Name: Un Guide pour la Production, la cristallisation et détermination de la Structure des IKK1 humaine/α (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Apprenez la production, la cristallisation et la détermination structurale de l'IKK1 humaine pour comprendre ses fonctions de signalisation et établir des plateformes de conception rationnelle de médicaments.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions le personnel de la 19ID de ces faisceaux, 24ID et 13ID à Advanced Photon Source, Lemont (Illinois), pour le soutien au cours de la collecte de données sur différents cristaux. Nous sommes reconnaissants à Dmitry Lyumkis, Salk Institute pour nous aller chercher la carte de cryo-EM basse résolution des stades précoces de EM carte/modèle de construction, qui a été utilisé pour construire le modèle initial de la recherche du remplacement moléculaire IKK1. La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de subventions de NIH AI064326, CA141722 et GM071862 à GG. SP est actuellement Wellcome Trust DBT Inde intermédiaire boursier.

<ol><li>Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+an+active+player+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology+research%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, an active player in human cancers.</a> Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).</li>
<li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+inflammation%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Immunity, inflammation, and cancer.</a> Cell. 140 (6), 883-899 (2010).</li>
<li>Ben-Neriah, Y., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+meets+cancer%2C+with+NF-kappaB+as+the+matchmaker%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker.</a> Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Karin, M., Ben-Neriah, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+meets+ubiquitination%3A+the+control+of+NF-%5Bkappa%5DB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity.</a> Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).</li>
<li>Ghosh, S., Karin, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11983155">Missing pieces in the NF-kappaB puzzle.</a> Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).</li>
<li>Sun, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22435551">The noncanonical NF-kappaB pathway.</a> Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).</li>
<li>Bonizzi, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+NF-kappaB+activation+pathways+and+their+role+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity.</a> Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).</li>
<li>DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytokine-responsive+IkappaB+kinase+that+activates+the+transcription+factor+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB.</a> Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).</li>
<li>Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+specificity+of+gene+expression+programs+determined+by+temporal+control+of+IKK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity.</a> Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).</li>
<li>Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+%28IKK%29+contains+two+kinase+subunits%2C+IKKalpha+and+IKKbeta%2C+necessary+for+IkappaB+phosphorylation+and+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.</a> Cell. 91 (2), 243-252 (1997).</li>
<li>Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK-gamma+is+an+essential+regulatory+subunit+of+the+IkappaB+kinase+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.</a> Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).</li>
<li>Yamaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+cloning+of+NEMO%2C+a+component+of+the+IkappaB+kinase+complex+essential+for+NF-kappaB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.</a> Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).</li>
<li>Li, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IKKbeta+subunit+of+IkappaB+kinase+%28IKK%29+is+essential+for+nuclear+factor+kappaB+activation+and+prevention+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis.</a> J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).</li>
<li>Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+principles+in+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Shared principles in NF-kappaB signaling.</a> Cell. 132 (3), 344-362 (2008).</li>
<li>Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+factor-kappaB+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity.</a> Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).</li>
<li>Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAFF-induced+NEMO-independent+processing+of+NF-kappa+B2+in+maturing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells.</a> Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).</li>
<li>Senftleben, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+IKKalpha+of+a+second%2C+evolutionary+conserved%2C+NF-kappa+B+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway.</a> Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).</li>
<li>Coope, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100+to+p52%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52.</a> EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).</li>
<li>Dejardin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymphotoxin-beta+receptor+induces+different+patterns+of+gene+expression+via+two+NF-kappaB+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways.</a> Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).</li>
