Name: Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Découvrez un criblage à haut débit pour identifier les protéines induisant une mémoire phénotypique durable chez S. cerevisiae. Cette méthode permet d'étudier l'héritage protéique de manière non biaisée.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She et Susan Lindquist ont aidé à développer les dosages utilisés dans ce document, ainsi que les réviseurs pour leurs commentaires judicieux.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+high+efficiency+transformation+of+intact+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells.</a> Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).</li>
<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les premiers prions de levure ont été identifiées par leurs phénotypes inhabituelles et modèles déconcertants de l’héritage. Les caractéristiques de ces prions ont ensuite servis à construire des algorithmes et des outils informatiques pour dépister les protéines prions supplémentaires. La méthode décrite ici, en revanche, est expérimentale et s’appuie sur la surexpression transitoire pour créer une écurie durable de changement-a état codé dans la conformation des protéines. Toutefois, si l’efficacité du « ensemencement ...

Les systèmes biologiques expérience fréquemment des fluctuations transitoires dans l’abondance de la protéine. Ne sait pas si ceux-ci ont un impact durable dans l’élaboration du phénotype d’un organisme ou des générations futures. Les instances plus connus de cette biologie impliquent une classe rare des protéines prions, qui entraînent l’apparition de caractères héréditaires sans modification du génome. Au lieu de cela, ces particules de fectious proteinaceous et entransmettent les phénotypes via des changements qui se perpétues à la conformation de protéine1,2. Ce type d’héritage a été découvert comme étant la cause des modèles héritage inhabituelle d’une maladie neurodégénérative. Toutefois, des études dans les organismes allant des champignons aux mammifères3,4,5,6,7,8,9,10 ont révélé depuis que le prion comme éléments peuvent conférer la valeur adaptative. Néanmoins, les prions ont été considérées comme une fascinante mais rare curiosité biologique.
Cette sagesse qui prévaut est tenue en partie parce que la caractérisation de l’héritage à base de protéines a longtemps été limitée par un petit ensemble d’exemples. Les efforts récents de dépistage systématique ont élargi cette photo significativement en identifiant plusieurs nouveaux bona fide prions11 et protéines de près de deux douzaines de domaines12 avec la capacité de conversion conformationnelle de prion comme carburant. Cependant, puisque ces approches portent généralement sur des préjugés séquence des acides aminés, les prions qui ont été découverts partagent les propriétés biochimiques de la fondatrice levure prions [PSI+]13,14, [URE3]15et [RNQ+]11,16. Ceux-ci incluent : domaines 1) modulaires qui sont riches en longs polymères s’étend de l’asparagine (N) et de la glutamine (Q), ensemble 2) dans un amyloïde [PRION+] conformation17,18,19et 3) complet dépendance disaggregase Hsp104 fonction de multiplication fidèle de mère en fille13,20,21. En effet, nombreux bona fide prions, y compris [GAR+], [Het-s] et même l’origine prion (PrP-Sc), qui serait incomprise en vertu de ces critères stricts. Peut-être plus important encore, ils seraient incapables de capturer tout nouveaux mécanismes d’héritage à base de protéines,22. Ainsi, la vraie largeur biologique de ces phénomènes peut être beaucoup plus courante dans la nature que prévu.
Pour étudier cette question, a été employée une stratégie haut-débit, à l’échelle du protéome. Une caractéristique des prions tous, y compris les PrPSc, [GAR+], et [Het-s], est que la surexpression transitoire des causalité protéines augmente fortement le taux de prion acquisition15,23,24,25,26. Nous avons profité de cette fonctionnalité de systématiquement demander, sur l’ensemble de la levure ORFeome, si des États stables basées sur les protéines, épigénétiques pourraient être initiées par transitoirement induire la surexpression de protéines individuelles. Il est bien connu que la surexpression de protéines peut altérer les phénotypes27. Toutefois, la protéine prion est inhabituelle car leur surproduction temporaire produit un changement dans le phénotype c’est héréditaire pour plusieurs centaines de générations après la surexpression initiale. Nous avons déjà pris parti de cette fonctionnalité, ainsi que les patrons de succession inhabituelle d’éléments génétiques basées sur les protéines, à identifier des dizaines de protéines capables de duplications recâblage paysages phénotypiques sans altérer le génome28. Bien que certains ont identifié les protéines étaient anciennement prions, la plupart n’étaient pas, soulignant la puissance de cette approche pour découvrir de nouvelles formes d’héritage à base de protéines.

