Confocale, imagerie du Neuropeptide Y-pHluorin : une Technique pour visualiser l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots murins et humains intacts

L'objectif général de ce dosage est de visualiser en temps réel l'exocytose des granules d'insuline dans des îlots pancréatiques intacts par microscopie confocale. Cette méthode permettra de répondre à des questions clés dans le domaine du diabète. Par exemple, quels facteurs régulent l'exocytose de l'insuline ?

Ceci est essentiel car la fusion des granules est l'événement le plus important dans la vie d'une cellule bêta. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons utiliser des îlots pancréatiques intacts et observer les événements de fusion dans des cellules au sein de leur environnement naturel. Madina Mahkmutova, étudiante au doctorat dans notre laboratoire, démontrera cette technique.

Commencer, dès l'arrivée des îlots pancréatiques, par les transférer dans des tubes Falcon de 50 millilitres et centrifuger la suspension d'îlots à 1 000 tours par minute pendant cinq minutes. Les îlots s'accumuleront au fond du tube ; transférer les îlots dans deux millilitres de milieu de culture CMRL dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres non traitées pour culture de tissus et les incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures avant l'infection virale. Après leur isolement, resuspendre environ l'équivalent de îlots pancréatiques de souris dans deux millilitres de milieu de culture CMRL et les transférer dans des boîtes de Pétri de 35 millimètres non destinées à la culture de tissus.

Incuber le tissu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures avant l'infection virale. Pour réaliser l'infection virale, ajouter de cinq à 10 microlitres de solution virale stock à chaque boîte de Pétri de 35 millimètres contenant des ilots humains ou murins dans deux millilitres de milieu de culture CMRL. Après une culture des ilots pendant 24 heures, aspirer le milieu et le remplacer par deux millilitres de milieu de culture CMRL sans virus.

Incubez les îlots pendant quatre à six jours, en renouvelant le milieu tous les trois jours. Préparez la solution extracellulaire en combinant les réactifs indiqués ici, puis stérilisez le tampon par filtration. Préparez le milieu de glucose basal à une concentration finale de trois millimolaire en glucose, en ajoutant 75 microlitres de solution mère de glucose à deux molaire à 50 millilitres de solution extracellulaire.

Ensuite, pour préparer un milieu hyperglycémique avec une concentration finale de glucose de 16 millimolaire, ajouter 400 microlitres de solution mère de glucose à 2 molaire à 50 millilitres de solution extracellulaire. Diluer tout stimulus supplémentaire dans la solution extracellulaire contenant 3 millimolaire de glucose. Avant de commencer une expérience, pré-traiter les lamelles avec 30 microlitres de solution de poly-d-lysine à 1 milligramme par millilitre et incuber pendant une heure.

Ensuite, rincez soigneusement les lamelles à l'eau. Au moins une heure avant l'expérience, transférez un groupe d'îlots dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant une solution extracellulaire avec trois millimolar de glucose. Conservez les îlots restants à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

30 minutes avant de commencer une expérience, fixez la lame couvre-objet à la chambre d'imagerie en utilisant de la graisse de silicone pour l'étanchéifier. Ensuite, fixez la chambre d'imagerie sur la plateforme d'imagerie. Puis, à l’aide d’une pipette, transférez de 20 à 30 îlots sur la zone de la lame couvre-objet traitée avec de la poly-d-lysine et laissez-les adhérer à la surface pendant 20 minutes.

Cette étape est cruciale pour la réussite de l'expérience et nous collectons environ 20 à 30 îlots dans moins de 10 microlitres de tampon, puis nous attendons 20 minutes. Il est important de ne pas laisser le couvre-objet sécher complètement, afin d'éviter d'endommager les îlots. Pendant que les îlots adhèrent au couvre-objet, préparez le système de perfusion en rinçant soigneusement celui-ci à l'eau.

Ensuite, ajoutez chaque solution dans un canal différent, selon ce tableau. Éliminez toutes les bulles du système en ouvrant chaque canal séparément et en laissant la solution s'écouler pendant quelques minutes. Vérifiez que l'écoulement est régulier et que les tubulures ne fuient pas.

Ensuite, raccordez le réchauffeur en ligne unique au tube de sortie de la perfusion et réglez la température du tampon en sortie à 37 degrés Celsius. Préparez ensuite la pompe d'aspiration. Raccordez les tubulures, allumez la pompe et assurez-vous que le liquide est bien aspiré.