<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
<li>Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+basally+translated+NF-kappaB-inducing+kinase+%28NIK%29+protein+functions+as+a+molecular+switch+of+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100.</a> J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+NF-kappaB+activation+requires+coordinated+assembly+of+a+regulatory+complex+of+the+adaptors+cIAP1%2C+cIAP2%2C+TRAF2+and+TRAF3+and+the+kinase+NIK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).</li>
<li>Vallabhapurapu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonredundant+and+complementary+functions+of+TRAF2+and+TRAF3+in+a+ubiquitination+cascade+that+activates+NIK-dependent+alternative+NF-kappaB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling.</a> Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).</li>
<li>Annunziata, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+engagement+of+the+classical+and+alternative+NF-kappaB+pathways+by+diverse+genetic+abnormalities+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).</li>
<li>Keats, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+mutations+activate+the+noncanonical+NF-kappaB+pathway+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma.</a> Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).</li>
<li>Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Oncogenic activation of NF-kappaB.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Hinz, M., Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IkappaB+kinase+complex+in+NF-kappaB+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond.</a> EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).</li>
<li>Scheidereit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaB+kinase+complexes%3A+gateways+to+NF-kappaB+activation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription.</a> Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).</li>
<li>Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+infectious+recombinant+baculoviruses+by+site-specific+transposon-mediated+insertion+of+foreign+genes+into+a+baculovirus+genome+propagated+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli.</a> J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+Activation+of+IKK1%2Falpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha.</a> Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).</li>
<li>Otwinowski, Z. aM., W, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+Diffraction+Data+Collected+in+Oscillation+Mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode.</a> Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+human+IkappaB+kinase+beta+asymmetric+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?he5368">Phaser crystallographic software.</a> Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Vagin, A. T., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?li5010">MOLREP: an automated program for molecular replacement.</a> J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Version+1.2+of+the+Crystallography+and+NMR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Version 1.2 of the Crystallography and NMR system.</a> Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).</li>
<li>Brunger, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+%26+NMR+system%3A+A+new+software+suite+for+macromolecular+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).</li>
<li>McRee, D. E. <a target="_blank" href="http://www.iucr.org/__data/assets/pdf_file/0010/8983/dem.pdf">XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview.</a> J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).</li>
<li>Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+biomolecular+crystallography+with+low-resolution+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data.</a> Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).</li>
<li>Polley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+basis+for+IkappaB+kinase+2+activation+via+oligomerization-dependent+trans+auto-phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation.</a> PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).</li>
<li>Christopher, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+2-amino-3%2C5-diarylbenzamide+inhibitors+of+IKK-alpha+and+IKK-beta+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+medicinal+chemistry+letters%22%5BJournal%5D)">The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases.</a> Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+crystallographic+model+and+data+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking crystallographic model and data quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Chen, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MolProbity%3A+all-atom+structure+validation+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Solution de production, la cristallisation et la structure de deux protéines IKK reliées Nous partons pour déterminer la structure cristalline du IKK1/α la notion qu’il serait un exercice relativement simple étant donné notre expérience avec la production de protéines IKK2/β, cristallisation et détermination de la structure. Cependant, nous avons été très surpris que ces deux protéines apparentées se sont comportés très différemment au sujet de la facilité de la cristallisation. Malgré les efforts de ...

