Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae

L’objectif global de ce phénotypage à haut débit chez la levure est de dépister les protéines qui produisent une mémoire phénotypique durable de l’expression passée, en tant que proxy de l’hérédité basée sur les protéines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des prions de levure, telles que : combien de protéines peut-il transmettre illicitement de ce type. Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez cribler de nombreuses protéines et voies de manière impartiale.

Commencez cette procédure en cultivant les cellules de levure appropriées dans une plaque à 96 puits à 30 degrés Celsius, comme décrit dans le protocole de texte. Inspectez visuellement les cultures pour confirmer qu’elles sont saturées, les cellules doivent être visibles à l’œil nu, au fond de chaque puits. À l’aide d’un robot de manipulation de liquides, préparez des plaques de 384 puits, contenant 45 microlitres du milieu approprié par puits.

Tout d’abord, distribuez Scal-URA dans les puits d’une plaque de 384 puits. Ensuite, distribuez Scal-URA plus le facteur de stress d’intérêt dans les puits d’une deuxième plaque, 20 millimolaires de chlorure de manganèse sont utilisés comme facteur de stress dans cette expérience. Troisièmement, distribuez le SD-URA, qui n’induira pas l’expression du plasmide, ainsi que le chlorure de manganèse dans une autre plaque.

Abaissez la plaque de 96 puits contenant les cultures sur le robot de manipulation de liquide et inoculez un à quatre réseaux d’un à quatre microlitres de chaque puits de la plaque de 96 puits, dans quatre puits distincts de chaque plaque de 384 puits remplis d’un milieu différent. Placez immédiatement les plaques avec les cellules sur un empileur de microplaques à température ambiante et au dioxyde de carbone atmosphérique. Réglez le protocole pour une boucle continue de 72 heures, en mesurant la densité optique à 600 nanomètres avec le lecteur de microplaques.

Après les mesures de croissance, transférez un microlitre par puits des cultures induites par SCal-URA qui ont connu une surexpression des protéines vers de nouvelles plaques à 384 puits, contenant 45 microlitres par puits de milieu ST-URA qui ne permet pas l’expression protéique du plasmide. En parallèle, effectuer des inoculations analogues d’un deuxième ensemble de 384 plaques de puits contenant 45 microlitres par puits de ST-URA à partir des cultures qui ont été cultivées dans ST-URA en présence du facteur de stress. Placez les plaques dans une chambre humidifiée et faites pousser les plaques pendant 48 heures à 30 degrés Celsius jusqu’à saturation.

Après 48 heures, utilisez les plaques pour réinoculer un microlitre par puits dans des plaques de 384 puits contenant 45 microlitres par puits de ST-URA. Ensuite, effectuez une réinoculation séparée d’un microlitre par puits à partir de la même plaque source dans une plaque distincte de 384 puits contenant 45 microlitres par puits de ST-URA avec le facteur de stress. Placez immédiatement les plaques avec les cellules du microempileur à température ambiante et au dioxyde de carbone atmosphérique et réglez le protocole pour une boucle continue de 48 heures, en mesurant la densité optique à 600 nanomètres avec un lecteur de microplaques.

Une fois les mesures de croissance terminées, utilisez le logiciel de lecture de plaques pour exporter le temps en fonction de la densité optique à 600 nanomètres sous forme de table XY. Regroupez les colonnes des mesures de densité optique pour chaque répétition biologique et calculez la moyenne. Créez un graphique XY du temps en fonction de la densité optique à 600 nanomètres pour générer des courbes de croissance.

Pour les cultures qui ont choisi des différences de croissance significatives en réponse à un facteur de stress donné, dépendant de la surexpression des protéines ancestrales, prélever un microlitre de chaque réplication biologique, diluer dans 10 millilitres d’eau, puis déposer 50 microlitres sur des plaques contenant du 5-FOA. Cultivez à 30 degrés Celsius pendant trois jours. Si cela se traduit par un trop grand nombre ou un nombre insuffisant de colonies par plaque, ajustez le facteur de dilution en conséquence.

L’idéal est de 100 à 200 colonies par plaque. Choisissez de huit à 32 colonies simples avec des cure-dents autoclave et épinglez-les sur des plaques de 96 puits contenant 150 microlitres de SDCSM par puits. Placez les plaques dans une chambre humidifiée et faites-les croître jusqu’à saturation pendant 48 à 72 heures à 30 degrés Celsius.

Utilisez ces cultures pour inoculer deux nouveaux ensembles de plaques de 96 puits contenant 150 microlitres par puits de SDCSM, avec et sans le facteur de stress. Placez les plaques sur un empileur de microplaques et réglez le protocole pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres sur une boucle continue de 48 heures. Après 48 heures, analysez les données comme indiqué précédemment et confirmez que les différences de croissance significatives observées précédemment sont maintenues après la perte de plasmide.

Les cellules qui maintiennent les phénotypes induits sont ensuite testées pour les caractéristiques classiques de l’hérédité basée sur les protéines, comme décrit dans le protocole textuel. Ce criblage de l’hérédité basé sur les protéines a révélé la surexpression transitoire du cadre de lecture ouvert PSP1, entraîne une résistance au chlorure de manganèse qui a été maintenue pendant des centaines de générations dans les cellules, longtemps après la fin de la surexpression. Les algorithmes de prédiction des prions ont noté que l’extrémité terminale de PSP1 était modérément semblable à celle des prions.

En revanche, les algorithmes n’ont prédit pratiquement aucune caractéristique significative de séquence de type Prion de la plupart des protéines inductrices récupérées à l’écran, comme le montre cette analyse représentative. Les mesures de croissance des souches et du SDCSM avec du chlorure de manganèse, normalisées à un témoin PSP1 moins naïf correspondant, ont indiqué que l’inhibition de la désagrégation de HSP104 n’altère pas la résistance au chlorure de manganèse dépendant de PSP1, tandis que l’élimination du chaperon HSP70 et du gène PSP1 élimine héréditairement ce phénotype. Toutes les spores provenant de tétrades simples de croisements entre souches, hébergeant l’état phénotypique dépendant de la PSP1 et des souches naïves, présentent une résistance au chlorure de manganèse, indiquant une hérédité non mendélienne du phénotype.

Une comparaison de l’infectiosité pour la transformation protéique entre les lysats fictifs et les lysats PSP1 hébergeant des lysats en tant que matériel transmissible, a montré que plus de 53 % des cellules naïves transformées avec PSP1 ensemencée ont reçu le phénotype de résistance au chlorure de manganèse correspondant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines, y compris les étapes d’incubation et la préparation de la plupart des étapes de criblage peut se faire en moins de deux heures par jour, même avec un grand nombre de plaques. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de planifier exactement ce que vous voulez tester à l’avance et de garder à l’esprit l’ampleur de l’expérience.

Maintenant, c’est particulièrement important pour les débutants de la technique. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes similaires à celles décrites dans le protocole textuel peuvent être mises en œuvre pour déterminer si les phénotypes observés lors du criblage présentent un véritable modèle de transmission semblable à celui des prions. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique pour explorer l’étendue de la biologie des prions dans le service de sacralis CI.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir un criblage à haut débit pour de nouvelles formes d’hérédité à base de protéines chez la levure, de manière à la fois impartiale et ciblée.

N’oubliez pas que certains facteurs de stress chimiques tels que les agents endommageant l’ADN peuvent être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d’un équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.