Tirant des Nanotubes de la Membrane des vésicules unilamellaires géant

L’objectif global de cette méthodologie d’extraction de nanotubes est d’étudier quantitativement les interactions entre des protéines d’intérêt spécifiques et des membranes très courbes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de la biologie des membranes cellulaires, telles que l’endocytose et le trafic intracellulaire. Cette technique nous permet de quantifier directement comment les protéines se lient à des membranes courbes et les déforment réciproquement.

Initialement, cette méthode était utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques de base des membranes lipidiques. Récemment, il a été appliqué pour élucider des mécanismes importants dans les interactions entre les membranes protéiques, en particulier les membranes de mise en forme des protéines. Commencez par collecter les vésicules unilamellaires géantes directement à partir des fils de platine de la chambre d’électroformation.

Pour construire la chambre expérimentale, placez deux lamelles de verre rectangulaires espacées d’un millimètre sur une base métallique, en laissant des ouvertures le long des bords longs suffisamment grandes pour permettre à une pointe de micropipette en verre d’atteindre au moins le centre de la chambre. Remplissez à la fois la chambre expérimentale et une micropipette en verre avec cinq milligrammes par millilitre d’une solution de bêta-caséine très pure, en prenant soin d’éviter les bulles. Pendant que la chambre est passivée, montez-la sur un microscope optique centré au-dessus de l’objectif et insérez la pointe de la micropipette d’aspiration à travers l’ouverture le long du bord long jusqu’à ce que la pointe soit au-dessus de l’objectif.

Ajustez le niveau du réservoir d’eau de manière à ce que la pression d’aspiration soit proche de zéro et remplissez une micropipette d’injection avec la molécule d’intérêt dissoute dans un tampon expérimental à la concentration expérimentale appropriée. Montez la micropipette d’injection à l’intérieur d’un micromanipulateur et insérez la micropipette de l’autre côté de la chambre expérimentale. À la fin de l’incubation, retirez la solution de bêta-caséine de la chambre et rincez la chambre plusieurs fois avec un tampon expérimental.

Ensuite, ajoutez quelques microlitres de solution vésiculaire dans la chambre, suivis de quelques microlitres de billes enrobées de streptavidine, jusqu’à une concentration finale de 0,1 fois 10 puissance moins 3 % de billes par volume ou moins. Une fois que les vésicules et les billes se sont déposées au fond de la chambre, laissez le tampon expérimental s’évaporer pendant environ 15 minutes, après quoi les vésicules devraient visiblement onduler au microscope optique. Lorsque les vésicules sont suffisamment souples, aspirez les vésicules individuelles dans la micropipette jusqu’à ce que la longueur des membranes à l’intérieur de la pipette soit égale ou supérieure au rayon de la pipette.

Lorsqu’une langue d’aspiration de taille appropriée a été identifiée, scellez les bords ouverts de la chambre avec de l’huile minérale. Pour régler la position zéro de la pression d’aspiration, placez l’extrémité de la pipette d’aspiration près d’une perle et ajustez la hauteur du réservoir d’eau de manière à ce que la perle ne soit ni aspirée ni soufflée par la pipette. Le réglage de la hauteur de l’eau est essentiel pour contrôler la tension membranaire de la vésicule qui est aspirée par la micropipette.

Aspirez une vésicule et déplacez la micropipette vers le haut et hors foyer sans casser la micropipette. À l’aide d’une pince à épiler, piégez une bille à environ 20 micromètres du fond de la chambre. Remettez la vésicule au point en l’éloignant de la perle et alignée avec le piège optique, et enregistrez le mouvement de la perle pendant une à deux minutes pour mesurer la position d’équilibre.

Réduisez autant que possible la pression à l’intérieur de la micropipette sans perdre la vésicule pour diminuer la tension de la membrane, et mettez soigneusement la vésicule en contact avec la perle pendant environ une seconde pour établir les liaisons streptavidine-biotine. Ensuite, à l’aide d’un actionneur piézoélectrique, tirez doucement la vésicule vers l’arrière pour créer un nanotube. Augmentez la pression d’aspiration pour recréer la langue d’aspiration et alignez le tube dans l’axe de la pipette d’aspiration.

Faites la mise au point sur le tube et la vésicule et enregistrez le mouvement de la bille à une vitesse d’acquisition de 30 hertz et la hauteur du réservoir d’eau par rapport à la position zéro pendant quelques minutes sous microscopie à fond clair. Lorsque toutes les images ont été obtenues, enregistrez à nouveau le mouvement de la bille à différentes pressions d’aspiration et tensions membranaires. Pour injecter des protéines ou des molécules d’intérêt, approchez la micropipette d’injection du nanotube en prenant soin de ne pas perturber la bille du piège optique, et injectez doucement les protéines à un à deux pascals de pression.

Une fois que la liaison aux protéines s’est équilibrée, répétez les mesures par étapes en présence des protéines ajoutées, comme démontré pour la membrane nue. Les mesures de force et de rayon sur des nanotubes tirés de vésicules 100 % DOPC sont indépendantes, car la force est mesurée à partir du déplacement de la bille dans le piège optique et du rayon à partir de l’intensité de fluorescence, offrant deux façons de calculer la rigidité de flexion de la membrane. L’enrichissement relatif des protéines BAR ou des canaux potassiques sur les tubes membranaires au-dessus des vésicules sous-jacentes indique que les protéines sont plus susceptibles de se lier aux membranes incurvées.

En effet, la liaison de la protéine N-BAR endophiline A2 à la membrane réduit progressivement la force du tube jusqu’à zéro, indiquant la formation d’un échafaudage tridimensionnel qui maintient le tube stable. Après cette procédure, d’autres techniques peuvent être combinées pour répondre à des questions supplémentaires, par exemple, la microscopie à haute résolution pour détecter l’organisation des protéines sur les tubes membranaires ou le suivi des particules uniques pour mesurer la mobilité des protéines.