Activités de transcriptionnelles de la famille NF-κB de facteurs de transcription dimère sont requises pour les fonctions cellulaires variées allant de l’inflammation et l’immunité à la survie et la mort. Ces activités sont strictement contrôlées dans les cellules et une perte du règlement conduit à diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes et du cancer1,2,3. En l’absence d’un stimulus, les activités de NF-κB restent inhibées par IκB (inhibiteur de - κB) protéines4. La phosphorylation des résidus Ser spécifiques sur les protéines IκB les marque pour l’ubiquitination et dégradation ultérieure proteasome ou traitement sélectif5. Deux kinases hautement homologues de Ser/Thr, IKK2/β et IKK1/α, agissent comme des régulateurs centrales des activités de NF-κB en effectuant ces phosphorylation événements6,7.
Interactions entre un ligand et un récepteur transduit un signal à travers une série de médiateurs conduisant à l’activation de facteurs de NF-κB. Le processus de signalisation NF-κB peuvent être classé en deux voies distinctes – canoniques et non canoniques (alternative)8. L’activité de l’IKK2/β régit principalement le NF-κB signalisation de la voie canonique qui est essentielle pour des réponses immunitaires innées et inflammatoires9. Une caractéristique particulière de cette voie est une activation rapide et de courte durée de l’IKK2/β10 au sein d’un complexe de IKK jusque-là biochimiquement indéterminé — présumé se compose de IKK1 et IKK2, mais aussi un volet réglementaire, NEMO (NF-κB Essential Modulator )11,12,13. Entre les deux sous-unités IKK catalytiques du complexe IKK, IKK2 est principalement responsable14 pour la phosphorylation des résidus spécifiques de prototypes IκBs (α, β - et γ-) lié au NF-κB et également une protéine IκB atypique, NF-κB1/p105, qui est un précurseur de la NF-κB p50 sous-unité5. La phosphorylation induit par ubiquitination et dégradation de proteasome de IκB (ou traitement des p105) conduit à la libération et l’activation d’un ensemble spécifique de NF-κB dimères15. Activité de NF-κB aberrante grâce à une fonction mal réglementée de l’IKK2 a été observée dans nombreux cancers, ainsi que dans des maladies auto-immunes2,3,16.
Contrairement à l’IKK2/β, activité de IKK1/α réglemente NF-κB, signalisation de la voie non canonique, qui est essentielle pour le développement et l’immunité. IKK1 phosphoryle des résidus spécifiques de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ, qui mène à son traitement et la génération de p52. La formation de p52:RelB transcriptionnellement actif hétérodimère initie une réponse lente et soutenue aux signaux du développement7,17,18,19,20. Fait intéressant, la génération de la p52 de facteur NF-κB central de cette voie est gravement dépendante sur un autre facteur,21,NF-κB induisant Kinase (NIK)22, mais pas sur IKK2 ou NEMO. Dans les cellules au repos, le niveau de NIK reste faible en raison de la dégradation constante de le dépendant du protéasome23,24,25. Lors de la stimulation des cellules par des ligands « non canoniques » et dans certaines cellules malignes, NIK devient stabilisé afin de recruter et d’activer IKK1 / α. les activités de Kinase de NIK et IKK1 sont essentielles pour le traitement efficace des p100 dans p527. IKK1 et NIK phosphorylent trois sérines (Ser866, 870 et 872) de NF-κB2/p100 sur son segment C-terminal IκBδ menant à son traitement et la génération de p52. Aberrante activation de la voie non canoniques a été impliquée dans nombreuses tumeurs malignes dont le myélome multiple26,27,28.
Plusieurs inhibiteurs hautement efficaces et spécifiques pour IKK2/β sont connus, même si aucun jusqu'à présent ont avéré pour être un médicament efficace. En revanche, les inhibiteurs α-IKK1/spécifiques sont rares. Cela peut s’expliquer en partie par notre manque d’informations structurales et biochimiques sur IKK1/α, ce qui limite notre compréhension de la base mécaniste de l’activation de NF-κB par IKK1 dans les cellules et design rationnel des médicaments. Les structures des IKK2/β nous a fourni un aperçu du mécanisme d’activation de l’IKK2/β29; Cependant, ces structures ne pourraient pas révéler comment différents stimuli en amont déclencher l’activation du IKK1/α ou IKK2/β pour réguler des ensembles distincts de NF-κB activités 30,31. Pour comprendre les bases mécanistiques qui sous-tendent la fonction signalisation distincte de IKK1/α et d’établir une plate-forme pour la conception rationnelle de médicaments, nous nous sommes concentrés sur la détermination de la structure de IKK1/α.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin n’est plus fabriqué, remplacé par Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III Milieu cellulaire d’insecte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>Cellules SF9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-IKK1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Précédemment vendu par Imgenex</td></tr><tr><td>anticorps anti-PentaHis</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitrocellulose peut également être utilisé</td></tr><tr><td>Agarose Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford réactif de dosage</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Composé A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK-inhibiteur XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Cadeau</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de dextran</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>Sulfate de dextran</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Certains d’entre eux sont nouveaux Cat # sur le catalogue SIGMA. Ce que nous avions était à l’origine de Fluka qui avait différents Cat #.</td></tr><tr>Écrans <td></td><td></td><td></td>de <td>cristallisation</td></tr><tr><td>Crystal Screen I et II (Crystal Screen HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion et PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 et PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 et SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Montures de cristal</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Synchrotron</td><td>La source de photons avancée (APS) au département américain de l’énergie' s Ligne</td><td>de faisceau 19</td> du Laboratoire national <td>d’Argonne ID La source de photons avancée (APS) au Département de l’énergie des États-Unis Le laboratoire national d’Argonne fournit des faisceaux de rayons X générés par des anneaux de stockage d’énergie ultra-brillants et à haute énergie pour la recherche dans presque toutes les disciplines scientifiques.</td></tr></tbody></table>