<table><tbody><tr><td>Chlorhydrate de guanidine</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse</td> chimique <td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Bromure</td></tr><tr><td>d’éthidium</td><td>chimique Sigma</td><td>E1510</td><td>Acide</td></tr><tr><td>5-fluoroorotique</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Chimique</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta ; 1 leu2 et Delta ; 0 LYS2 met15&Delta ; 0 ura3 et Delta ; 0)</td><td>Winston et al., 1995 ; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A Souche</td> de <td>levure</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha ; (his3&Delta ; 1 leu2 et Delta ; 0 lys2 et Delta ; 0 MET15 ura3&Delta ; 0)</td><td>Winston et al., 1995 ; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Souche de levure</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp ;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>Plasmide</td></tr><tr><td>FLEXGene library</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Bibliothèque de plasmides</td></tr><tr><td>Dextrose (glucose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Composant du milieu</td></tr><tr><td>peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Composant du milieu</td></tr><tr><td>bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Composant du milieu</td></tr><tr><td>glycérol</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Composant du milieu</td></tr> base <tr><td>d’azote de levure sans acides aminés</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Composant du milieu</td></tr><tr><td>agar</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Adénine</td><td>sulfate Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Composant multimédia</td></tr><tr><td>RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>DNase biotinylée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>zymolyase 100T (enzyme lytique de levure)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Équipement</td></tr><tr><td>Empileur de microplaques</td><td>BioTek BioStack3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement Plaque remplisseuse</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td></td></tr><tr><td>Équipement Robot de manipulation de liquides</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Le codage de l’information biologique qui est accessible aux générations futures est généralement réalisé par l’intermédiaire de modifications apportées à la séquence d’ADN. Longévifs héritage codé en protéine conformation (au lieu de séquence) a longtemps été considéré comme paradigme, mais rares. Les exemples les mieux caractérisées de tels éléments épigénétiques sont des prions, qui possèdent un comportement auto-assemblage qui permet de piloter la manifestation héréditaire de nouveaux phénotypes. Prions archétypales beaucoup affichent un biais de séquence riche en N/Q frappant et assemblent dans un giron amyloïde. Ces caractéristiques inhabituelles ont informé la plupart des efforts dépistage pour identifier de nouvelles protéines prion. Cependant, au moins trois prions connues (y compris le prion fondateur, PrPSc) héberger pas ces caractéristiques biochimiques. Nous avons donc mis au point une autre méthode pour sonder l’étendue de l’héritage à base de protéines basé sur un terrain d’action de masse : la passagère surexpression de la protéine prion augmente la fréquence à laquelle ils acquièrent une conformation self-création de modèles. Cet article décrit une méthode pour analyser la capacité de la levure ORFeome pour susciter l’héritage à base de protéines. En utilisant cette stratégie, nous avons constaté précédemment que &gt; 1 % des protéines de levure pourrait alimenter l’émergence des traits biologiques qui étaient à long terme, stable et se pose plus fréquemment que la mutation génétique. Cette approche pouvant servir au haut débit à travers toute ORFeomes ou comme un paradigme de dépistage ciblé pour réseaux génétiques spécifiques ou des stimuli environnementaux. A l’instar des écrans génétiques avant définissent de nombreuses voies de signalisation et de développement, ces techniques offrent une méthodologie pour étudier l’influence de l’héritage basées sur les protéines dans les processus biologiques.

