'ensemble de l'expérience. Sélectionnez et chargez manuellement les images souhaitées ou à l'aide de l'option affichée dans le programme.Sélectionnez le fichier, ouvrez-le, puis sélectionnez une nouvelle colonie. Cliquez sur le suivi, puis sur démarrer le suivi pour commencer le suivi à une position choisie. Une fenêtre vidéo apparaîtra.Sélectionnez la cellule à l’aide du cercle de suivi et appuyez sur la touche zéro. Le logiciel passera à l’image suivante. Continuez à positionner le cercle de suivi autour de la cellule à tracer à l’aide de la souris et cliquez sur zéro dans chaque image pour ajouter une marque de suivi sur la cellule.Utilisez les touches une et trois pour passer à l'image précédente ou suivante. Pour supprimer une marque de suivi, cliquez simplement sur la position correcte à marquer, puis appuyez sur zéro. Si la cellule s'est divisée, sélectionnez le suivi, la raison de l'arrêt, la division, puis poursuivez le suivi d'une cellule fille en sélectionnant l'une des cellules dans la fenêtre de l'éditeur de cellules, puis sélectionnez le suivi et démarrez le suivi.Pour suivre la deuxième cellule fille, sélectionnez-la dans l'éditeur de cellules et appuyez sur F2. Si la cellule est morte pendant la microscopie vidéo, sélectionnez « apoptose ». Si la cellule quitte le champ d'observation ou s'entremêle avec des cellules voisines, empêchant le suivi, sélectionnez « perdue ». Pour arrêter le suivi et poursuivre ultérieurement, cliquez sur « interrompre ».Dans la fenêtre de l'éditeur de cellules, un arbre sera généré pendant le suivi. Pour enregistrer l'arbre phylogénétique, sélectionnez Fichier, Enregistrer, Arbre actuel dans la fenêtre de l'éditeur de cellules. Pour exporter la vidéo avec les données de suivi, désactivez le mode de suivi, puis dans la fenêtre de la vidéo, sélectionnez Exporter la vidéo.Définissez la plage de format des images, le nombre d'images par seconde et le débit binaire. Cliquez sur démarrer l'exportation. Les photomicrographies suivantes montrent le contraste de phase dans des images fluorescentes GFP d'une culture cellulaire primaire de cortex cérébral.L'expression de la GFP est absente pendant les premières heures d'imagerie. Le nombre de cellules exprimant la GFP augmente au fil du temps et l'intensité de la fluorescence de la GFP s'accroît, comme indiqué par la flèche jaune sur ces images. Cette image à plus fort grossissement de la région encadrée de l'image précédente montre en détail les cellules exprimant la GFP.Ces images en contraste de phase montrent un exemple de division cellulaire. On observe ici l'arrondissement des cellules progénitrices, suivi de la constriction de la membrane cellulaire et, enfin, la complétion de la mitose. Ceci est un exemple d'arbre de lignée cellulaire unique.Les flèches colorées indiquent différents modes de division cellulaire : la division proliférative symétrique est représentée par la flèche jaune. La division asymétrique est indiquée par la flèche bleue. La division terminale symétrique est représentée par la flèche rouge, et le symbole X indique la mort cellulaire.Les nombres indiquent la durée du cycle cellulaire des cellules progénitrices. Cette technique peut être réalisée en une à deux heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'observer les comportements cellulaires au cours de la progression de la lignée cellulaire, des cellules souches aux neurones ou aux cellules gliales.

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