un guide pour la production, la cristallisation et détermination de la structure des ikk1 humaine/α

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Une classe de stimuli extracellulaires nécessite l’activation de IKK1/α pour induire la production d’une sous-unité de NF-κB, p52, grâce à la transformation de son précurseur p100. P52 fonctionne comme un homodimère ou un hétérodimère avec une autre sous-unité NF-κB, RelB. Ces dimères à son tour régulent l’expression de centaines de gènes impliqués dans l’inflammation, la survie des cellules et le cycle cellulaire. IKK1/α reste avant tout associé de l’IKK2/β et NEMO comme un complexe ternaire. Cependant, on observe aussi une petite piscine de celui-ci comme un complex(es) de faible poids moléculaire. On ne sait pas si l’activité de traitement p100 est déclenchée par l’activation de IKK1/α dans la plus grande ou la plus petite piscine complexe. L’activité constitutive de IKK1/α a été détectée dans plusieurs cancers et maladies inflammatoires. Pour comprendre le mécanisme d’activation de IKK1/α et permettre son utilisation comme cible de drogue, nous avons exprimé IKK1/α recombinant dans des systèmes hôte différent, comme e. coli, insecte et les cellules de mammifères. Nous avons réussi à exprimer IKK1/α soluble dans baculovirus infectés par des cellules d’insecte, obtenir des quantités de mg de protéine très pure, il cristallise en présence d’inhibiteurs et déterminer sa structure cristalline. Nous décrivons ici les étapes détaillées pour produire la protéine recombinante, sa cristallisation et sa détermination de structure cristalline aux rayons x.

Clonage et expression de différentes constructions de IKK1/α Pleine longueur qu'ikk1/α humain a été cloné dans le baculovirus expression vector pFastBacHTa au sein de ses sites de restriction EcoRI et NotI pour obtenir un N-terminale hexa-Histidine tag IKK1. La balise pourrait être supprimée par digestion protéasique TEV. Étant donné que pleine longueur IKK1/α contient des zones flexibles sur les deux extrémités, et régions souples rendent habituellement une protéine d...

IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) est une protéine kinase de Ser/Thr qui participe à une myriade d’activités cellulaires principalement grâce à l’activation de facteurs de transcription NF-κB. Nous décrivons ici les principales étapes nécessaires à la production et la détermination de structure cristalline de cette protéine.

Un Guide pour la Production, la cristallisation et détermination de la Structure des IKK1 humaine/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

L’objectif de cette procédure est de fournir des conseils pour la production, la cristallisation et la détermination structurelle de l’IKK1-alpha humain afin de comprendre la base mécaniste de sa fonction de signalisation et d’établir des plates-formes pour la conception rationnelle des médicaments. Cette méthode devrait aider les chercheurs à déterminer la structure de l’IKK1, qui fournirait des réponses aux questions clés dans le domaine de la signalisation immunitaire. Cette technique décrit un chemin rationalisé vers l’obtention de cristaux de protéines IKK, qui sont plutôt réfractaires à la cristallisation et de fournir diverses informations critiques pour surmonter les goulets d’étranglement dans la détermination des structures.En général, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal, parce que la génération de quantités milligrammes de protéines solubles et bien comportées, nécessite son expression dans les cellules d’insectes, et la cristallisation peut être faite dans seulement une fenêtre très étroite de conditions. La procédure de remplacement moléculaire utilisée pour déterminer la structure d’IKK1 peut également être très délicate, en particulier en raison d’un

a-guide-to-production-crystallization-structure-determination-human

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Structure basée sur la conception de médicaments joue un rôle important dans le développement de médicaments. La poursuite des cibles multiples en parallèle augmente considérablement les chances de succès pour la découverte de plomb. L'article qui suit met en évidence la façon dont le Centre de génomique structurelle Seattle pour maladies infectieuses utilise une approche multi-cible pour la détermination gène à la structure de la grippe A de sous-unité PB2.