On sait que la surexpression protéique modifie considérablement les phénotypes cellulaires27. En effet, grâce à une approche de criblage initial, des centaines de nouveaux phénotypes ont été récupérés de manière reproductible par la surexpression de clones provenant de l'ORFeome de levure, en utilisant seulement dix agents de stress. Toutefois, les tests décrits ci-dessus permettent d'évaluer si les cellules conservent des phénotypes stables à long terme après cett...

Ce protocole décrit une méthode de haut-débit pour dépister fonctionnellement héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae.

Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

L'objectif général de ce phénotypage haut débit de levure est de rechercher des protéines capables d'induire une mémoire phénotypique durable suite à une expression transitoire, servant ainsi de modèle pour l'héritage de type protéique. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine des prions de levure, notamment : combien de protéines sont capables d'induire un tel héritage ? Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'analyser un grand nombre de protéines et de voies métaboliques de manière impartiale.Commencez cette procédure en cultivant les cellules de levure appropriées dans une plaque de 96 puits à 30 degrés Celsius, comme décrit dans le protocole écrit. Inspectez visuellement les cultures pour confirmer qu'elles sont saturées : les cellules doivent être visibles à l'œil nu au fond de chaque puits. Utilisez un robot de manipulation de liquides pour préparer des plaques de 384 puits, contenant 45 µL de milieu approprié par puits.Commencez par distribuer Scal-URA dans les puits d'une plaque de 384 puits. Ensuite, distribuez Scal-URA ainsi que le facteur de stress d'intérêt dans les puits d'une deuxième plaque ; dans cette expérience, 20 millimolaire de chlorure de manganèse est utilisé comme facteur de stress. Troisièmement, distribuez SD-URA, qui n'induira pas l'expression du plasmide, ainsi que le chlorure de manganèse dans une autre plaque.Abaissez la plaque de 96 puits contenant les cultures sur le robot de manipulation des liquides et inoculez un volume de un microlitre de chaque puits de la plaque de 96 puits, selon un motif de un à quatre, dans quatre puits distincts de chaque plaque de 384 puits remplie d'un milieu différent. Placez immédiatement les plaques contenant les cellules sur un empileur de microplaques à température ambiante et sous atmosphère de dioxyde de carbone. Configurez le protocole pour une boucle continue de 72 heures, mesurant la densité optique à 600 nanomètres à l’aide du lecteur de microplaques.Après les mesures de croissance, transférez un microlitre par puits des cultures induites SCal-URA ayant subi une surexpression protéique vers de nouvelles plaques 384 puits contenant 45 microlitres par puits de milieu ST-URA, qui n'autorise pas l'expression protéique du plasmide. Parallèlement, effectuez des inoculations analogues sur un second jeu de plaques 384 puits contenant 45 microlitres par puits de ST-URA, à partir des cultures ayant été cultivées dans ST-URA en présence de l'agent de stress. Placez les plaques dans une chambre humidifiée et incubez-les pendant 48 heures à 30 degrés Celsius jusqu'à saturation.Après 48 heures, utilisez les plaques pour réinoculer un microlitre par puits dans des plaques de 384 puits contenant 45 microlitres par puits de ST-URA. Ensuite, effectuez un réinoculation séparée d'un microlitre par puits à partir de la même plaque source dans une autre plaque de 384 puits contenant 45 microlitres par puits de ST-URA avec l'agent de stress. Placez immédiatement les plaques contenant les cellules sur le micro-empileur à température ambiante et en présence de dioxyde de carbone atmosphérique, puis configurez le protocole pour une boucle continue de 48 heures, en mesurant la densité optique à 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques.Lorsque les mesures de croissance sont terminées, utilisez le logiciel du lecteur de plaque pour exporter les mesures de temps par rapport à la densité optique à 600 nanomètres sous forme d'un tableau XY. Regroupez les colonnes des mesures de densité optique pour chaque réplicat biologique et calculez la moyenne. Créez un graphique XY du temps par rapport à la densité optique à 600 nanomètres afin de générer des courbes de croissance.Pour les cultures ayant présenté des différences de croissance significatives en réponse à un stress donné, selon la surexpression protéique ancestrale, prélever un microlitre à partir de chaque réplicat biologique, diluer dans 10 millilitres d'eau, puis ensemencer 50 microlitres