Placer la plateforme d'imagerie avec les îlots sur la platine du microscope et la relier au système de perfusion et à la pompe d'aspiration. Ensuite, remplir délicatement la chambre d'imagerie avec la solution extracellulaire contenant trois millimolar de glucose. Pour réaliser l'imagerie confocale, localiser les îlots dans le champ du microscope à faible grossissement.

Une fois les îlots mis au point, passez à des objectifs de plus grand grossissement. Ouvrez le logiciel d'acquisition et activez le mode de balayage intégré. Sélectionnez l'imagerie xyzt, puis pour configurer les paramètres d'acquisition, activez le laser à argon et réglez-le à 30 %, puis sélectionnez la ligne laser de 488 nanomètres, en ajustant la puissance du laser à environ 50 % pour l'excitation du pHluorin.

Recueillir l'émission entre 505 et 555 nanomètres, en utilisant le spectre d'émission d'EGFP comme référence. Choisir une résolution de 512 par 512 pixels. Démarrer l'acquisition en appuyant sur le bouton « live » et ajuster les niveaux de gain.

Régler le début de la pile z en mettant au point sur le sommet de l'îlot et en choisissant « début », puis en se déplaçant jusqu'au dernier plan pouvant être mis au point et en sélectionnant « n ». Choisir une taille de pile z de cinq micromètres. Définir l'intervalle de temps pour l'acquisition de chaque pile z proche de 1,5 à 2 secondes et sélectionner l'option « acquérir jusqu'à l'arrêt » pour une imagerie continue.

Ensuite, appuyez sur le bouton de démarrage pour initialiser l'acquisition d'images. Reportez-vous au protocole écrit pour les protocoles de stimulation permettant d'induire l'exocytose des granules. À l'aide du scanner intégré, des images confocales de l'îlot sont acquises sous forme d'enregistrements en lapso-temporel en moins de deux secondes.

En outre, cette technique peut être combinée à des colorants permettant l'imagerie fonctionnelle, tels que les colorants de potentiel membranaire ou les colorants de calcium libre cytosolique. Afin de déterminer si la protéine NP Y-pHluorin constitue effectivement un outil adapté pour surveiller la dynamique des granules d'insuline, des îlots infectés ont été immunomarqués à l'aide d'anticorps dirigés contre la GFP pour la NP Y-pHluorin et contre les hormones des îlots, à savoir l'insuline, la somatostatine ou le glucagon. La majorité des cellules exprimant la NP Y-pHluorin étaient des cellules bêta, car elles exprimaient également l'insuline.

Seules quelques cellules alpha positives pour le glucagon ou cellules delta positives pour la somatostatine ont été marquées par la GFP. Importamment, dans les cellules infectées, la fusion NP Y co-localisait avec l'insuline. Cette figure démontre que le pHluorin est un capteur de pH efficace.

Étant donné que l'augmentation du pH intracellulaire à l'aide de 50 millimolaire de chlorure d'ammonium entraîne une hausse supérieure à 500 % de la fluorescence intracellulaire, lorsque le pH à l'intérieur du granule augmente suite à la fusion avec la membrane plasmique lors de l'ouverture du pore de fusion, les granules contenant la protéine NP Y-pHluorin deviennent visibles dans des conditions qui stimulent l'exocytose de l'insuline, telles qu'une dépolarisation membranaire induite par le chlorure de potassium. Grâce à l'imagerie confocale en temps réel de îlots infectés par NP Y-pHluorin, il est possible de visualiser des évènements sécrétoires individuels dans les cellules bêta au sein de îlots intacts.

Ces événements surviennent en réponse à une dépolarisation directe de la membrane induite par le chlorure de potassium ou par plusieurs autres stimuli physiologiques. À une concentration extracellulaire basale de glucose, on observe peu d'activité sécrétoire. Toutefois, la fusion des granules avec la membrane plasmique est déclenchée en réponse à une stimulation par une concentration élevée de glucose.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple pourquoi la fusion des granules se produit dans des régions spécifiques de la cellule. Depuis son développement, cette technique a été utilisée pour explorer le profil temporel de la sécrétion des granules d'insuline dans des populations de cellules bêta, dans les îlots humains.