Multi-cible approche de traitement parallèle pour Gene à la structure Détermination de la polymérase de l&#39;influenza PB2 Subunit

Structure cristalline des complexes protéine-ADN peuvent donner une idée fonction de la protéine, mécanisme, ainsi que la nature de l'interaction spécifique. Nous rapportons ici comment optimiser la durée, la séquence et extrémités de l'ADN double brin pour la co-cristallisation...

Itératif d&#39;optimisation des duplex d&#39;ADN pour la cristallisation des complexes ADN-SEQA

β protéines de membrane externe (OMP) remplissent de nombreuses fonctions au sein des membranes externes des bactéries à Gram négatif, des mitochondries et des chloroplastes. Ici, nous espérons pallier un goulot d’étranglement connu dans les études structurales en présentant des protocoles pour la production d’OMP à β-baril en quantités suffisantes pour la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou spectroscopie RMN.

De Constructs à cristaux - Vers Structure Détermination de β-cylindre externe protéines membranaires

Nous décrivons un cadre intégrant une analyse biochimique et computationnelle simple pour guider la caractérisation et la cristallisation de grands domaines de bobines enroulées. Ce cadre peut être adapté aux protéines globulaires ou étendu pour incorporer une variété de techniques à haut débit.

La combinaison humide et Techniques de laboratoire sec Guide pratique du Cristallisation de grandes superhélice contenant des protéines

La proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) est une métalloprotéase sécrétée et une cible médicamenteuse prometteuse de l’agent pathogène humain Clostridium difficile. Nous décrivons ici toutes les méthodes nécessaires à la production et à la détermination de la structure de cette protéine.

Production, Cristallisation et structure Détermination de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding et Zinc-SAD

Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.

Microcristallographie des cristaux de protéines et<em&gt; Dans Cellulo</em&gt; Diffraction

Nous présentons des approches pour la caractérisation biophysique et structurelle des glycoprotéines avec le pli de l’immunoglobuline par interférométrie biolayer, calorimétrie isotherme de titration et cristallographie aux rayons x.

Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Nous décrivons des protocoles pour la détermination de structure du domaine IKK-contraignant de NEMO par la cristallographie de rayon X. Les méthodes incluent l'expression, la purification et la caractérisation des protéines ainsi que des stratégies pour une optimisation réussie des cristaux et la détermination de la structure de la protéine sous sa forme non liée.

Détermination de la production, de la cristallisation et de la structure du domaine iKK-contraignant de NEMO

Le protocole décrit les méthodes expérimentales pour obtenir stable majeur complexe d’histocompatibilité (MHC) classe I grâce à des substitutions potentielles de β2-microglobuline (β2m) de différentes espèces. La comparaison structurale du MHC I stabilisée par des dommages homologues et β2m ont été étudiées.

Stabilité et structure du complexe histocompatibilité majeur de chauve-souris classe I avec β2-Microglobuline

Cet article présente une méthode pour générer des cristaux protéiques dérivés de l’I3C (acide 5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic) utilisant le microsédage pour générer de nouvelles conditions de cristallisation dans des écrans matriciels clairsemés. Les plateaux peuvent être mis en place à l’aide de robots de distribution liquide ou à la main.

Dérivation des cristaux protéiques avec I3C à l’aide du criblage aléatoire de matrice microséeed

Cette contribution décrit comment configurer la cristallisation des protéines sur des dispositifs cristaux sur cristaux et comment effectuer une collecte automatisée de données série à température ambiante à l’aide de la plate-forme de cristallisation sur puce.

Cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante

Apprenez la production, la cristallisation et la détermination structurale de l'IKK1 humaine pour comprendre ses fonctions de signalisation et établir des plateformes de conception rationnelle de médicaments.

Un Guide pour la Production, la cristallisation et détermination de la Structure des IKK1 humaine/α

Explorer plus de vidéos