sur des boîtes contenant du 5-FOA. Incuber à 30 degrés Celsius pendant trois jours. Si cela donne trop ou trop peu de colonies par boîte, ajuster le facteur de dilution en conséquence.100 à 200 colonies par plaque est idéal. Prélevez huit à 32 colonies isolées à l’aide de pics en bois stérilisés au moyen d’un autoclave et transférez-les dans des plaques 96 puits contenant 150 microlitres de SDCSM par puits. Placez les plaques dans une enceinte humidifiée et incubez jusqu’à saturation pendant 48 à 72 heures à 30 degrés celsius.Utilisez ces cultures pour ensemencer deux nouveaux jeux de plaques de 96 puits contenant chacun 150 microlitres de SDCSM par puits, avec et sans l'agent de stress. Placez les plaques sur un empileur de microplaques et réglez le protocole pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres selon une boucle continue de 48 heures. Après 48 heures, analysez les données comme indiqué précédemment et confirmez que les différences de croissance significatives observées auparavant persistent après la perte du plasmide.Les cellules conservant les phénotypes induits sont ensuite testées pour détecter les critères classiques de l’héritage de type protéique, comme décrit dans le protocole textuel. Cet écran d’héritage protéique a révélé qu’une surexpression transitoire du cadre de lecture ouvert PSP1 induit une résistance au chlorure de manganèse, maintenue pendant des centaines de générations cellulaires, longtemps après l’arrêt de la surexpression. Des algorithmes de prédiction de prions ont attribué au terminus C-terminal de PSP1 un score modérément proche de celui des prions.En revanche, les algorithmes ont prédit pratiquement aucune caractéristique de séquence de type prion significative parmi la plupart des protéines inductrices récupérées lors de l'analyse, comme le montre cette analyse représentative. Les mesures de croissance des souches et du SDCSM en présence de chlorure de manganèse, normalisées à un contrôle PSP1 naïf moins PSP1 correspondant, ont indiqué que l'inhibition de la désagrégase HSP104 n'altère pas la résistance au chlorure de manganèse dépendante de PSP1, tandis que la suppression de la chaperonne HSP70 et du gène PSP1 élimine de façon héréditaire ce phénotype. Toutes les spores provenant de tétrades individuelles issues de croisements entre des souches présentant l'état phénotypique dépendant de PSP1 et des souches naïves affichent une résistance au chlorure de manganèse, indiquant une hérédité non mendélienne du phénotype.Une comparaison de l'infectiosité pour la transformation protéique entre des lysats témoins et des lysats contenant PSP1 utilisés comme matériau transmissible a montré qu'au-delà de 53 % des cellules naïves transformées avec PSP1 inoculé ont acquis le phénotype de résistance au chlorure de manganèse correspondant. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques semaines, y compris les étapes d'incubation, et la préparation de la plupart des étapes de criblage peut être effectuée en moins de deux heures par jour, même avec un grand nombre de plaques. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de planifier précisément à l'avance ce que vous souhaitez tester et de garder à l'esprit l'échelle de l'expérience.Ceci est particulièrement important pour les débutants dans la technique. Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes, telles que celles décrites dans le protocole écrit, peuvent être réalisées afin de déterminer si les phénotypes observés lors du criblage présentent un véritable modèle d'héritage de type prion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'épigénétique pour explorer l'étendue de la biologie des prions dans *saccharis* service CI. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de concevoir un criblage à haut débit pour de nouvelles formes d'héritage fondé sur les protéines chez la levure, selon une approche aussi bien non biaisée que ciblée.N'oubliez pas que certains agents chimiques stressants, comme les agents endommageant l'ADN, peuvent être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port d'équipements de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

high-throughput-screening-for-protein-based-inheritance-s

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-protéines de fusion sont largement utilisés pour visualiser les organites par microscopie confocale. Cependant, le dépistage de mutations qui affectent la morphologie des organites exige généralement mutagenèse individuelle et prend du temps. Ici, nous démontrons une méthode pour intégrer simultanément organite-GFP marqueurs dans près de 5000 gènes non essentiels dans la levure.

