Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

L’objectif global de cette procédure est de produire in vivo des monocultures d’astrocytes en utilisant une méthode simple, rapide et économique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’astroglibiologie, telles que l’économie de la libération physique ou de l’absorption des astrocytes. Le principal avantage de cette technique est que les cellules résultantes ressemblent étroitement aux astrocytes in vivo par la morphologie, l’expression de l’ARNm et des protéines, et les fluctuations intercellulaires du calcium.

Pour commencer cette procédure, préparez la zone de dissection en plaçant deux boîtes de Pétri de 10 cm remplies de milieu de dissection sur de la glace dans une hotte de dissection à flux laminaire. Pour chaque région du cerveau à isoler, préparez un tube de 15 mL rempli de 14 mL de milieu de dissection et conservez-le sur de la glace. Ensuite, vaporisez les outils de dissection avec de l’éthanol à 70 % et placez-les à côté du microscope de dissection dans le capot.

Si vous travaillez avec du tissu embryonnaire, retirez d’abord les embryons de l’utérus et ouvrez les sacs embryonnaires. Coupez immédiatement les têtes avec des ciseaux. Lorsque toutes les têtes sont coupées, transférez-les dans un milieu de dissection pré-refroidi.

Une fois que les têtes sont immergées dans le milieu, ouvrez la peau et le crâne avec une pince et pincez le cervelet. Ensuite, faites levier avec précaution le reste du cerveau vers le haut et hors du crâne. Après cela, séparez le cortex de la structure sous-jacente du cerveau moyen.

Placez la pince dans la fissure longitudinale entre les hémisphères et déplacez-les entre le cortex et les structures du cerveau moyen d’un hémisphère pour libérer chaque hémisphère. Par la suite, retirez toutes les méninges de chaque hémisphère et séparez l’hippocampe. Si les astrocytes de l’hippocampe sont nécessaires, transférez chaque hippocampe dans un tube de 15 ml rempli de 14 ml de milieu de dissection sur de la glace.

Après cela, coupez tout tissu cortical à utiliser pour générer des astrocytes en morceaux ne dépassant pas un millilitre cube. Ensuite, prélevez tous les morceaux de tissu cortical dans un tube séparé de 15 ml rempli de milieu de dissection sur de la glace. Une fois que tous les morceaux de tissu sont recueillis, attendez qu’ils se déposent au fond du tube.

Aspirez ensuite autant de fluide que possible. Ensuite, ajoutez 2 à 3 ml d’EDTA à 0,05 % et incubez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant vingt minutes. Ensuite, aspirez soigneusement l’EDTA tripsen en laissant des morceaux de tissu dans une quantité minimale de liquide au fond du tube.

Ensuite, ajoutez 5 ml de milieu de dissection pré-refroidi pour éliminer l’EDTA tripsen restant et pipetez sur le côté du tube supérieur pour obtenir le mélange des morceaux de tissu. Ensuite, aspirez le milieu de dissection et laissez les morceaux de tissu dans le moins de liquide possible. Répétez deux fois cette étape de lavage avec un milieu de dissection pré-refroidi.

Après la dernière étape de lavage, ajoutez 1 ml de D-Mem Plus à température ambiante et triturez le tissu en pipetant de haut en bas sans introduire de bulles. Les astrocytes sont assez sensibles au pH, il est donc important d’éviter de produire des bulles car cela peut modifier le pH de la solution. Ensuite, placez une crépine à cellules de 100 microns dans l’ouverture d’un tube de 50 ml et pré-mouillez le filtre avec 4,5 ml avec du D-Mem Plus pré-refroidi.

Pipetez 1 ml de suspension de tissu dissocié sur la crépine cellulaire et ajoutez 4,5 ml de D-Mem Plus pré-refroidi pour laver les cellules à travers celle-ci. Le septième jour in vitro après la dissection, placez les boîtes de 10 cm avec les cellules dans le D-Mem Plus sur un agitateur dans l’incubateur et secouez les boîtes à 110 tr/min pendant 6 heures. 20 à 30 minutes avant la fin des six heures d’agitation, préchauffez 1 XPBS, D-Mem Plus, NB+H et 0,25 % d’EDTA tripsen à 37 degrés dans le bain-marie.

Après 6 heures de secousse, retirez les plats de culture du shaker et remplacez immédiatement le milieu par 10 ml de 1 XPBS préchauffé par plat. Par la suite, retirer le PBS et ajouter 3 ml d’EDTA tripsen préchauffé par plat. Ensuite, incubez les échantillons pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius.

Si vous préparez des échantillons pour le Western Blot ou le séquençage de l’ARN, n’ajoutez pas d’EDTA de Tripsen. Au lieu de cela, remplacez le PBS par 12 ml de NB+H préchauffé, après quoi les cultures peuvent être remises dans l’incubateur. Ensuite, ajoutez 5 ml de D-Mem Plus préchauffé à 3 ml d’EDTA tripsen dans chaque plat.

Pipeter les cellules de la boîte et recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml. Après cela, centrifugez la suspension cellulaire à 3220 fois G à 20 degrés Celsius pendant 4 minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez en suspension le palais cellulaire dans 1 mL de NB+H préchauffé.

Ces images montrent que les astrocytes ausam transduits par G-camp présentent des événements spontanés d’ions calcium dans tous les réseaux d’astrocytes, y compris dans les processus minces. Ici, une onde ionique calcium se déplace à travers plusieurs astrocytes de gauche à droite dans les images de points temporels distincts, où la couleur claire représente les zones à forte concentration d’ions calcium et les zones noires représentent les régions extracellulaires. Dans ce graphique, la concentration en ions calcium change dans les régions codées en couleur au fil du temps, qui sont représentées par des traces d’intensité fluorescente G-camp, illustrant comment une onde de signalisation d’ions calcium se propage à travers plusieurs astrocytes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure et quinze minutes si elle est exécutée correctement. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’imagerie des cellules vivantes en combinaison avec des expériences de transfection ou de transduction virale peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les événements qui se produisent dans les membranes astrocytaires. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer in vivo des cultures motrices d’astrocytes de manière simple, rapide et économique.