In Vitro Caractérisation des propriétés électrophysiologiques des fibres afférentes du côlon chez le rat

L’objectif général de ce protocole est de démontrer la méthodologie pour les enregistrements électrophysiologiques des nerfs sensoriels du colorectum in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés in vitro sur le terrain telles que la contribution de la sensibilité des effrences périphériques externes à la correction de l’hyperalgésie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de distinguer le colorectum de la même manière que la distinction carotidienne est réalisée in vivo, chez l’animal ou chez les patients.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la localisation des ganglions et la dissection des nerfs sont relativement difficiles. Pour commencer cette procédure, exposez la cavité abdominale d’un rat profondément anesthésié en effectuant une incision médiane sur la paroi abdominale à l’aide d’un scalpel. Ensuite, écartez le mésentère et les autres tissus pour exposer le colorectum.

Ensuite, placez l’animal sous le microscope à dissection. Grâce à une dissection soigneuse, localisez le ganglion pelvien gauche et identifiez les nerfs pelviens et les nerfs splanchniques lombaires qui le rejoignent. Par la suite, coupez ces nerfs à quelques millimètres du ganglion pelvien.

La localisation du ganglion pelvien et la dissection des nerfs sont les étapes les plus critiques et les plus difficiles de cette procédure. Ensuite, coupez l’os de la symphyse pour exposer le rectum. Retirez les tissus au-dessus du colorectum et veillez à laisser le ganglion pelvien intact.

Après avoir sacrifié le rat par injection intraveineuse d’une surdose de pentobarbital, transectez le côlon à environ trois centimètres au-dessus du ganglion pelvien et retirez le colorectum de l’animal à l’aide d’une pince. Par la suite, transférez le colorectum dans une boîte de Pétri remplie de solution de Krebs pré-refroidie. Retirez les matières fécales en rinçant doucement le côlon.

Ensuite, retirez soigneusement le vessie restante et les autres tissus, sans compromettre le ganglion pelvien. Dans cette procédure, placez le côlon dans une chambre d’enregistrement et abondez le tissu en continu avec une solution de Krebs carbogéné. Ensuite, canulez le colorectum aux extrémités buccale et anale, puis commencez la perfusion intraluminale du côlon avec une solution saline dans le sens oral à anal, après cela, localisez le ganglion pelvien majeur sous le microscope de dissection et utilisez des épingles à insectes pour exposer le ganglion.

Avec une dissection soigneuse, trouvez une fine branche de nerf émanant du ganglion et allant vers le côlon, puis, coupez le nerf près du ganglion. Avant l’étape suivante, allumez le bain chauffant et maintenez la solution de Krebs à 34 degrés Celsius. Maintenant, inspectez une pipette en verre pré-tirée sous le microscope à dissection.

Cassez l’extrémité de l’électrode à l’aide d’une paire de pinces pour qu’elle soit d’une taille compatible avec le diamètre du nerf à enregistrer. Ensuite, biseautez la pointe en la plaçant près d’un évasement plus léger. Les nouveaux dans cette méthodologie peuvent également trouver difficile de biseauter l’extrémité de l’électrode en fonction de la taille du nerf.

Ensuite, placez l’électrode biseautée dans le porte-électrode, puis connectez une seringue de 10 millilitres à l’orifice latéral du support pour l’application d’une pression négative ou positive sur l’électrode. Après cela, connectez le support à l’étage de tête du bioamplificateur et montez l’étage de tête sur un manipulateur. Ensuite, déplacez l’électrode dans le bain de tissu et remplissez l’électrode avec la solution de Krebs en appliquant une légère aspiration jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec le fil d’argent du support.

Ensuite, placez la pointe de l’électrode près de l’extrémité coupée du nerf et appliquez une pression négative pour aspirer le nerf dans l’électrode. Ensuite, appliquez plus de pression négative, de sorte qu’environ un millimètre du nerf soit tiré dans l’électrode et forme un joint étanche. Maintenant, allumez le bioamplificateur et réglez le filtre sur 300 à trois mille hertz.

Surveillez le signal sur l’oscilloscope et enregistrez le signal nerveux et le signal de pression intraluminale dans le logiciel de traitement des données de pointe. Ensuite, appliquez une distension de rampe du côlon en fermant le robinet à trois voies sur la canule de sortie tout en perfusant continuellement par voie intraluminale. Surveillez la pression intraluminale jusqu’à ce qu’elle atteigne 60 millimètres de mercure, puis ouvrez le robinet à trois voies sur la canule de vidange.

Répétez cette procédure à intervalles réguliers de quinze minutes et appliquez des médicaments supplémentaires ou intraluminaux pour tester la sensibilité chimique des nerfs afférents. Voici l’illustration schématique du dispositif expérimental pour la préparation ex vivo du colorectum en tube avec un enregistrement représentatif d’un nerf distal au ganglion pelvien. Dans les préparations de rats normaux, les nerfs afférents du côlon ont généralement un faible niveau d’activité spontanée régulière.

La distension de rampe du côlon induit une augmentation progressive de la cadence de tir. La propriété mécanosensorielle de chaque nerf est représentée par le tracé de la courbe de réponse du nerf afférent de la pression intraluminale. Alternativement, l’enregistrement peut être effectué à partir d’une branche des nerfs pelviens proximale au ganglion pelvien.

Le profil de l’activité mécanosensorielle des nerfs pelviens proximaux est généralement similaire à celui observé dans le nerf distal du ganglion pelvien. L’analyse en composantes principales des formes d’onde des potentiels d’action de l’enregistrement multi-unités peut être effectuée pour discriminer l’activité d’une seule unité. Voici les formes d’onde superposées de deux afférens pelviens individuels.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’anatomie des principaux ganglions pelviens et des autres nerfs et être capable de localiser les ganglions pour disséquer les nerfs et enregistrer l’activité afférente. L’un des avantages de ce protocole est qu’il peut permettre de comparer les propriétés électrophysiologiques et les profils pharmacologiques des nerfs afférents pelviens et splanchnique.