Une méthode à haut débit pour étudier la morphologie globalement organite chez S. cerevisiae

Nous décrivons ici un écran surexpression plasmide...

Haut débit écran surexpression plasmide de levure

Nous avons développé complètes, impartiales échelle du génome écrans à comprendre gène-médicament et les interactions gènes-environnement. Méthodes de dépistage de ces collections de mutants sont présentées.

Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

En utilisant des puces à protéines contenant presque toute la S. cerevisiae protéome est sondé pour interrogatoire impartiale rapide de milliers d'interactions protéine-protéine en parallèle. Cette méthode peut être utilisée pour la molécule de protéine-petite, la modification post-traductionnelle, et d'autres dosages in à haut débit.

Sondage haute densité fonctionnels des puces à protéines pour détecter les interactions protéine-protéine

Les modèles de protéinopathie de levure sont des outils précieux pour évaluer la toxicité et l’agrégation des protéines impliquées dans la maladie. Nous présentons ici des méthodes de criblage des banques de variants de Hsp104 pour les suppresseurs de toxicité. Ce protocole pourrait être adapté pour dépister n’importe quelle bibliothèque de protéines à la recherche de suppresseurs de toxicité de toute protéine toxique chez la levure.

Isoler Potentiated Hsp104 Variantes utilisant de la levure Proteinopathy modèles

Nous présentons ici une méthode rentable pour définir les interactions chimico-génétiques chez les levures bourgeonnantes. L’approche s’appuie sur des techniques fondamentales de biologie moléculaire de la levure et est bien adaptée à l’interrogation mécaniste de petites et moyennes collections de produits chimiques et d’autres environnements de milieux.

Identification rapide des interactions chimiques génétiques dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Nous présentons un protocole détaillé pour construire et cribler des banques de mutants pour des campagnes d’évolution dirigée chez Saccharomyces cerevisiae.

Réalisé Evolution Méthode<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Library Création et dépistage

Cet article présente une méthode basée sur l’accouplement afin de faciliter le dépistage surexpression dans la levure de bière en utilisant une bibliothèque de plasmide rangés.

Criblage de surexpression axée sur l’accouplement chez la levure

Un goulot d’étranglement dans le cycle de «conception-construction-test» de l’ingénierie microbienne est la vitesse à laquelle nous pouvons effectuer des écrans fonctionnels de souches. Nous décrivons une méthode à haut débit pour le criblage des souches appliquée à des centaines à des milliers de cellules de levure par expérience qui utilise le séquençage à base d’ARN à base de gouttelettes.

Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

Ce travail décrit un protocole pour un dépistage génétique suppresseur multicopie chez Schizosaccharomyces pombe. Ce criblage utilise une bibliothèque plasmidique pangénomique pour identifier le(s) clone(s) suppresseur(s) d’un phénotype de perte de fonction associé à une souche mutante de requête. De nouveaux suppresseurs génétiques du mutant nul ell1 ont été identifiés à l’aide de ce criblage.

Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe

Ce protocole décrit les étapes essentielles pour mener des campagnes de sélection de présentation de surface de levure afin d’enrichir les variants protéiques se liant à un antigène d’intérêt.

Ingénierie des protéines par affichage de surface de levure

Découvrez un criblage à haut débit pour identifier les protéines induisant une mémoire phénotypique durable chez S. cerevisiae. Cette méthode permet d'étudier l'héritage protéique de manière non biaisée.

Criblage à haut débit pour l’héritage basées sur les protéines chez S. cerevisiae

Explorer plus de vidéos